Summary
Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.
Abstract
Sinyal yolakları, histon kuyruklarının post translasyonel modifikasyonları (PTM'ler), histon varyantları ile kanonik histonların değişimi ve nükleozom tahliye gibi farklı seviyelerde kromatin yapısının modülasyonu yoluyla gen ekspresyon programlarını düzenler. Bu düzenleme, arttırıcılar olarak tanımlanan düzenleyici elemanlarda kromatin değiştirici enzimleri işe yarayan sinyal duyarlı transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler) bağlanmasını gerektirir. Sinyal olay kaskadlarının arttırıcı aktiviteyi nasıl düzenlediğini anlamak TF'lerin, kromatin değiştirici enzimlerin bağlanmasının ve spesifik histon işaretlerinin ve histon varyantlarının dolaşımının kapsamlı bir analizini gerektirir. Kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri, spesifik protein / DNA komplekslerini immüno-çökeltmek için yüksek spesifik antikorları kullanır. Saflaştırılmış DNA'nın sonraki analizi, antikor tarafından tanınan protein tarafından işgal edilen bölgenin tanımlanmasına izin verir. Bu çalışma verimli bir şekilde peOlgun fare T hücre dizisinde histon proteinlerinin ChIP'ini oluşturun. Sunulan protokol, ChIP tahlillerinin makul bir zaman aralığında ve yüksek tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirilmesini sağlar.
Introduction
Gelişme, farklılaşma ve homeostaz, kromatin yapısını modüle eden ve bu nedenle belirli bir genin bir hücre ve zamana özgü biçimde aktive edilip engellenmediğini belirleyen olayları bildiren belirli gen ekspresyon programlarına bağlıdır. T-hücresi gelişimi sırasında, birkaç ara evreden 1 geçerek çift negatif (DN) ila tek pozitif (SP) haldeki T hücresi öncüllerinin olgunlaşmasını doğru bir şekilde belirlemek için spesifik gen ekspresyon programları oluşturulmalıdır. Gen ekspresyon programının T hücresi gelişimi sırasında dinamik olarak nasıl düzenlendiği, önceki laboratuvarlarda 2 , 3 , 4 , 5 , 6 numaralı laboratuvarlar tarafından geniş çapta araştırılmıştır.
Histonların post translasyonel modifikasyonları (PTM'ler) ile,Histon varyantlarına sahip kanonik histonlar, nükleozom tahliye ve DNA metilasyonu, genlerin ON / OFF anahtarını düzenler. Çeşitli gruplar, proksimal ve distal düzenleyici bölgelerde 7 , 8 , 9 , 10 farklı kromatin durumlarıyla ilişkili işaretleri belirlemek için PTM'lerin ve histon varyantlarının genom çapında dağılımını araştırdılar. Sinyalizasyon, spesifik arttırıcı elementlerde pozitif ve negatif kromatin değiştirici enzimlerin (ayrıca kromatin modifiye edici olarak da bilinir) değişimi yoluyla dinamik kromatin düzenlenişini düzenler. Bu kromatin değiştiriciler kromatin yapısını ve dolayısıyla transkripsiyonel çıktıyı örneğin dinamik histon metilasyonu ve asetilasyon ile düzenler. Notch sinyal yolunda 11 , 12 , 13 ,14.
Dinamik histon PTM'leri; Histon varyantları ile alışverişler; Ve histonların, transkripsiyon faktörlerinin ve kofaktörlerin dinamik dolaşımı, kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri ile araştırılabilir. Belirli DNA-protein komplekslerini saflaştırmak için oldukça spesifik antikorlar kullanılır ve saflaştırılmış DNA kantitatif PCR (qPCR) ile analiz edilir; Derin dizilim (ChIP-Seq); Veya günümüzde daha az sıklıkla, mikrodiziye hibridizasyon (ChIP-ChIP).
ChIP tahlilleri, bazen hücrelerin lizisi, kromatin kesilmesi ve / veya antikorların düşük özgüllüğü ile ilgili komplikasyonlar nedeniyle zorlayıcıdır. NEXSON 15'te olduğu gibi, protokolü geliştirmek için çeşitli stratejiler benimsenmiştir. Soğutma suyu banyosu sonikatörlerinin kullanılması, araştırılan protein üzerindeki epitoplara zarar verebilecek numune ısıtmasından kaçınır, ancak numunelerin kesilmesi için gereken enerji suya dağılır.Enerjinin dağılmasını önleyen odaklanmış ultrasonication cihazlarının geliştirilmesi ile bir başka gelişme yapılmıştır. Bu nedenle, odaklanmış ultrasonatör cihazları, hücre lizizinde ve kromatin makaslamada iyileştirme yapmaya, operatöre bağlı varyasyonları ortadan kaldırmaya ve tekrarlanabilirliği önemli ölçüde arttırmaya olanak tanır.
Bu çalışma , E2-10HA 16 , 17 olarak adlandırılan olgun bir fare T hücresi çizgisindeki histon proteinlerinin ChIP'ini etkili bir şekilde gerçekleştirmek için bir protokolü ( Şekil 1'deki şematik genel bilgi) açıklar. T-hücrelerinin çözülmesi genellikle zordur ve kromatinlerinin kesilmesi yetersizdir. Soğutma odaklı bir ultrasonatörü kullanan bu protokolde, hücre sayısı, liziz tamponu ve kesme ayarı E2-10HA fare T hücre dizisi için optimize edildi. Bu protokol, yüksek bir tekrarlanabilirlik ve makul bir zamanda ChIP gerçekleştirmesine olanak tanır. Aslında, requirKromatin kesmek ve makaslama kalitesini değerlendirmek için yaklaşık iki gün, immüno çökelmeyi gerçekleştirmek için üç gün, çapraz bağın tersini çevirin ve DNA'yı arındırın.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm tamponlar ve ortam Tablo 1'de listelenmiştir .
Gün 1 ve 2
1. Hücrelerin Çapraz Bağlanması
- 6-kuyucuklu bir plakadan fare T-hücrelerini, 4 ° C'de ve ~ 271 x g'de 5 dakika boyunca 50 mL tüp ve santrifüje aktarın. 30 mL IMDM hücre kültürü ortamında hücre topağını süspanse edin ve bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
- Yeni 50 mL'lik tüplere 20 x 10 6 hücrelik kısımlar toplayın.
- % 1 final konsantrasyona doğrudan formaldehit (FMA) hücre kültürü ortamı ekleyin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Dikkat: FMA inhale edildiğinde toksiktir, bu nedenle duman kaputunun altında çalışın ve uygun koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, lütfen ev sahibi kurumun kurallarına göre FMA atıklarını ele alınız. - 1/8 hacim 1 M glisin, pH 7.0 ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- 5 dakika süreyle santrifüj ederek hücreleri peletleyinMin, 4 ° C'de ve ~ 271 xg'de yıkanır ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır.
- Hücre pelletini 1 mL PBS ile yıkayın ve 1.5 mL tüplere aktarın.
2. Hücre Lizizi ve Kromatin Kesme
- Hücre peletini 1 mL SDS liziz tamponuna tekrar süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
- Her bir numuneyi sonikasyon tüpüne aktarın ve Tablo 2'de belirtilen ayarlara göre odaklanmış bir ultrasonatör kullanarak kesme işlemi yapın .
- Makaslamadan sonra, örnekleri 1.5 mL tüplere aktarın ve 4 ° C'de ve ~ 18.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı yeni tüplere aktarın.
- Adım 3'e göre kesilme verimliliğini belirlemek için 50 μL toplayın ve sıvı azot içinde kesilmiş lisatı derhal dondurun. Lizatı tek kullanımlık alikotlar halinde -80 ° C'de saklayın.
3. Kesme Verimliliğinin Belirlenmesi
- 50 ul 50 ul elüsyon tamponu ekleyin ve #181 L; her bir kesilmiş lizatın l'si ve gece boyunca 65 ° C'de çalkalayarak inkübe edin.
- 100 uL TE tampon ve 4 μL 10 mg / mL RNaz A (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin. Karıştırıp 37 ° C'de 2 saat çalkalayarak inkübe edin.
- Her bir numuneye 2 mcL 20 mg / mL proteinaz K (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin ve sallayarak 55 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Her numuneyi, fenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun bir jel tüpüne aktarın; Üreticinin talimatlarına göre tutun.
- 200 ul fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) ilave edin ve tüpleri sallayın. 24 ° C ve ~ 16000 xg'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve üst fazı yeni tüplere aktarın.
Dikkat: Fenol, kloroform ve izoamil alkol inhale edildiğinde toksiktir ve koroziftir; Davlumbazın altında çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, fenol, kloroform ve izoamil alkollü atıkları idare edinEv sahibi kurumun kurallarına göre.- Tekrarla.
- Üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki değişikliklerle saflaştırma sütunları kullanarak DNA'yı saflaştırın:
- Zar iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan etanolün buharlaşması için tüp oda sıcaklığında 2 dakika açık bırakılmalıdır.
- Elüsyon için, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe 50 mcL H 2 O ekleyin, düzgün membran ıslak 1 s tüp ve 1 dakika için santrifüjleme ile DNA elute önce 1 dakika oda sıcaklığında inkübe 24 ° C ve ~ 17.900 x g.
- Üreticinin talimatlarına göre yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak saflaştırılmış DNA'yı bir florometre üzerinde ölçün.
- % 1.8 agaroz jel üzerinde yaklaşık 500 ng saflaştırılmış DNA'yı ve yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak bir elektroforez sistemi üzerinde yaklaşık 1 ng analiz edin.
Not: beklenen sizE DNA parçaları 200 ila 500 bp arasındadır.
3. ve 4. gün
4. İmmunopresipitasyon
- 1 hacim kesilmiş lizat, 5 hacim seyreltme tamponu ile seyreltin.
- Soğuk odada dönerken 30 μL / mL protein A agaroz boncuk ( Ek A'ya göre hazırlanmıştır) ile 30 dakika süreyle önceden temizleyin.
- ~ 750 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
- Girişin% 10'unu toplayın ve 4 ° C'de saklayın.
- İstenen lizat miktarını yeni tüplere koyun (ayrıntılar için Tablo 3'e bakın). Her bir tüpe istenen antikorları ekleyin (ayrıntılar için Tablo 3'e bakın) ve gece boyunca 4 ° C'de döndürün.
- 40 μL protein A boncuk ekleyin ve döndürürken 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Boncukları 1 mL düşük tuzlu tampon, yüksek tuzlu tampon, LiCl tampon ve TE tampon ile yıkayın (her yıkama için döndürürken 5 ° C'de 5 dakika inkübe edin ve santrifüj edin4 ° C'de ve ~ 950 xg'de 3 dakika). Ayrıntılar için Tablo 3'e bakın.
- Elüsyon tampon 110 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe, her 2 dakikada vorteksleme.
- 4 ° C'de ve ~ 950 xg'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin ve yüzer kısım 100 uL tekrar yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
- 4.7-4.8 adımlarını 100 uL elüsyon tamponuyla tekrarlayın ve eluatları birleştirin. Örnekleri girmek için elüsyon tamponu 200 μL'ye kadar ekleyin.
- Bütün örnekleri gece boyunca 65 ° C'de çalkalayarak inkübe edin.
5. Gün
5. DNA Saflaştırması
- Her eluat için 200 uL TE tamponu ve 10 mg / mL RNaz A (8 μL, 0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin. Karıştırıp 37 ° C'de 2 saat çalkalayarak inkübe edin.
- Her bir eluat için 4 μL 20 mg / mL proteinaz K (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin ve çalkalamayla 55 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Her bir örneği jöle haline getirinFenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun tüp; Üreticinin talimatlarına göre tutun.
- 400 μL fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) ilave edin ve tüpleri sallayın. 24 ° C'de ve ~ 16.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst fazı yeni tüplere aktarın.
Dikkat: Fenol, kloroform ve izoamil alkol inhale edildiğinde toksiktir ve koroziftir; Davlumbazın altında çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, ev sahibi kurumun kurallarına göre fenol, kloroform ve isoamil alkol atığını ele alınız.- Tekrarla.
- Üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki değişikliklerle saflaştırma sütunları kullanarak DNA'yı saflaştırın:
- Zar iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan etanolün buharlaşması için tüpleri oda sıcaklığında 2 dakika açık bırakın.
- Elüsyon için, 50 μL H 2 O ekleyin, oda temperatuasında inkübe edin1 dakika boyunca tekrarlayın, zarları düzgün ıslatmak için tüpleri 1 s döndürün ve 1 dakika boyunca 24 ° C'de ve ~ 17.900 x g'de santrifüje tabi tutarak DNA'yı elute etmeden önce oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
Representative Results
Olgun fare T hücreleri, lizin 4'ün histon 3'te (H3K4me1) histon marka mono-metilasyonunun zenginleştirilmesini, histon 3'ün (H3K4me3) lisin 4'ün tri-metilasyonunu ve lizin 27'nin asetillenmesini incelemek için ChIP analizine tabi tutuldu. Histone 3 (H3K27ac) yanı panH3 ChIP tarafından ortaya çıkarılan nükleozom doluluğu. Kesme kalitesi,% 1.8 agaroz jeli ( Şekil 2A ) ve bir elektroforez sistemi ( Şekil 2B ) üzerinde analizle değerlendirildi. H3K4me1 ve H3K4me3, sırasıyla arttırıcı bölgeleri ve yükselticileri tanımlamak için kullanılır ( Şekil 3A ). Nitekim H3K4me3 belirgin olup yalnızca promotörler 5 , 8 , 14'te zenginleştirilmiş değildir. Aktif arttırıcıların bir özelliği, H3K4me1 ve H3K27ac için oldukça zenginleştirilmiş olması ve H3K4me3 için zayıf şekilde zenginleştirilmiş olmasıdır (<Inaktif arttırıcılar, düşük H3K4me3 ve H3K27ac seviyeleri, ancak yüksek H3K4me1 seviyeleri gösterirler ( Şekil 3A , alt panel). Şekil 3B'de gösterildiği gibi, Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaz ( Gapdh ) geni, aktif gen promotörlerinin ( Gapdh promotörünün ) analizini temsil etmektedir . Gerçekte, yüksek seviyelerde H3K4me3 ve H3K27ac ve düşük H3K4me1 seviyeleri gösterir. Şekil 3B'de Deltex1 ( Dtxl ), H3K4me1 için zenginleştirilmiş ve H3K4me3 ve H3K27ac için zayıf şekilde zenginleştirilmiş olduğu için, inaktif arttırıcıları ( Dtx1 arttırıcı ) temsil etmektedir. Gen çölü , kodlayıcı genlerden yoksun bir bölgeyi temsil eder ve genellikle aktif kromatin işaretleri için negatif bir kontrol olarak dava edilir. H3K4me1, iyi kabul görmüş arttırıcı işaret 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , Gen çölde zenginleştirilmiş değil, bu bölgenin güçlendirici bulunmadığını öne sürüyor.
Şekil 1: Sunulan ChIP protokolünün şematik görünümü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: olgun fare T hücre hattının kesme kalitesi kontrolü. ( A ) Olgun fare T hücre çizgisi E2-10HA'nın iki farklı bölüntüsü kesildi ve yaklaşık% 500 saflaştırılmış DNA,% 1.8 agaroz jeli üzerinde analiz edildi ve kesilip alınmadığı değerlendirildiIng kalitesi. ( B ) numune 2'den 1 ng saflaştırılmış DNA, kesme kalitesini değerlendirmek için elektroforez ile analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: arttırıcıları ve yükselticileri karakterize eden kromatin işaretleri. ( A ) Aktif arttırıcılar (üst panel) yüksek H3K4me1, düşük H3K4me3 ve yüksek H3K27ac ile karakterize edilirken, inaktif arttırıcılar (alt panel) yüksek H3K4me1, düşük H3K4me3 ve düşük H3K27ac sunar. ( B ) Şekil 2A'da sunulan numuneler bir araya getirildi ve panH3 ChIP tarafından ortaya çıkarıldığı üzere, histon markları H3K4me1, H3K4me3 ve H3K27ac ve histon doluluğu için ChIP analizi için kullanıldı. Bu analiz,E destekçisi Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaz ( Gapdh promotörü ), H3K4me3 ve H3K27ac için zenginleştirilmiş ve H3K4me1 için az zenginleştirilmiş. Öte yandan, aktif olmayan gen Deltex1'in ( Dtx1 arttırıcı ) zenginleştiricisi, H3K4me1 için zenginleştirilmiş ancak H3K4me3 ve H3K27ac için zayıf şekilde zenginleştirilmiş. Nükleozomun doluluk oranını araştırmak için bir panH3 antikoru kullanan ChIP kullanıldı. Gen çölü negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Bir temsilci deney gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Arabellek adı | reaktif | Nihai konsantrasyon |
| Seyreltme tamponu | Sodyum dodekIl sülfat (SDS) | % 0.01 (ağ / hac) |
| Triton X-100 | % 1.1 (h / h) | |
| Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 | 1.2 mM | |
| Tris-HC1 pH 8.1 | 16.7 mM | |
| Sodyum klorür (NaCI) | 167 mM | |
| DMA çözümü | Dimetil adipimidat (DMA) | 10 mM |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | 1x | |
| Elüsyon tamponu | Sodyum dodesil sülfat (SDS) | % 1 (a / h) |
| Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 | 10 mM | |
| Tris-HC1 pH 8.0 | 50 mM | |
| Yüksek tuz tamponu | Sodyum dodesil sülfat (SDS) | % 0.1 (a / h) |
| Triton X-100 | % 1 (h / h) | |
| EthylenediamiNetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 | 2 mM | |
| Tris-HC1 pH 8.1 | 20 mM | |
| Sodyum klorür (NaCI) | 500 mM | |
| IMDM aracı | Iscove'un modifiye Dulbecco's medium (IMDM) | 1x |
| Fetal sığır serumu (FBS) | % 2 (h / h) | |
| Penisilin / Streptomisin | 1x | |
| Pepton primatonu | 0.3 mg / mL | |
| Insan insülini çözeltisi | 4.8 mg / mL | |
| Minimum esansiyel orta zorunlu olmayan amino asitler (MEM NEAA) | 1x | |
| LiCl tuz tamponu | Lityum klorür (LiCI) | 0,25 M |
| IGEPAL-CA630 | % 1 (h / h) | |
| Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 | 1 mM | |
| Tris-HC1 pH 8.1 | 10 mM | |
| Düşük tuz tamponu | Sodyum dodesil sülfat (SDS) | % 0.1 (a / h) |
| Triton X-100 | % 1 (h / h) | |
| Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 | 2 mM | |
| Tris-HC1 pH 8.1 | 20 mM | |
| Sodyum klorür (NaCI) | 150 mM | |
| Protein A Sepharose boncuk yıkama tamponu | Tris-HC1 pH 8.0 | 20 mM |
| Sodyum klorür (NaCI) | 500 mM | |
| Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 | 2 mM | |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | % 0.1 (a / h) | |
| IGEPAL-CA630 | % 1 (h / h) | |
| SDS Lysis tamponu | Sodyum dodesil sülfat (SDS) | % 1 (a / h) |
| EthylenediAminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 | 10 mM | |
| Tris-HC1 pH 8.1 | 50 mM | |
| TE tamponu | Tris-HC1 pH 8.0 | 10 mM |
| Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 | 1 mM |
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponların ve ortamın listesi.
| AÇIK | KAPALI | |
| Zirve gücü | 150,0 | 2.5 |
| Görev faktörü | 15.0 | 15.0 |
| Döngüleri / patlama | 500 | 500 |
| Devir sayısı | 28 | |
Tablo 2: Bu protokolde kullanılan kesme ayarları. Bu koşullar olgun bir fare T-hücresi hattı için optimize edilmiştir.
| Antikor | satıcı | Antikor miktarı / immüno çökeltme | Hücrelerin miktarı / immüno çökeltme | Yıkama koşulları |
| H3 | Abcam (ab1791) | 2.5 mg | 5 x 10 6 | Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2.5 mg | 5 x 10 6 | Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda |
| H3K4me3 | Diagenode (pAb-003-050) | 2.5 mg | 5 x 10 6 | Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda |
| H3K27ac | Diagenode (pAb-174-050) | 2.5 mg | 5 x 10 6 | Düşük tuz tamponunda Oce, iki kez Yüksek tuz tamponu, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponu |
| IgG | Diagenode (C15410206) | Değişken* | Değişken* | Değişken* |
| * IgG kontrolü durumunda hem antikor hem de hücrelerin miktarı, yıkama adımları, diğer immüno çökeltilerin koşullarını yansıtmalıdır. | ||||
Tablo 3: Bu çalışmada kullanılan antikorlar ve yıkama koşulları.
| Gen | Ileri astar | Ters astar | sonda |
| Gapdh yönlendiricisi (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Dtx1 arttırıcı (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Gen çölü | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Tablo 4: Bu çalışmada qPCR için kullanılan primerler ve problar.
| Sorun | Nedenler | Çözüm |
| Kromatin makaslanmış ve parçacıklar çok büyük. | Çok fazla hücre kullanılmıştır. | Hücrelerin sayısını azaltın. |
| Makaslama çok düşüktür. | Kesme çevrimi sayısını artırın. | |
| Kesme tepe gücü, çalışma faktörü ve / veya devir / patlamayı arttırın. | ||
| Kromatin kesilmiş ve fragmanlar çok küçük. | Çok az hücre kullanılmıştır. | Hücre sayısını artırın. |
| Kesme çok yüksek. | Kesme çevrimi sayısını azaltın. | |
| Kesme tepe enerjisini, görev faktörünü ve / veya devir / patlamayı azaltın. | ||
| Ben üzerinde çok düşük kurtarmaGG kontrolü ve / veya negatif kontrol (yüksek arka plan). | Deney için yeterli kromatin kullanıldı. | Kromatin miktarını arttırın. |
| Antikor miktarı çok düşüktür. | Antikor miktarını arttırın. | |
| Antikor miktarı çok yüksek. | Antikor miktarını azaltın. | |
| Antikorun özgüllüğü düşüktür. | Antikoru değiştir. | |
| Yıkama koşulları çok katıdır. | Yıkama sayısını azaltın. | |
| Yıkama tamponlarının sıkılığını azaltın. | ||
| Yıkama koşulları yeterince sıkı değildir. | Yıkama sayısını arttırın. | |
| Yıkama tamponlarının sıkılığını arttırın. | ||
| QPCR'de çok fazla DNA pipetle alındı. | QPCR'de pipetle alınan DNA miktarını azaltın. | |
| QPCR koşulları optimal değildir. | QPCR koşullarını optimize edin. | |
| Çevrim sayısını azaltın. | ||
| Girdi örneğinin qPCR reaksiyonunda hiçbir ürün veya ürün çok düşüktür. | QPCR'de yeterli DNA pipete konmadı. | QPCR'de pipetle alınan DNA miktarını arttırın. |
| QPCR koşulları optimal değildir. | QPCR koşullarını optimize edin. | |
| Çevrim sayısını arttırın. | ||
| Deney için yeterli kromatin kullanıldı. | Kromatin miktarını arttırın. | |
| Pozitif kontrol ve / veya panH3 Çipinde sinyal yok. | Deney için yeterli kromatin kullanıldı. | Kromatin miktarını arttırın. |
| Antikor miktarı çok düşüktür. | Antikor miktarını arttırın. | |
| AntiVücut özgüllüğü düşüktür. | Antikoru değiştir. | |
| Elüsyon uygun değildir. | Boncukları çözelti içinde tutmak için numuneleri sık sık girdapladığınızdan emin olun. |
Tablo 5: Sorun Giderme.
Discussion
ChIP, proteinlerin veya bunların PTM'lerinin spesifik genomik bölgede zenginleşip zenginleşmediğini araştırmak için geçerli bir tekniktir. ChIP test sonuçları biyolojik veya teknik nedenlerden dolayı genellikle yorum yapmakla zorlanır. Biyolojik nedenler çok katlıdır ve proteinlerin DNA'ya zayıf veya dolaylı olarak bağlanmasını içerir. Sınırlı antikor özgüllüğü ve verimsiz hücre lizisi veya kromatin kesme gibi teknik sınırlamalar da vardır. Bir sorun giderme kılavuzu ( Çizelge 5 ), okuyucunun ChIP analizlerinde karşılaşılabilecek sorunları çözmesine yardımcı olabilir.
