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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Indução e diagnóstico de tumores em Published: July 25, 2017 doi: 10.3791/55901
Automatic Translation
1,2, 1
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

Summary

A análise do clone de mosaico no epitélio do disco imaginal de Drosophila é um sistema modelo poderoso para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Aqui descrevemos um protocolo para induzir tumores em discos imaginários da asa de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e introduzir um método de diagnóstico para classificar os fenótipos do tumor.

Abstract

Nos estágios iniciais do câncer, as células mutantes transformadas apresentam anormalidades citológicas, começam o excesso de crescimento descontrolado e interromperam progressivamente a organização do tecido. Drosophila melanogaster emergiu como um sistema modelo experimental popular em biologia do câncer para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Em particular, as ferramentas genéticas para discos imagólicos de Drosophila (desenvolvimento de epitélios em larvas) possibilitam a criação de células pro-tumorais transformadas dentro de um tecido epitelial normal, uma situação semelhante às etapas iniciais do câncer humano. Um estudo recente da tumorigênese em discos imaginários da asa de Drosophila , no entanto, mostrou que a iniciação do tumor depende da citoarquitetura do tecido intrínseco e do microambiente local, sugerindo que é importante considerar a susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos na avaliação de fenótipos tumorais em imaginações Discos. Para facilitar a análise fenotípica do tumor progressiEm discos imaginais, aqui descrevemos um protocolo para experiências genéticas usando o sistema GAL4-UAS para induzir tumores neoplásicos em discos imaginais de asa. Além disso, introduzimos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos das lesões clonais induzidas em epitélios imaginais, pois um método de classificação claro para discriminar vários estágios de progressão tumoral (como hiperplasia, displasia ou neoplasia) não havia sido descrito anteriormente. Esses métodos podem ser amplamente aplicáveis ​​à análise clonal de fenótipos tumorais em vários órgãos em Drosophila .

Introduction

Os tecidos epiteliais são sistemas altamente organizados que possuem a habilidade homeostática notável para manter sua organização através do desenvolvimento e do turnover celular. Este robusto sistema de auto-organização, no entanto, é progressivamente interrompido durante o desenvolvimento do tumor. No início do desenvolvimento do tumor, as células mutantes individuais decorrentes da ativação do oncogene ou da inativação do gene supressor de tumor emergem dentro de uma camada epitelial. Quando esta "célula pro-tumoral" transformada evade um ambiente supressivo, interrompe a organização epitelial e começa a proliferação descontrolada, a tumorigênese ocorre 1 . Durante as últimas décadas, os avanços tecnológicos notáveis ​​em genética e biologia molecular fizeram progressos notáveis ​​na pesquisa do câncer. Em particular, estudos recentes utilizando ferramentas de análise de mosaico genetico em Drosophila melanogaster , como o recombinante mitótico recombinante FLP-FRT (flipase recombinase / flippase recombinase)Os sistemas 2 e flip-out-GAL4-UAS (seqüência de ativação upstream) 3 contribuíram grandemente para uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos envolvidos na formação e metástase dos tumores 4 , 5 , 6 .

Estudos de um grupo de genes de supressores de tumores Drosophila conservados, larvas gigantes letais ( lgl ), discos grandes ( dlg ) e rabiscos ( scrib ), evidenciaram a relação crítica entre perda de organização epitelial e desenvolvimento tumoral, pois esses genes desempenham papéis fundamentais Na regulação da polaridade das células basais apical e da proliferação celular nos tecidos epiteliais 7 . Enquanto os discos imaginários de Drosophila são normalmente epitélios monocamadas, mutações homozigóticas em qualquer um desses três genes fazem com que as células perdam estrutura e polaridade, não conseguem diferenciarRentiate, overproliferate e, finalmente, formam massas amorfas multicamadas que se fundem com tecidos adjacentes 7 . Da mesma forma, a interrupção desses genes em mamíferos está envolvida no desenvolvimento de tumores malignos 8 , 9 . Os fenótipos neoplásicos exibidos pelos tecidos mutantes levaram à classificação desses três genes como genes supressores tumorais neoplásicos (nTSGs) 7 , 8 preservados. No entanto, quando as células mutantes nTSG homozigóticas são geradas esporadicamente no desenvolvimento de discos imaginais de tipo selvagem usando a recombinação mitótica mediada por FLP-FRT, as células mutantes são eliminadas do tecido através da apoptose dependente da quinase N-terminal N-terminal (JNK) 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusão 15 , 16 , ou engulfment e fagocitose por vizinhos 17 . Neste epitelio de mosaico genetico, a apoptose é principalmente detectada em células mutantes nTSG localizadas no limite do clone, sugerindo que as células normais adjacentes desencadeiam a apoptose de células mutantes nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Estudos recentes em células de mamíferos confirmaram que esta eliminação dependente da competição celular das células pro-tumorais é um mecanismo de autodefesa epitelial conservado evolutivamente contra o câncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Um estudo recente em discos imagólicos de Drosophila , no entanto, mostrou que os clones de nTSG-knockdown em mosaico induzem tumores neoplásicos em especificaçõesRegiões ic de discos ideais de asa 16 . A formação inicial do tumor sempre foi encontrada na região periférica da "dobradiça" e nunca observada na região central da "bolsa" do epitélio do disco de asa, sugerindo que o potencial tumorigênico das células nTSG-knockdown depende do ambiente local. A região da bolsa central funciona como uma "mancha fria do tumor" onde as células pró-tumorais não apresentam crescimento excessivo displásico, enquanto que a região da dobradiça periférica se comporta como um "ponto crítico do tumor" 16 . Nas regiões da bolsa "coldspot", as células nTSG-knockdown se delaminam do lado basal e sofrem apoptose. Em contraste, as células de dobradiça "hotspot" possuem uma rede de estruturas citoesqueléticas robustas em seus lados basais, as células de nTSG-knockdown se delaminam do lado apical do epitélio e iniciam o crescimento excessivo tumorigênico 16 . Portanto, a análise de fenótipos tumorais em discos imaginários exige consi cuidadoDerrame da susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos.

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a formação de tumor neoplásico nos discos imaginários da asa Drosophila utilizando o sistema GAL4-UAS- RNAi pelo qual as células nTSG-knockdown são geradas em epitélio de disco de asa normal. Embora esses sistemas experimentais sejam úteis para estudar os estágios iniciais do câncer, um método de classificação claro para avaliar os estágios da progressão tumoral no epitélio de disco imaginal não foi claramente descrito anteriormente. Portanto, também propomos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos clonais pro-tumorais induzidos no epitélio do disco de asa em três categorias: hiperplasia (acumulação de um número excessivo de células que aparecem normalmente com aumento da proliferação), displasia (tecido pré-maligno composto de aparência anormal Células) e neoplasia (tumor benigno ou maligno composto de células com aparência anormal e padrão de proliferação anormal).

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Protocol

1. Fly Crosses e Clone Induction

  1. Remova todas as moscas no frasco 12 h antes de coletar moscas virgens.
  2. Anestesiar as moscas dentro do recipiente através da injecção de gás de CO2 e voa lugar numa almofada de mosca de CO 2.
  3. Transfira 10 - 20 fêmeas virgens e 10 machos da almofada de mosca CO 2 para um frasco fresco e incubar durante 1 dia a 25 ° C.
  4. Transfira essas moscas para um frasco fresco e incube durante 12 h a 25 ° C.
    NOTA: Descarte o primeiro frasco para injectáveis, pois as fêmeas virgens não colocam ovos suficientes no primeiro dia.
  5. Para as linhas Enhancer-GAL4, remova as moscas adultas e incuba o frasco para injectáveis ​​a 25 ° C até a dissecção.
  6. Para indução de clones de mosaico por flip-out-GAL4, remova as moscas adultas e incuba o frasco para 2-4 dias a 25 ° C. O tempo de incubação antes do choque térmico depende do propósito experimental. Um choque térmico 2 dias após a deposição de ovos (AED) gera clones de mosaico em um segundo imaturoInstado imaginal epitélio. Um choque térmico após 3 ou 4 dias AED gera clones de mosaico em epitélio imaginal diferenciado de início a médio e terceiro instar.
    NOTA: É importante examinar o efeito do tempo de choque térmico alterado em fenótipos tumorigênicos.
  7. Para a indução de clones de mosaico por flip-out-GAL4, choque calor o frasco por imersão em um banho de água a 37 ° C durante 10 a 45 minutos seguido de incubação durante 2 a 3 dias a 25 ° C.
    NOTA: A informação do tempo de choque térmico, tempo e tempo de incubação em cada experiência é mostrada nas legendas da figura.

2. Dissecção de Larvas

  1. Colecione larvas errantes do terceiro estádio com uma vara de madeira ou fórceps sem corte, goteje-os por marcadores fluorescentes apropriados ( por exemplo , EGFP) sob um microscópio estereoscópico de fluorescência e coloque-os em uma placa de dissecação com PBS (solução salina tamponada com fosfato).
  2. Lave as larvas em PBS por pipetagem com pipetas de transferência de plástico de 2 mL.
  3. Aperte o centro da larva com uma pinça e rasgue o corpo pela metade com a outra pinça.
  4. Aperte o gancho da boca da metade anterior com uma pinça e empurre a boca em direção ao corpo com as outras fórceps para virar o corpo para dentro.
  5. Remova materiais desnecessários, como glândulas salivares ou corpos gordurosos com fórceps.

3. Fixação e coloração de anticorpos

  1. Transfira a metade anterior dissecada do corpo larval (incluindo os discos de asa imaginal) para um tubo de plástico de 1,5 mL e conserte em 1 mL de Solução Fix (4% de Formaldeído em PBS) durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com rotação suave.
    CUIDADO: O formaldeído é tóxico e possui potencial carcinogênico. Use luvas de proteção e roupas para evitar contato com a pele.
    NOTA: Nesta parte, todas as etapas ocorrem em um nutator à temperatura ambiente no escuro, salvo indicação em contrário.
  2. Remova a solução Fix e descarte. Lave os tecidos com 1 mL de PBT (0,3% de TritEm X-100 em PBS) três vezes por 15 min cada.
  3. Remova o PBT e adicione 1 mL de PBTG (0,2% de albumina de soro bovino e 5% de soro de cabra normal em PBT) para bloquear e introduzir 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  4. Remova o PBTG e adicione a solução primária de anticorpos adequadamente diluída com PBTG (ver Tabela de Materiais ) e nocaute durante a noite a 4 ° C.
  5. Remova a solução primária de anticorpos e lave os tecidos com 1 mL de PBT três vezes por 15 minutos cada.
  6. Remova PBT e adicione solução de anticorpo secundário adequadamente diluída com PBTG (1: 400). Nutate durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  7. Remova a solução secundária de anticorpos e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada.
  8. Para manchar a F-actina, remova PBT e adicione a solução de Phalloidin adequadamente diluída em PBS (1:40). Em seguida, mata por 20 min. Remova a solução de Faloidina e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada.
  9. Para contra-endurecer DNA nuclear, remova PBT e adicione solução DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole) (0,5 μg / mL de DAPI em PBS). Em seguida, entenda 10 min.
    CUIDADO: DAPI possui potencial carcinogênico. Use luvas de proteção e roupas para evitar contato com a pele.
  10. Remova a solução DAPI e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada.
  11. Lavar uma vez em 1 mL de PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  12. Remova PBS e adicione 500 μL de 100% de glicerol como meio de pré-montagem.

4. Montagem em lâminas de microscópio

  1. Coloque os tecidos coloridos em um slide de microscópio usando uma pipeta de transferência de plástico de 2 mL.
  2. Transfira os tecidos para gotas de meio de montagem em outro slide de microscópio com fórceps.
  3. Mantenha o fim do tecido dissecado com uma pinça e retire os discos antenais do cérebro e do olho com as outras fórceps.
    NOTA: Mantenha os cérebros dissecados para colocá-los perto dos discos imaginários da asa. Os cérebros atuam como uma plataforma que impede o lamínula de esmagar os discos imaginais da asa.
  4. Para isolar os discos imaginais da asa, mantenha pressionada a extremidade do tecido dissecado com uma pinça e raspe suavemente a parede do corpo e rasgue os discos com as outras fórceps.
    NOTA: Se é difícil encontrar discos imaginais da asa, descasque a traquea do lado posterior ao anterior. Os discos imaginários da asa mantêm a traquéia.
  5. Cubra suavemente os discos imaginais com uma lamínula e selar com esmalte de unhas; Armazenar a 4 ° C.

5. Microscopia confocal

  1. Para adquirir imagens confocais usando um microscópio confocal, configure os parâmetros de aquisição de imagem, incluindo a amplitude de onda de emissão, a intensidade do laser, o ganho, o deslocamento, a velocidade de digitalização e o tamanho da imagem 24 .
    NOTA: Para obter um procedimento detalhado de configurações de aquisição de imagem, consulte o manual de instruções fornecido por cada fabricante de microscópio.
  2. Para capturar um único coSeções nfocais de um disco imaginal inteiro da asa, use uma lente objetiva 20X.
  3. Adquira imagens tridimensionais por varredura de pilha z em tamanho de passo de 0,5 - 1,0 μm usando lentes 40X ou 60X.
    NOTA: Para analisar fenótipos celulares em alta resolução, o tamanho da imagem deve ser maior do que 512 x 512 pixels.

6. Análise de imagens usando ImageJ

  1. Use Fiji, um software ImageJ de código aberto focado na análise de imagens biológicas (https://fiji.sc/) 25 , para adquirir e analisar imagens confocadas de pilhas z.
  2. Para adquirir seções verticais, abra as imagens da pilha z no ImageJ e selecione o item de menu "Imagem / Pilhas / Reslice".
    NOTA: Ou o eixo XZ ou o eixo YZ podem ser selecionados no menu Reslice. A seção vertical pode ser obtida também em uma direção arbitrária, desenhando uma linha reta ou retângulo na imagem da pilha z.

7. Diagnóstico de fenótipos neoplásicos

  1. Abra a verticalSeções (eixo XZ ou YZ) obtidas a partir de um conjunto de imagens de pilhas z e analisam fenótipos morfológicos e coloração de anticorpos.
  2. Para o diagnóstico de fenótipos tumorais, concentre-se principalmente nos seguintes três pontos: (1) se uma massa celular, incluindo clones knockdown, se desvia da camada epitelial principal, (2) se a localização subcelular de proteínas juncionais é alterada nesta massa celular , E (3) se o diâmetro desta massa celular for maior do que 4 células.
  3. Categorize os fenótipos tumorais de acordo com o fluxograma descrito na Figura 1 .

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Representative Results

Para demonstrar a formação de tumores neoplásicos induzidos experimentalmente por NTSG-knockdown mediado por RNAi em discos imaginais de asa de Drosophila , foram utilizados três drivers GAL4 diferentes para expressar UAS-RNAi para lgl ou scrib : (1) sd-GAL4, que conduz a expressão forte de UAS no Bolsa de asa e expressão suave nas regiões de dobradiça ( Figura 2 e Figura 3A ); (2) upd-GAL4, que conduz em subdomínios da dobradiça, incluindo expressão forte em dois domínios da dobra medial dorsal, expressão leve em um domínio anterior-lateral e expressão fraca no domínio ventral-posterior ( Figura 2 e Figura 3C ); E (3) GAL4 induzido pelo choque térmico, que gera clones de mosaico aleatórios que expressam genes UAS ( Figura 4 e Fi5). Em todas as experiências, UAS-EGFP foi co-expresso com UAS-RNAi para marcar os clones knockdown.

Primeiro, o lng-RNAi criado por sd-GAL4 foi utilizado para induzir o desmantelamento de lgl na região da dobra da asa e das dobradiças. Nos discos de asa do terceiro instar de controle sem UAS-lgl-RNAi , não ocorreu alteração morfológica ( Figura 3A ). Em contraste, em discos de asa de terceiro instar que expressam lgl-RNAi , deformações epiteliais e sobrecrescentes tumorigênicos foram claramente observados em certas partes da dobradiça ( Figura 3B ). Na região da bolsa da asa, no entanto, o crescimento excessivo displásico não foi observado. A forte expressão de MMP1 (metaloprotease-1 da matriz) foi observada nas lesões das articulações tumorais, mas não na região da bolsa da asa ( Figura 3B ). Uma vez que a expressão de MMP1 está envolvida na degradação da membrana do porãoEs, é possível que estes tumores articulados tenham uma capacidade metastática ( Figura 3B ). Em seguida, a actualização GAL4 foi utilizada para induzir o deslocamento de lg na região dobradiça. Nos discos de asa do terceiro instar de controle sem UAS-lgl-RNAi , não ocorreram alterações morfológicas ( Figura 3C ). No entanto, após 5 dias de AED, discos de asa de terceiro instar com actualização-GAL4 e lgl-RNAi apresentaram desorganização epitelial proeminente, com acumulação de actina F e deslocamento de clones da camada epitelial ( Figura 3D ). Aos 6 dias de AED, os tumores neoplásicos que expressam MMP1 se sobrecarregaram na região dobradiça ( Figura 3G ), embora com variação no tamanho do tumor entre as amostras ( Figura 3E e F ). Uma seção vertical da região da dobradiça confirmou que o tumor neoplásico sofreu crescimento desviante no lado apical da camada epitelial (

Para monitorar a progressão do crescimento tumoral induzida pelo derrame lgl , foram gerados clones esporádicos que expressam lgl-RNAi em discos de asa usando o sistema de mosaico GAL4 flip-out induzido pelo choque térmico. Dois dias após o choque térmico das larvas do segundo estágio (2 dias AED), alguns clones lng- downgrade localizados na região da dobradiça apresentaram desvio do lado apical da camada epitelial ( Figura 4A ). Quatro dias após a indução do choque térmico, as lesões displásicas na região da dobradiça tornaram-se claras, sugerindo que os clones lub- knockdown deslocados para longe do lado apical proliferam no lúmen ( Figura 4B ). Sete dias após a indução do choque térmico, os sobrecretos tumorigênicos dominaram as regiões dobradiças ( Figura 4C ).

Para demonstrar aClassificação de fenótipos clonais com nosso método de diagnóstico, foram gerados clones esporádicos que expressam scrib-RNAi em discos de asa usando o sistema de mosaico GAL4 flip-out induzido pelo choque térmico. Cinco dias após o choque térmico nas larvas do segundo estádio (2 dias AED), certos clones de bloqueio de scrib de GFP apresentaram fenótipos tumorigênicos ( Figura 5A ). Analisamos quatro clones (B, C, D e E na Figura 5A ) em seções verticais de imagens confocais de pilhas z usando ImageJ, porque é difícil adquirir os fenótipos citológicos e estruturais detalhados nas imagens confocais 2D ( Figura 4 e Figura 5A ). Os clones B e C foram classificados como displasia como proteína de junção septate Os discos grandes (Dlg) foram mislocalizados ( Figura 5B e C ). No clone B, o tamanho da massa celular deslocada do epitélio não era maior que 4 células no diameteR ( Figura 5B ), enquanto o clone C não se desviou do epitélio ( Figura 5C ); Portanto, os clones B e C não foram considerados neoplásicos. No entanto, os clones D e E, que também mostraram a mislocalização de Dlg, formaram massas de células tumorais fora do epitélio ( Figura 5D E 5E ). Como o tamanho desses clones tumorais deslocados tinha mais de 4 células de diâmetro, os clones foram classificados como neoplásicos.

Para induzir tumores hiperplásticos ou formações de cisto nos discos imaginários da asa, foram gerados clones esporádicos que expressam Oncogeneic Ras ( Ras V12 ) ou forma constitutivamente ativa de Yorkie, um coativador transcripcional da via Hippo ( Yki 3SA ), usando o induzido por choque térmico Flip-out sistema de mosaico GAL4. Quatro dias após choque térmico em larvas de segundo estágio (2 dias AED), RaOs clones de expressão V12 marcados pela GFP tornaram-se massas de células redondas nos discos imaginais ( Figura 6A ). Uma seção vertical do clone de expressão Ras V12 (clone B na Figura 6A ) revelou que a massa celular dissociada da camada epitelial possui uma localização adequada de Dlg, sugerindo que a massa celular mantém estruturas epiteliais normais fora da camada epitelial ( Figura 6B ) . A expressão de MMP1 não foi observada nestes clones de expressão Ras V12 ( Figura 6C ). Portanto, o clone B foi classificado como formação de cisto. Quatro dias após choque térmico para larvas de segundo estágio (2 dias AED), Yki 3SA - clones de expressão rotulados por GFP formaram grandes massas celulares nos discos imaginais ( Figura 7A ). Concentramo-nos em dois clones (B e C na Figura 7A ). Clone B mostrouIntegração na camada epitelial e localização adequada de Dlg nas membranas sub-apicais das células epiteliais, sugerindo que o clone B de Expressão Yki 3SA manteve a estrutura epitelial. Portanto, o clone B foi classificado como hiperplasia ( Figura 7B ). O clone C localizado na região da dobradiça mostrou a localização errada do Dlg e a estrutura multi-camadas formadas no lado basal da camada epitelial. A expressão de MMP1 não foi observada nos clones de expressão Yki 3SA . Em conjunto, o clone C foi classificado como neoplasia benigna ( Figura 7C e D ).

