Questo lavoro descrive un protocollo per l'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) usando una linea cellulare T-cellula matura. Questo protocollo è idoneo per indagare la distribuzione di marchi specifici di istoni in siti specifici di promozione o nel genoma.
I percorsi di segnalazione regolano i programmi di espressione genica attraverso la modulazione della struttura della cromatina a diversi livelli, ad esempio mediante modificazioni post-traslazionali (PTM) delle code di istone, lo scambio di istoni canonici con varianti istone e lo sfratto nucleosomico. Tale regolazione richiede il legame dei fattori di trascrizione sensibili al segnale (TFs) che reclutano gli enzimi che modificano cromatina agli elementi regolatori definiti come potenziatori. Comprendere come le cascate di segnalazione regolino l'attività di miglioramento richiede un'analisi completa del legame delle TF, degli enzimi che modificano cromatina e l'occupazione di marchi specifici di istone e di varianti istone. I campioni di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) utilizzano anticorpi altamente specifici per immunoprecipitazioni di complessi proteici / DNA specifici. La successiva analisi del DNA purificato consente di identificare la regione occupata dalla proteina riconosciuta dall'anticorpo. Questo lavoro descrive un protocollo in modo efficiente peRform ChIP di proteine di istone in una linea cellulare T-cellule matura. Il protocollo presentato consente di eseguire i test ChIP in un tempo ragionevole e con un'elevata riproducibilità.
Lo sviluppo, la differenziazione e l'omeostasi dipendono da specifici programmi di espressione genica che vengono stabiliti mediante segnalazione di eventi che modulano la struttura della cromatina e pertanto determinano se un determinato gene viene attivato o represso in maniera cellulare e temporale. Durante lo sviluppo di cellule T, devono essere stabiliti programmi specifici di espressione genica per determinare correttamente la maturazione dei precursori delle cellule T dal doppio negativo (DN) allo stato singolo-positivo (SP), passando attraverso diverse fasi intermedie 1 . Come il programma di espressione genica è dinamicamente regolato durante lo sviluppo di cellule T è stato ampiamente studiato negli anni precedenti da diversi laboratori 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Con modificazioni post-traduzionali (PTMs) di istoni, lo scambio diIsonici canonici con varianti istone, sfratto nucleosomi e metilazione del DNA regolano l'interruttore ON / OFF dei geni. Diversi gruppi hanno esaminato la distribuzione genoma di PTM e varianti istone per determinare marcature associate a diversi stati di cromatina sia nelle regioni regolatori prossimali che distali 7 , 8 , 9 , 10 . Le cascate di segnalazione orchestrano la regolazione dinamica della cromatina mediante lo scambio di enzimi positivi e negativi che modificano cromatina (noti anche come modificatori di cromatina) ad elementi specifici di potenziamento. Questi modificatori di cromatina regolano la struttura della cromatina e quindi la produzione trascrizionale con, ad esempio, la metilazione dinamica dell'istone e l'acetilazione. Questo è il caso nel percorso di segnalazione Notch 11 , 12 , 13 ,14.
Dinamico istone PTMs; Scambi con varianti istone; E l'occupazione dinamica degli istoni, dei fattori di trascrizione e dei cofattori può essere studiata mediante saggi di cromatin immunoprecipitazione (ChIP). Gli anticorpi altamente specifici vengono usati per purificare specifici complessi proteici del DNA e il DNA purificato viene analizzato mediante PCR quantitativo (qPCR); Sequenza profonda (ChIP-Seq); O, meno frequentemente, l'ibridazione a microarray (ChIP-ChIP).
I test di ChIP sono talvolta impegnativi a causa di complicanze con la lisi delle cellule, taglio della cromatina e / o bassa specificità degli anticorpi. Sono state adottate diverse strategie per migliorare il protocollo, come avviene per NEXSON 15 . L'uso di sonicatori a bagno d'acqua raffreddato evita il riscaldamento del campione che potrebbe danneggiare gli epitopi presenti sulla proteina in esame, ma l'energia necessaria per la tranciatura dei campioni viene disperdita nell'acqua.Un altro miglioramento è stato fatto con lo sviluppo di dispositivi a ultrasuoni focalizzati che impediscono la dispersione dell'energia. Pertanto, i dispositivi a ultrasuoni focalizzati consentono di migliorare la lisi cellulare e la cricatura, eliminando le variazioni indotte dall'operatore e aumentando notevolmente la riproducibilità.
Questo lavoro descrive un protocollo (riepilogo schematico in Figura 1 ) per eseguire in modo efficiente il ChIP delle proteine dell'istone in una linea di cellule T di topi chiamata E2-10HA 16 , 17 . Le cellule T sono di solito difficili da lire e la loro cromatina è stata rivelata inefficiente. In questo protocollo, che utilizza un ultrasonicator raffreddato a raffreddamento, il numero di cellule, il buffer di lisi e l'impostazione di taglio sono stati ottimizzati per la linea di cellule T2 mouse da mouse E2-10HA. Questo protocollo consente di eseguire ChIP con un'elevata riproducibilità e in un tempo ragionevole. In effetti, richiedeCirca due giorni per tagliare la cromatina e valutare la qualità della tranciatura e tre giorni per eseguire l'immunoprecipitazione, invertire il reticolato e purificare il DNA.