Soğutma odaklı bir ultrasonator cihazından yararlanan bu protokol, olgunlaşmış bir fare T hücre çizgisinin kromatinini verimli bir şekilde kesmesine izin verir. Protokolün asıl kritik basamağı, her zaman her hücre tipi için optimize edilmiş olması gereken kromatin kesilmesi ile temsil edilir. Hücrelerin sayısını ve sonikasyon çevrimlerinin sayısını değiştirmek önerilir. Ayrıca, o SDS liziz tamponu ile buz üzerinde hücrelerin lizizi sırasında oluşabilecek örneklerdeki SDS çökeltilerinin varlığı olumsuz etkilenir. Bu durumda, SDS çökeltilerinin varlığını azaltmak için numuneyi oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca lüsizasyondan sonra inkübe etmek en iyisidir. 200 ile 500 bp arasında kesilmiş fragmanları elde etmek için protokolü optimize etmek ve immüno çökeltme işlemine başlamadan önce numunelerin kesilme kalitesini daima değerlendirmek önerilir. Ayrıca sabitleme zamanı, antikor ve / veya hücrelerin miktarı ve yıkama koşulları, her bir antikor için optimize edilmelidir.
Bir ChIP prosedürünü başarılı bir hale getirirken bir diğer kritik adım, antikorun seçilmesidir, çünkü düşük özgünlük antikorları immüno çökelmenin etkinliğini önemli ölçüde azaltır. Daha önce, piyasada bulunan çeşitli antikorların özgüllüğünün değerlendirilmesine izin verilen birleştirilmiş bir kalite testi prosedürü Ss = "xref"> 19. Tarama hattı, dot blot, Western blot ve ChIP'e dayanılarak ChIP 19 için uygun yüksek kaliteli reaktiflerin bir listesi sağladı. Daha yakın zamanlarda, ticari olarak temin edilebilen birkaç antikorun spesifitesi, antikor özgüllüğü üzerine bir veri tabanının oluşturulmasına izin veren, yüksek yoğunluklu histon peptid mikrodizi platformları kullanılarak değerlendirildi. Okuyucu ChIP deneyleri için kullanılabilecek en spesifik antikorları tanımlamak için bu yararlı aracı kullanabilir.
Bu protokol, birincil T hücreleri için test edilmemiştir ve bu durumda okuyucu, birincil T hücreleri 3 , 4 ve 21 üzerinde ChIP'yi başarılı bir şekilde gerçekleştiren yayınlanmış protokollere başvurmalıdır. Özellikle, bu protokol bir fare endojen hücre hattının yanı sıra bir fare progenitör T-hücresi hattı üzerinde ChIP'i başarıyla yerine getirmek için kullanılmıştır.
Ove_content "> Histon işaretlerinin analizi için her immüno çökelme için 5 x 106 hücre kullanılmalıdır.Bu protokol TF'ler veya kofaktörler üzerinde ChIP gerçekleştirmek için bazı optimizasyonlarla birlikte de uygun olabilir, bu nedenle hücre sayısını artırmak en iyisidir Bu vakalarda immüno çökeltme için kullanılmıştır Her deney için gerekli hücre sayısına ulaşmak için, dilimlenmiş lizatın daha küçük kısımları seyreltme tamponu içerisinde kromatin seyreltmeden önce bir araya toplanabilir.Bu protokol doğrudan DNA'ya bağlanmayan endojen proteinler üzerinde ChIP gerçekleştirmek üzere modifiye edilebilir. Bu durumda, protein-protein çapraz bağlayıcılarla ( örneğin dimetil adipimidat, DMA) ön fiksasyon gerekebilir (daha fazla bilgi için Ek B'ye bakınız). Kofaktörlerde ChIP'in başarılı bir performansı, daha önce bir biotin etiketi ile kaynaştırılmış aşırı ifade eden proteinler tarafından yapılmıştır. Bu durumda, protein streptavidin-konjuga ile saflaştırılmıştırTed manyetik boncuklar ve DMA ile ön fiksasyon yapıldı 22 .
Disclosures
Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Mükemmel teknik yardım için P. Käse ve T. Schmidt-Wöll'e minnettarız. Bu çalışma, DFG (Alman Araştırma Vakfı )'nın TRR81 ve Heisenberg programı (BO 1639 / 5-1), Freiburg'daki Max Planck Topluluğu ve EXC 294 ortak araştırması hükmü ve Cardio Pulmoner Sistem için Mükemmellik Kümesi tarafından desteklendi. (ECCPS), Giessen'de TB'ye
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
- Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
- Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
- Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
- Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
- Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
- Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
- Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
- Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
- Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
- Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
- Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
- Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
- White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
- Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
- Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).