figura 1
Figura 1: Quadro de fluxo para classificação de fenômenos de tumores. Este fluxograma representa um método de diagnóstico para classificar as lesões clonais no epitélio imaginal. O classificAção baseia-se em cinco critérios: (1) desvio de clones da camada epitelial, (2) mislocalização subcelular de proteínas juncionais, (3) proliferação celular, (4) tamanho de clone e (5) expressão de MMP1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: ( A ) Disco imaginal de asa de tipo selvagem manchado para Dlg (verde) e núcleos (DAPI, magenta). ( B ) Representação esquemática de discos imaginais de asa de Drosophila mostrando regiões de bolsa de asa (azul), dobradiça (laranja) e notado (verde). ( C ) Disco imaginal de asa normal manchado para F-actina (vermelho) e microtúbulos (verde). As membranas do porão são rotuladas com colágeno IV / Vkg-GFP (azul). ( D ) Seção vertical do siteMarcado com linha pontilhada branca em ( C ). ( E ) Desenhos de linha traçam os lados apical (vermelho) e basal (azul) da camada epitelial em ( D ). Linhas pontilhadas traçam a membrana peripodial. As dobras distal (Df), medial (Mf) e proximal (Pf) da dobradiça dorsal são indicadas.
Genótipos detalhados: A, w - CD, Vkg-GFP Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Tumorigênese específica do site induzida por Enhancer-GAL4s. ( A , B ) As imagens confocais mostram os discos imaginais da asa dissecados das larvas do terceiro estádio dos genótipos indicados corados para MMP1 (vermelho). O sd-GAL4 -expreAs regiões ssing foram rotuladas pela expressão GFP (verde). ( CG ) As imagens confocais mostram os discos imaginais da asa dissecados das larvas do terceiro estádio dos genótipos indicados no ponto de tempo indicado AED. A F-actina foi corada com Phalloidin (vermelho) em ( CF ). A expressão de MMP1 é corada com anticorpos anti-MMP1 (vermelho) em ( G ). As regiões Express-GAL4 foram rotuladas pela expressão GFP (verde). Os painéis inferiores de ( CF ) mostram vistas ampliadas das regiões indicadas nos painéis superiores. As setas brancas indicam lesões displásicas induzidas por clones lub- knockdown. ( H ) Seção vertical do site marcado com linha pontilhada branca no painel inferior de (E). As linhas pontilhadas brancas marcam os limites entre a bolsa de asa e as regiões de charneira em (A) e (B). Os núcleos foram rotulados com DAPI (azul). Barras de escala = 100 μm em (AG) e 50 μm em (H). Genótipos detalhados: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi; C, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: fenódios tumorais induzidos por clones aleatórios de mosaico. ( AC ) As imagens confocais mostram os discos imaginais de larvas de mosaico de larvas de terceiro estádio com clones que co-expressam lgl-RNAi e GFP (verde) no ponto de tempo indicado após a indução de choque térmico. Os núcleos foram rotulados pela DAPI (azul). Os painéis do meio mostram vistas ampliadas das regiões do quadrado branco marcadas nos painéis esquerdos. O painel direito S mostram desenhos de linhas esquemáticas do lado apical das camadas epiteliais (azul) e os clones que expressam GFP (verde). Os clones de mosaico localizados no epitélio são retratados em verde claro, enquanto os tumores neoplásicos que se desviam do epitélio são mostrados em magenta. As linhas pontilhadas brancas nos painéis esquerdos marcam os limites entre a bolsa de asa e as regiões de dobradiça. As flechas brancas nos painéis do meio indicam lesões displásicas induzidas por clones lub- knockdown. Barras de escala = 100 μm. Genótipos detalhados: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Ato> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi (choque térmico de 30 min a 2 dias AED, incubar 2 dias a 25 ° C em A, incubar 4 dias a 25 ° C em B, incubar 7 dias em 25 ° C em C após choque térmico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Exame Diagnóstico de Fenômenos Clonais Displásicos. ( A ) O painel esquerdo mostra um disco imaginal de asa de mosaico de larva de terceiro estádio com clones coexpressando scrib-RNAi e GFP (verde) 5 dias após a indução de choque térmico, coradas para Dlg (vermelho). O painel direito mostra um desenho lineal esquemático do lado apical das camadas epiteliais (azul) e dos clones que expressam GFP (verde). Os clones de mosaico nas camadas epiteliais são mostrados em verde claro, enquanto os tumores neoplásicos deslocados do epitélio são mostrados em magenta. ( BE ) As imagens confocais mostram seções verticais dos clones scrib -knockdown indicados no painel direito de (A). Os segundos painéis da esquerda mostram os padrões de localização Dlg (vermelho). Os terceiros painéis da esquerda mostram desenhos de linhas esquemáticas dos lados apical (vermelho) e basal (azul) das camadas epiteliais e do GFP-exprEssencialmente scrib -knockdown clones (verde). Os clones displásicos nas camadas epiteliais são mostrados em verde claro (B e C), enquanto os linfonodos neoplásicos deslocados do epitélio são mostrados em magenta (D e E). As setas brancas indicam clrib- clocks que apresentam fenômenos tumorigênicos. Os núcleos foram rotulados com DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. O fenótipo do tumor de cada clone foi classificado de acordo com o fluxograma mostrado na Figura 1 . Genótipos detalhados: AE, hsFLP; UAS-scrib-RNAi; Ato> CD2> GAL4, UAS-EGFP (choque de calor 30 min a 2 dias AED, incubar 4 dias a 25 ° C após choque térmico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: DiagnosticaTic Exame de fenômenos clonais que compõem Ras V12 . ( A ) O painel esquerdo mostra um disco imaginal de asa de mosaico de larva de terceiro estádio com clones que coexistem Ras V12 e GFP oncogênicos (verde) 4 dias após a indução de choque térmico, corados para Dlg (vermelho). O painel direito mostra um desenho lineal esquemático do lado apical das camadas epiteliais (azul) e dos clones que expressam GFP (verde). A barra de escala representa 50 μm. ( B ) Seções verticais dos clones de expressão Ras V12 indicados no painel direito de (A). Os segundos painéis da esquerda mostram os padrões de localização Dlg (vermelho). Os terceiros painéis a partir da esquerda mostram desenhos de linhas esquemáticas dos lados apical (vermelho) e basal (azul) das camadas epiteliais e os clones de expressão Ras V12 e GFP (verde). Barra de escala = 25 μm. ( C ) Lâmina mosaica disco imaginal de larva do terceiro estádio com clones que coexpressam <Em> Ras V12 e GFP (verde) 4 dias após a indução de choque térmico, corados para MMP1 (vermelho). Barra de escala = 100 μm. Genótipos detalhados: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Ato> CD2> GAL4, UAS-EGFP (choque de calor 45 minutos a 2 dias AED, incubar 4 dias a 25 ° C após choque térmico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7: Exame de diagnóstico de fenóis clonais de Yki 3SA . ( A ) O painel esquerdo mostra um disco imaginal de asa de mosaico de larva de terceiro estádio com clones que coexpressam constitutivamente ativos Yki 3SA e GFP (verde) 4 dias após a indução de choque térmico, corados para Dlg (vermelho). O painel direito mostra como Desenho de linha chematic do lado apical das camadas epiteliais (azul) e os clones que expressam GFP (verde). Barra de escala = 50 μm. ( BC ) Seções verticais dos clones de expressão Yki 3SA indicados no painel direito de (A). Os segundos painéis da esquerda mostram os padrões de localização Dlg (vermelho). Os terceiros painéis a partir da esquerda mostram desenhos de linhas esquemáticas dos lados apical (vermelho) e basal (azul) das camadas epiteliais e os clones expressantes Yki e GFP (verde). Barra de escala = 25 μm. ( D ) Disco imaginal da asa mosaica da larva do terceiro instar com clones que coexpressam Yki 3SA e GFP (verde) 4 dias após a indução do choque térmico, corados para MMP1 (vermelho). Barra de escala = 100 μm. Genótipos detalhados: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / ato> CD2> GAL4, UAS-EGFP (choque de calor 30 min a 2 dias AED, incubar 4 dias a 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O sistema GAL4-UAS é uma das ferramentas genéticas mais poderosas para a expressão de genes direcionados em Drosophila 26 e facilita grandemente a indução e análise de células tumorais in vivo 4 . Este sistema permite a geração de clones que suportam os genes supressores de tumores ou a superexpressão de oncogenes no tecido epitelial de tipo selvagem, uma situação altamente semelhante aos estágios iniciais do câncer humano onde as células pro-tumorais transformadas são cercadas por células epiteliais normais. As linhas de driver GAL4 reguladas por sequências de potenciadores, como as linhas de armadilha de amplificador GAL4 ou as linhas 27 de Janelia GAL4, possuem padrões exclusivos de expressão restrita espacioteiramente por padrão. Portanto, essas linhas de potenciador-GAL4 são úteis para induzir tumores consistentemente em áreas restritas de discos imaginais. Além de sd-GAL4 e upd-GAL4 mostrados neste estudo, confirmamos que lgl- knockdown induziu bE outras linhas GAL4 de reforçador-incorporação, incluindo GAL4 ( en-GAL4 ), hedgehog-GAL4 ( hh-GAL4 ), optomotor-blind-GAL4 ( omb-GAL4 ), patch-GAL4 ( ptc-GAL4 ) e spalt-major- GAL4 ( salm-GAL4 ) pode gerar tumores neoplásicos nas regiões de dobradiça dos discos imaginais da asa. Se o padrão de expressão do potenciador-GAL4 precisa ser temporariamente controlado, uma combinação de GAL4 e uma versão sensível à temperatura de GAL80 (GAL80 ts ) é uma opção. GAL80 ts reprime a função GAL4 a 18 ° C, mas não a 29 ° C, o que permite que a expressão UAS-transgenes seja ligada ou desligada, conforme necessário 28 .

O sistema mosaico flip-out-GAL4, que combina o sistema FLP-FRT e o sistema GAL4-UAS 3 , gera clones aleatórios em discos imaginais. Ao combinar flippase indutível por choque térmico (hsFLP) com flip-out GAL4, o tempo de clone generatIon é controlável. Como o potencial tumorigênico das células de disco imaginal pode ser dependente do estágio de desenvolvimento, eventos de sinalização endógena e / ou diferenciação celular 29 , 30 , é muito importante examinar o efeito do tempo alterado de choque térmico em fenótipos tumorigênicos.

Verificou-se anteriormente que os clones mutantes de nTSG são submetidos a apoptose dependente da competição celular quando cercados por células de tipo selvagem 10 , 11 , 12 , 18 , sugerindo que são necessárias múltiplas mutações para a transformação celular durante o desenvolvimento do câncer. De facto, a sobre-expressão de Ras oncogénico ou Yki em LGL ou Scrib clones mutantes transforma-las em tumores agressivos 10, 18, 31 ao passo que misA expressão de Ras V12 ou Yki 3SA não induz com neoplasia maligna por si só sem mutações nTSG. Como mostrado aqui e anteriormente 16 , os clones de nTSG-knockdown pró-tumor gerados em discos de asa de tipo selvagem também sofrem apoptose e não mostram tumorigênese na bolsa de asa 16 . Ao mesmo tempo, os clones nTSG-knockdown localizados em "hotspots" de dobradiça se desenvolvem em tumores neoplásicos sem mutações oncogênicas adicionais. Em regiões de dobradiça, as células deficientes em nTSG seqüestram o transdutor Janus quinase / sinal e o ativador da transcrição (JAK / STAT) endógenos para gerar tumorigênese 16 . Portanto, os GAL4s específicos da dobradiça, como o upd-GAL4, são ferramentas úteis para induzir de forma consistente a formação de tumor neoplásico por eliminação mediada por RNAi de genes de supressores de tumores. Embora os clones de mosaico de nTSG-knockdown induzidos por GAL4 induzam também tumores neoplásicos na dobradiça reA ocorrência de tumorigênese é dependente do tamanho inicial do clone: ​​os grandes clones gerados por um choque térmico ao longo de 20 min geralmente induzem tumorigênese, enquanto a maioria dos pequenos clones gerados por choque térmico menor que 10 min são completamente eliminados (KM e YT, dados não publicados).

Uma série de estudos recentes sobre desenvolvimento de tumores e progressão do câncer usam discos imagólicos de Drosophila como um sistema modelo 32 , 33 . Comum desses estudos incluem vários marcadores de tumores neoplásicos: massas de células desviantes, formas de disco deformadas, acumulação de F-actina, ciclagem celular melhorada (incorporação BrdU / EdU ou expressão PH3), ativação da sinalização JNK e seu alvo a jusante MMP1, membrana basal Interrupção e / ou desorganização epitelial, incluindo perda ou deslocalização subcelular de proteínas envolvidas na polaridade das células basais apical (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 ou PAR-6), junções septárias(Lgl, Scrib, Dlg ou Coracle), ou junções de aderência (E-Cadherin ou Armadillo). Estes fenótipos são facilmente detectáveis ​​por coloração convencional de anticorpos. Embora seja difícil determinar se um fenótipo clonal é hiperplasia, displasia, neoplasia benigna ou neoplasia maligna no estágio inicial da tumorigênese, deve ser mais simples no epitélio do disco imaginal de Drosophila composto por uma única monocamada epitelial. Neste estudo, introduzimos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos de clones tumorais induzidos na monocamada epitelial ( Figura 1 ). Este método requer observações cuidadosas de cinco critérios usando imagens confocais de pilhas z; Cada critério de diagnóstico pode ser examinado por coloração convencional de anticorpos e imagem confocal. Um dos novos critérios que introduzimos neste método é o "critério de diâmetro de 4 células" que discrimina entre displasia e neoplasia em discos imaginais. As células pro-tumorais tais como os clones mutantes nTSG são frequentesExtrudido de camadas epiteliais através da competição celular ou desorientação do fuso 15 , 16 , 34 . Na maioria das situações, essas células extrudidas apoptose, e assim elas não podem proliferar. Embora possa ser possível que as células pro-tumorais sofram uma divisão celular uma vez durante a extrusão e uma ou duas vezes mais após a extrusão, isso faz uma massa celular de 2 a 3 células de diâmetro. Portanto, se uma massa celular de células pro-tumorais desviadas da camada epitelial é maior que o diâmetro de 4 células, podemos determinar que elas estão sobrevivendo e proliferando como uma neoplasia fora da camada epitelial.

Embora este método de diagnóstico seja simples, é fundamental tomar um curso temporal de fenótipos, à medida que o desenvolvimento e a malignidade do tumor progridem ao longo do tempo. Por exemplo, a displasia é um tecido citologicamente anormal e um estado de transição entre crescimentos completamente benignos e aqueles que são prémaligno. Portanto, mesmo se um clone observado for definido como uma displasia de acordo com o fluxograma ( Figura 1 ), é possível que a displasia posteriormente se desenvolva em uma neoplasia. Embora o estágio larval seja limitado no tempo (5 a 6 dias a 25 ° C ou 4 a 5 dias a 29 ° C AED), o crescimento tumoral em discos imaginais prolonga o estágio larval através de um adiós induzido por insulina de atraso induzido de puparação 35 , 36 . Portanto, a formação de tumor neoplásico em discos imaginais permite observar a progressão fenotípica do clone tumoral por vários dias. Nosso método de classificação simples pode ser amplamente aplicável à análise clonal de fenótipos tumorais em vários órgãos em Drosophila .

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a J. Vaughen pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e The Takeda Science Foundation Research Grant to YT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Wako 162-19321
TritonX-100 Wako 168-11805
Formaldehyde Wako 064-00406
bovine serum albumin Sigma A7906
normal goat serum Sigma G6767
mounting medium, Vectashield Vector Laboratories H-1000
DAPI Sigma D9542
mouse-anti-Dlg 4F3 Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 3A6B4, RRID:AB_579780 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 3B8D12, RRID:AB_579781 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 5H7B11, RRID:AB_579779 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin Developmental Studies Hybridoma Bank AA4.3, RRID:AB_579793 dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin Molecular probes A22283 dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 Molecular probes A11030 dilute in PBTG, 1:400
Name Company Catalog Number Comments
Fly strains
sd-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center #8609 recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center #26796 recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi Vienna Drosophila RNAi center #51247
UAS-scrib-RNAi Vienna Drosophila RNAi center #105412
UAS-RasV12 Bloomington Drosophila Stock Center #64196
UAS-Yki3SA Bloomington Drosophila Stock Center #28817
hsFLP Bloomington Drosophila Stock Center #6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) Bloomington Drosophila Stock Center #4780 recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP Bloomington Drosophila Stock Center #5428 X chromosome
UAS-EGFP Bloomington Drosophila Stock Center #6658 third chromosome
UAS-Dicer2 Bloomington Drosophila Stock Center #24650 second chromosome
UAS-Dicer2 Bloomington Drosophila Stock Center #24651 third chromosome
vkg-GFP Morin et al. 2001 GFP protein trap

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Biologia do Câncer Número 125 Drosophila Disco Imaginal Tumorigênese Neoplasia Displasia gene supressor tumoral GAL4-UAS RNAi
Indução e diagnóstico de tumores em<em&gt; Drosophila</em&gt; Epitelio do disco imaginal
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Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (125), e55901, doi:10.3791/55901 (2017).

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