ChIP è una tecnica valida per indagare se le proteine oi loro PTM sono arricchite in regioni genomiche specifiche. I risultati del test di ChIP sono spesso impegnativi per interpretare a causa di motivi biologici o tecnici. Le ragioni biologiche sono molteplici e includono il legame debole o indiretto delle proteine al DNA. Ci sono anche limitazioni tecniche, come la limitata specificità degli anticorpi e la lisi cellulare inefficace o la cricatura di cromatina. Una guida alla risoluzione dei problemi ( Tabella 5 ) può aiutare il lettore a risolvere i problemi che potrebbero verificarsi con i test ChIP.
Questo protocollo, facendo uso di un dispositivo ultrasonator focalizzato sul raffreddamento, consente di tagliare in modo efficiente la cromatina di una linea cellulare T cellula matura. La fase principale critica del protocollo è rappresentata dalla tranciatura della cromatina, che deve sempre essere ottimizzata per ciascun tipo di cellula. Si suggerisce di variare il numero di celle e il numero di cicli di sonicazione. Inoltre, lei L'efficienza dell'azione è influenzata negativamente dalla presenza di precipitazioni di SDS nei campioni che possono formarsi durante la lisi delle cellule sul ghiaccio con buffer di lisi SDS. In questo caso, è meglio incubare il campione dopo la lisi a temperatura ambiente per alcuni minuti per ridurre la presenza di precipitazioni SDS. Si raccomanda di ottimizzare il protocollo per ottenere frammenti tagliati tra 200 e 500 bp e valutare sempre la qualità di taglio dei campioni prima di procedere con l'immunoprecipitazione. Inoltre, il tempo di fissazione, la quantità di anticorpo e / o le cellule e le condizioni di lavaggio devono essere ottimizzate per ciascun anticorpo.
Un ulteriore passo avanti nella realizzazione di una procedura ChIP è la scelta dell'anticorpo, poiché gli anticorpi a bassa specificità riducono in modo significativo l'efficacia dell'immunoprecipitazione. In precedenza, una procedura di test di qualità unificata ha permesso di valutare la specificità di diversi anticorpi disponibili sul mercato Ss = "xref"> 19. La pipeline di screening è stata basata su macchia dot blot, Western blot e ChIP, fornendo un elenco di reagenti di alta qualità adatti per ChIP 19 . Più recentemente, la specificità di alcuni anticorpi disponibili in commercio è stata valutata usando piattaforme microarray a peptide ad alta densità di istone, consentendo la creazione di un database sulla specificità degli anticorpi 20 . Il lettore può utilizzare questo strumento utile per identificare gli anticorpi più specifici che possono essere utilizzati per gli esperimenti ChIP.
Questo protocollo non è stato testato per le cellule T primarie e, in questo caso, il lettore dovrebbe fare riferimento a altri protocolli pubblicati che eseguono con successo ChIP sulle cellule T primarie 3 , 4 , 21 . In particolare, questo protocollo è stato utilizzato con successo per eseguire ChIP su una linea di cellule T progenitor del mouse, così come su una linea cellulare endoteliale.
Ove_content "> 5 x 10 6 cellule dovrebbero essere utilizzate per ogni immunoprecipitazione per l'analisi dei segni di istone.Perché questo protocollo può anche essere adatto, con qualche ottimizzazione, per eseguire ChIP su TF o cofattori, è meglio aumentare il numero di cellule Utilizzata per l'immunoprecipitazione in questi casi.Per arrivare al numero di cellule richiesto per ogni esperimento, più aliquote di lutea tagliata possono essere raggruppate insieme prima di diluire la cromatina nel tampone di diluizione.Questo protocollo potrebbe anche essere modificato per eseguire ChIP sulle proteine endogene che non si legano direttamente al DNA. In questo caso, è possibile richiedere la pre-fissazione con crosslinkers proteico-proteico ( ad esempio, dimetiladipimidato, DMA) (vedere l'Appendice B per ulteriori informazioni). La buona prestazione di ChIP sui cofattori è stata precedentemente effettuata mediante sovraespressione di proteine che sono fuse con un tag biotinico. In questo caso, la proteina è stata purificata con streptavidin-conjugaPerline magnetiche, e una pre-fissazione con DMA è stata eseguita 22 .
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati a P. Käse e T. Schmidt-Wöll per un'ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio collaborativa TRR81 e dal programma Heisenberg (BO 1639 / 5-1) della DFG (la Fondazione di ricerca tedesca), della Max Planck Society e della EXC 294 di Friburgo e del Cluster di eccellenza per il sistema cardio-polmonare (ECCPS) a Giessen alla TB
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |