Summary
يصف هذا العمل بروتوكول ل لونين إمونوبريسيانتاتيون (رقاقة) باستخدام ناضجة الماوس T- خط الخلية. هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق في توزيع علامات هيستون محددة في مواقع المروج محددة أو الجينوم واسعة.
Abstract
وتقوم مسارات التشوير بتنظيم برامج التعبير الجيني من خلال تشكيل بنية الكروماتين على مستويات مختلفة، مثل التعديلات بعد متعدية (تي تي أم) لتيول هيستون، وتبادل الهيستونات المتعارف عليها مع المتغيرات هيستون، وإخلاء النيوكليوسومات. يتطلب هذا التنظيم ملزمة لعوامل النسخ الحساسة للاشارات (تفس) التي تجنيد الانزيمات تعديل الكروماتين في العناصر التنظيمية التي تعرف بأنها المعززات. فهم كيفية تنظيم شلالات تنظيم نشاط محسن يتطلب تحليل شامل لربط تفس، الكروماتين تعديل الإنزيمات، وإشغال علامات هيستون محددة والمتغيرات هيستون. المقايسات المناعية (رقاقة) الكروماتين استخدام أجسام مضادة محددة للغاية ل إيمونوبريسيبيتات بروتين معين / المجمعات دنا. تحليل لاحق من الحمض النووي المنقى يسمح لتحديد المنطقة المحتلة من قبل البروتين المعترف بها من قبل الأجسام المضادة. يصف هذا العمل بروتوكول ل بي كفاءةتشوه، بسبب، هيستون، بروتينز، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، إنضج، الفأر، T-سيل، سطر. بروتوكول عرض يسمح لأداء المقايسات رقاقة في إطار زمني معقول ومع استنساخ عالية.
Introduction
تعتمد التنمية والتمايز والتوازن على برامج التعبير الجيني محددة التي يتم إنشاؤها من خلال إشارات الأحداث التي تعدل بنية الكروماتين، وبالتالي تحديد ما إذا كان يتم تنشيط جين معين أو قمعها بطريقة الخلية والوقت المحدد. خلال تطوير الخلايا التائية، يجب إنشاء برامج التعبير الجيني محددة لتحديد نضوج السلائف خلية T من السلبي المزدوج (دن) إلى حالة إيجابية واحدة (سب)، يمر عبر عدة مراحل وسيطة 1 . كيف تم تنظيم برنامج التعبير الجيني ديناميكيا خلال تطوير الخلايا التائية تم التحقيق على نطاق واسع في السنوات السابقة من قبل العديد من المختبرات 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 .
عن طريق التعديلات بعد متعدية (بتمس) من الهيستونات، وتبادلهيستونيس الكنسي مع المتغيرات هيستون، الطرد نوكلأوسوم، ومثيلة الحمض النووي تنظم التبديل أون / أوف من الجينات. وقد حققت عدة مجموعات في توزيع الجينوم على نطاق واسع من بتمس والمتغيرات هيستون لتحديد العلامات التي ترتبط مع مختلف دول الكروماتين في كل من المناطق التنظيمية القريبة والبعيدة 7 ، 8 ، 9 ، 10 . تشوير الشلالات تنظيم تنظيم كروماتين الديناميكي عن طريق تبادل الإيجابية والسلبية إنزيمات تعديل الكروماتين (المعروف أيضا باسم معدلات الكروماتين) في عناصر محسن محددة. هذه المعدلات لونين تنظيم هيكل الكروماتين، وبالتالي الناتج النسخي من قبل، على سبيل المثال، مثيلة هيستون الديناميكي والأستيلاتيون. هذا هو الحال في مسار إشارات الشق 11 ، 12 ، 13 ،14 -
ديناميكية هيستون بتمس. التبادلات مع المتغيرات هيستون. وإمكانية الإشغال الديناميكي للهيستونات، عوامل النسخ، والعوامل المساعدة يمكن التحقيق من قبل المقايسات المناعية (رقاقة) لونين. وتستخدم الأجسام المضادة محددة للغاية لتنقية المجمعات الحمض النووي البروتين محددة، ويتم تحليل الحمض النووي المنقى عن طريق ير الكمية (قر). تسلسل عميق (تشيب-سيق)؛ أو أقل تواترا في الوقت الحاضر، التهجين ل ميكروأري (رقاقة رقاقة).
مقايسات رقاقة في بعض الأحيان تحديا بسبب المضاعفات مع تحلل الخلايا، القص من لونين، و / أو خصوصية منخفضة من الأجسام المضادة. وقد اعتمدت عدة استراتيجيات لتحسين البروتوكول، كما هو الحال بالنسبة إلى نيكسون 15 . استخدام التبريد سونيكاتورس حمام المياه يتجنب عينة التدفئة التي قد تلحق الضرر الحواتم الموجودة على البروتين قيد التحقيق، ولكن الطاقة المطلوبة لقص العينات يحصل فرقت في الماء.تم إجراء تحسين آخر مع تطوير أجهزة أولتراسونيكاتيون تركز التي تمنع تشتت الطاقة. ولذلك، تركز أجهزة أولتراسونيكاتور تسمح للتحسينات في تحلل الخلايا والكروماتين القص، والقضاء على الاختلافات التي يسببها المشغل وزيادة كبيرة في استنساخه.
يصف هذا العمل بروتوكول (نظرة عامة التخطيطي في الشكل 1 ) لأداء بكفاءة رقاقة من البروتينات هيستون في خط ناضج الفأر T- دعا E2-10HA 16 ، 17 . الخلايا التائية عادة ما تكون صعبة ل ليس، وقد تم الكشف عن القص من الكروماتين لتكون غير فعالة. في هذا البروتوكول، مما يجعل من استخدام أولتراسونيكاتور تركز على التبريد، تم تحسين عدد الخلايا، العازلة تحلل، ووضع القص ل E2-10HA الماوس خط الخلايا T. يسمح هذا البروتوكول واحد لأداء رقاقة مع استنساخ عالية وفي وقت معقول. في الواقع، فإنه ريكيرإس ما يقرب من يومين لقص الكروماتين وتقييم نوعية القص، وثلاثة أيام لأداء المناعي، عكس الارتباط، وتنقية الحمض النووي.
Protocol
ملاحظة: يتم سرد كافة المخازن المؤقتة والمتوسطة المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1 .
اليومان 1 و 2
1. يشابك الخلايا
- نقل الماوس خلايا T من لوحة 6 جيدا إلى أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 271 س ز. ريسوسبيند خلية بيليه في 30 مل من إدمم خلية ثقافة المتوسطة وعد الخلايا باستخدام غرفة نيوبور.
- جمع قسامة من 20 × 10 6 خلايا في أنابيب 50 مل جديدة.
- إضافة الفورمالديهايد (فما) إلى تركيز النهائي 1٪ مباشرة إلى وسط زراعة الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
تنبيه: فما سامة إذا استنشقت، لذلك العمل تحت غطاء الدخان وارتداء المعدات الواقية المناسبة. أيضا، يرجى التعامل مع النفايات فم وفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. - إضافة 1/8 الحجم من 1 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 7.0، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5دقيقة في 4 درجات مئوية و ~ 271 زغ وغسل مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس).
- غسل بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنابيب 1.5 مل.
2. خلية تحلل والكروماتين القص
- ريسوسبيند الخلية بيليه في 1 مل من سدز تحلل العازلة واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- نقل كل عينة إلى أنبوب سونيكاتيون وأداء القص باستخدام أولتراسونيكاتور تركز وفقا للإعدادات المشار إليها في الجدول 2.
- بعد القص، ونقل العينات إلى 1.5 مل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و ~ 18000 x ز.
- نقل طاف إلى أنابيب جديدة.
- جمع 50 ميكرولتر لتحديد كفاءة القص وفقا للخطوة 3 والمفاجئة تجميد المحللة في النيتروجين السائل. تخزين المحللة في أليكوتس ذات الاستخدام الواحد في -80 درجة مئوية.
3. تحديد كفاءة القص
- إضافة 50 ميكرولتر من العازلة شطف إلى 50 و #181؛ L من كل المحللة المقطعة واحتضان عند 65 درجة مئوية خلال الليل، مع اهتزاز.
- إضافة 100 ميكرولتر من العازلة تي و 4 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز (0.2 ميكروجرام / ميكرولتر التركيز النهائي). مزيج واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز.
- إضافة 2 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي) لكل عينة واحتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية، مع اهتزاز.
- نقل كل عينة إلى أنبوب هلام مناسبة لاستخراج الكحول الفينول / الكلوروفورم / الإيزوميل. مقبض وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إضافة 200 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) ويهز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 24 درجة مئوية و ~ 16000 زغ ونقل المرحلة العليا إلى أنابيب جديدة.
تنبيه: الفينول، الكلوروفورم، والكحول الإيزواميلي هي سامة إذا استنشاق وتآكل. والعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. أيضا، التعامل مع الفينول، الكلوروفورم، و أسوميل الكحول أس النفاياتوفقا لقواعد المؤسسة المضيفة.- التكرار مرة واحدة.
- تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع التعديلات التالية:
- غسل الغشاء مرتين. بعد غسل الماضي، وترك أنبوب مفتوح لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتبخير الايثانول المتبقية.
- للحصول على شطف، إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة، وتدور الأنبوب لمدة 1 ثانية ل رطب بشكل صحيح الغشاء، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة قبل التنازل عن الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 24 ° C و ~ 17،900 x ز.
- تحديد الحمض النووي المنقى على فلوروميتر باستخدام مجموعة عالية الحساسية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تحليل ما يقرب من 500 نانوغرام من الحمض النووي المنقى على هلام الاغاروز 1.8٪ وحوالي 1 نانوغرام على نظام الكهربائي باستخدام مجموعة عالية الحساسية.
ملاحظة: سيز المتوقعه من شظايا الحمض النووي ما بين 200 و 500 نقطة أساس.
اليومان 3 و 4
4. مناعي
- تمييع 1 حجم من المحللة قص مع 5 مجلدات من المخزن المؤقت التخفيف.
- بريكليري مع 30 ميكرولتر / مل البروتين وحبات الاغاروز (أعدت وفقا للتذييل ألف ) لمدة 30 دقيقة في حين الدورية في الغرفة الباردة.
- أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في ~ 750 x ز.
- جمع 10٪ من المدخلات وتخزينه في 4 درجات مئوية.
- قسامة المبلغ المطلوب من المحللة في أنابيب جديدة (انظر الجدول 3 لمزيد من التفاصيل). إضافة الأجسام المضادة المطلوبة لكل أنبوب (انظر الجدول 3 لمزيد من التفاصيل) وتناوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إضافة 40 ميكرولتر من البروتين وحبات واحتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية في حين الدورية.
- غسل الخرز مع 1 مل من العازلة منخفضة الملح، العازلة عالية الملح، العازلة ليكل، والعازلة تي (لكل غسل، واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في حين الدورية وأجهزة الطرد المركزيلمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 950 زغ). انظر الجدول 3 للحصول على التفاصيل.
- إضافة 110 ميكرولتر من العازلة شطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، فورتيكسينغ كل 2 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 950 زغ ونقل 100 ميكرولتر من طاف إلى أنبوب 1.5 مل جديد.
- كرر الخطوات 4.7-4.8 مع 100 ميكرولتر من العازلة شطف والجمع بين إيليتس. إضافة شطف عازلة تصل إلى 200 ميكرولتر لإدخال العينات.
- احتضان جميع العينات بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية، مع اهتزاز.
يوم 5
5. دنا تنقية
- إضافة 200 ميكرولتر من العازلة تي إلى كل شطافة و 8 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز (0.2 ميكروجرام / ميكرولتر التركيز النهائي). مزيج واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز.
- إضافة 4 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي) إلى كل شطافة واحتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية، مع اهتزاز.
- نقل كل عينة إلى هلامأنبوب مناسب ل فينول / كلوروفورم / إيسواميل كحول إستخراج؛ مقبض وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إضافة 400 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) ويهز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 24 درجة مئوية و ~ 16،000 x ز. نقل المرحلة العليا إلى أنابيب جديدة.
تنبيه: الفينول، الكلوروفورم، والكحول الإيزواميلي هي سامة إذا استنشاق وتآكل. والعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. أيضا، التعامل مع الفينول، الكلوروفورم، ونفايات الكحول الإيزواميلي وفقا لقواعد المؤسسة المضيفة.- التكرار مرة واحدة.
- تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع التعديلات التالية:
- غسل الغشاء مرتين. بعد غسل الماضي، وترك الأنابيب مفتوحة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتبخير الايثانول المتبقية.
- للحصول على شطف، إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O، احتضان في تمبراتو الغرفةإعادة لمدة 1 دقيقة، وتدور الأنابيب لمدة 1 ثانية ل رطب بشكل صحيح الغشاء، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة قبل التنازل عن الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 24 درجة مئوية و ~ 17،900 x ز.
Representative Results
وقد تعرضت الخلايا التائية الفئران الناضجة لتحليل تشيب للتحقيق في إثراء علامة هيستون أحادية مثيلة من ليسين 4 على هيستون 3 (H3K4me1)، ثلاثي مثيلة من يسين 4 على هيستون 3 (H3K4me3)، وأسيتيلاتيون من ليسين 27 على هيستون 3 (H3K27ac)، وكذلك الإشغال نوكليوسوم، كما كشفت عن رقاقة VPH3. تم تقييم جودة القص عن طريق تحليل على هلام الاغاروز 1.8٪ ( الشكل 2A ) وعلى نظام الكهربائي ( الشكل 2B ). وتستخدم H3K4me1 و H3K4me3 عموما لتحديد المواقع المحسزة والمروجين، على التوالي ( الشكل 3A ). في الواقع، H3K4me3 هو بارز ولكن ليس حصريا إثراء في المروجين 5 ، 8 ، 14 . سمة من المعززات النشطة هي أن تكون مخصبة للغاية ل H3K4me1 و H3K27ac وسوء التخصيب ل H3K4me3 (<فئة قوية = "زفيغ"> الشكل 3A، لوحة العلوي)، في حين أن المعالجات غير النشطة توفر مستويات منخفضة من H3K4me3 و H3K27ac ولكن مستويات عالية من H3K4me1 ( الشكل 3A ، لوحة السفلى). كما هو مبين في الشكل 3B ، نازعة غليسيردهيد 3-فوسفات ( غابد ) الجينات هو ممثل لتحليل المروجين الجينات النشطة ( المروج غابد ). في الواقع، فإنه يدل على مستويات عالية من H3K4me3 و H3K27ac وانخفاض مستويات H3K4me1. في الشكل 3B ، Deltex1 ( Dtx1 ) هو ممثل المعززات غير النشطة ( Dtx1 محسن )، كما هو المخصب للغاية ل H3K4me1 وسوء التخصيب ل H3K4me3 و H3K27ac. الصحراء الجينية هي ممثلة للمنطقة التي تفتقر إلى الجينات الترميز وعادة ما يتم رفع دعوى قضائية باعتبارها السيطرة السلبية لعلامات الكروماتين النشطة. ملاحظة أن H3K4me1، علامة مقبولة جيدا 4 ، 5 ، 7 ، 14 ، 18 ، لم يثرى في الصحراء الجين يشير إلى أن هذه المنطقة تفتقر إلى المعززات.
الشكل 1: نظرة عامة التخطيطي للبروتوكول رقاقة قدمت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: القص مراقبة الجودة من الماوس ناضجة خط T- الخلية. ( A ) قسمتين مختلفة من ناضجة الماوس T- خط الخلية E2-10HA تم قص، وحلل ما يقرب من 500 نانوغرام من الحمض النووي المنقى على هلام الاغاروز 1.8٪ لتقييم القصالجودة. ( B ) 1 نانوغرام من الحمض النووي المنقى من عينة 2 تم تحليلها بواسطة الكهربائي لتقييم جودة قصها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: علامات الكروماتين التي تميز المعززات والمروجين. ( A ) المعززات النشطة (اللوحة العلوية) تتميز H3K4me1 عالية، H3K4me3 منخفضة، وارتفاع H3K27ac، في حين أن المعالجات غير النشطة (لوحة أقل) تقدم H3K4me1 عالية، وانخفاض H3K4me3، وانخفاض H3K27ac. ( B ) تم تجميع العينات المقدمة في الشكل 2A معا وتستخدم لتحليل رقاقة مقابل علامات هيستون H3K4me1، H3K4me3، و H3K27ac وإشغال هيستون، كما كشفت عن رقاقة PanH3. ويبين هذا التحليل أن ثه المروج من الجينات التدبير المنزلي غليسيرالدهيد 3-فوسفات نازعة ( غابد المروج ) هو المخصب للغاية ل H3K4me3 و H3K27ac وإثراء منخفض ل H3K4me1. من ناحية أخرى، محسن الجين غير نشط Deltex1 ( Dtx1 محسن ) هو المخصب للغاية ل H3K4me1 ولكن المخصب سيئة ل H3K4me3 و H3K27ac. تم استخدام رقاقة باستخدام الأجسام المضادة panH3 للتحقيق في إشغال نوكليوسوم. استخدمت الصحراء الجينية كسيطرة سلبية. ويظهر أحد التجربة التمثيلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم المخزن المؤقت | الكاشف | التركيز النهائي |
| المخزن المؤقت التخفيف | الصوديوم دوديكيل سلفات (سدز) | 0.01٪ (ث / ت) |
| تريتون X-100 | 1.1٪ (v / v) | |
| حمض إثيلينديامينيتتراراسيتيك (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 | 1.2 ملم | |
| تريس-هكل درجة الحموضة 8.1 | 16.7 ملم | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | 167 مليمتر | |
| دما الحل | ثنائي ميثيل أديبيديت (دما) | 10 ملم |
| الفوسفات مخزنة المالحة (بس) | 1X | |
| شطف العازلة | كبريتات دوديسيل الصوديوم (سدز) | 1٪ (ث / ت) |
| حمض إثيلينديامينيتتراراسيتيك (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 | 10 ملم | |
| تريس-هكل الرقم الهيدروجيني 8.0 | 50 ملي | |
| عازلة عالية الملح | كبريتات دوديسيل الصوديوم (سدز) | 0.1٪ (ث / ت) |
| تريتون X-100 | 1٪ (v / v) | |
| Ethylenediamiنيتيتراسيتيك حمض (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 | 2 ملي | |
| تريس-هكل درجة الحموضة 8.1 | 20 ملي | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | 500 ملي | |
| إدم المتوسطة | تم تعديل إيسكوف المتوسطة دولبيكو (إدمم) | 1X |
| مصل بقري جنيني (فبس) | 2٪ (v / v) | |
| البنسلين / الستربتوميسين | 1X | |
| بيبتون بريماتون | 0.3 ملغ / مل | |
| الأنسولين حل الإنسان | 4.8 مجم / مل | |
| الحد الأدنى الأساسية المتوسطة الأحماض الأمينية غير الضرورية (ميم نيا) | 1X | |
| ليكل العازلة الملح | كلوريد الليثيوم (ليكل) | 0.25 م |
| IGEPAL-CA630 | 1٪ (v / v) | |
| حمض إثيلينديامينيتتراراسيتيك (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 | 1 ملم | |
| تريس-هكل درجة الحموضة 8.1 | 10 ملم | |
| انخفاض الملح العازلة | كبريتات دوديسيل الصوديوم (سدز) | 0.1٪ (ث / ت) |
| تريتون X-100 | 1٪ (v / v) | |
| حمض إثيلينديامينيتتراراسيتيك (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 | 2 ملي | |
| تريس-هكل درجة الحموضة 8.1 | 20 ملي | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | 150 ملي | |
| بروتين A سيفاروس الخرز غسل العازلة | تريس-هكل الرقم الهيدروجيني 8.0 | 20 ملي |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | 500 ملي | |
| حمض إثيلينديامينيتتراراسيتيك (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 | 2 ملي | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (سدز) | 0.1٪ (ث / ت) | |
| IGEPAL-CA630 | 1٪ (v / v) | |
| سدز تحلل العازلة | كبريتات دوديسيل الصوديوم (سدز) | 1٪ (ث / ت) |
| Ethylenedi حمض أمينيتيتراسيتيك (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 | 10 ملم | |
| تريس-هكل درجة الحموضة 8.1 | 50 ملي | |
| تي العازلة | تريس-هكل الرقم الهيدروجيني 8.0 | 10 ملم |
| حمض إثيلينديامينيتتراراسيتيك (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 | 1 ملم |
الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة والوسيلة المستخدمة في هذا البروتوكول.
| على | إيقاف | |
| قوة الذروة | 150.0 | 2.5 |
| عامل واجب | 15.0 | 15.0 |
| دورة / انفجار | 500 | 500 |
| عدد الدورات | 28 | |
: كيب-together.within-بادج = "1"> الجدول 2: إعدادات القص المستخدمة في هذا البروتوكول . وقد تم تحسين هذه الظروف لخط الخلايا T- الماوس ناضجة.
| الجسم المضاد | المورد | كمية من الأجسام المضادة / إمونوبريسيبيتاتيون | كمية الخلايا / إمونوبريسيبيتاتيون | ظروف الغسيل |
| H3 | أبكام (ab1791) | 2.5 ملغ | 5 × 10 6 | مرة واحدة في المخزن المؤقت الملح المنخفض، مرتين في ارتفاع الملح العازلة، مرتين في ليكل العازلة الملح وثلاث مرات في تي العازلة |
| H3K4me1 | أبكام (ab8895) | 2.5 ملغ | 5 × 10 6 | مرة واحدة في المخزن المؤقت الملح المنخفض، مرتين في ارتفاع الملح العازلة، مرتين في ليكل العازلة الملح وثلاث مرات في تي العازلة |
| H3K4me3 | دياجينود (باب-003-050) | 2.5 ملغ | 5 × 10 6 | مرة واحدة في المخزن المؤقت الملح المنخفض، مرتين في ارتفاع الملح العازلة، مرتين في ليكل العازلة الملح وثلاث مرات في تي العازلة |
| H3K27ac | دياجينود (باب-174-050) | 2.5 ملغ | 5 × 10 6 | أوس في انخفاض الملح العازلة، مرتين في ارتفاع الملح العازلة، مرتين في ليكل العازلة الملح وثلاث مرات في تي العازلة |
| مفتش | دياجينود (C15410206) | متغير* | متغير* | متغير* |
| * في حالة السيطرة مفتش، وكمية كل من الأجسام المضادة والخلايا، وكذلك خطوات الغسيل، يجب أن تعكس ظروف إمونوبريسيبيتاتيونس أخرى. | ||||
الجدول 3: الأجسام المضادة وظروف الغسيل المستخدمة في هذه الدراسة.
| جينة | التمهيدي إلى الأمام | عكس التمهيدي | مسبار |
| المروج غابد (0 كب) | 5'-غ تك كتا تا آتا كغغ أكت غ-3 ' | 5'-كتغ غسا كتغ كاك عغ آغ A-3 ' | 68 |
| محسن Dtx1 (+26 كيلوبايت) | 5'-كتك تغت غت غتا غ غاك أغ-3 ' | 5'-غسا تغغ غا كتغ تغت تاك أغا A-3 ' | 27 |
| الصحراء الجينية | 5'-كا أغك أتغ غت سكا غات ت-3 ' | 5'-أت غك أسغ غا غتا غغ كت-3 ' | 94 |
الجدول 4: الاشعال والمسبار المستخدمة ل قر في هذه الدراسة.
| مشكلة | الأسباب | حل |
| كروماتين تحت القص وشظايا كبيرة جدا. | تم استخدام عدد كبير جدا من الخلايا. | تقليل عدد الخلايا. |
| القص منخفض جدا. | زيادة عدد دورات القص. | |
| زيادة قوة ذروة القص، عامل واجب و / أو دورات / انفجار. | ||
| الكروماتين هو أكثر من القص وشظايا صغيرة جدا. | تم استخدام عدد قليل جدا من الخلايا. | زيادة عدد الخلايا. |
| القص مرتفع جدا. | تقليل عدد دورات القص. | |
| الحد من قوة الذروة القص، عامل واجب و / أو دورات / انفجار. | ||
| الانتعاش منخفض جدا على Iغ السيطرة و / أو السيطرة السلبية (خلفية عالية). | لا يكفي لونين المستخدمة في التجربة. | زيادة كمية من لونين. |
| كمية الأجسام المضادة منخفضة جدا. | زيادة كمية الأجسام المضادة. | |
| كمية الأجسام المضادة مرتفعة جدا. | تقليل كمية الأجسام المضادة. | |
| الجسم المضاد لديه خصوصية منخفضة. | تغيير الأجسام المضادة. | |
| ظروف الغسيل صارمة جدا. | تقليل عدد الغسيل. | |
| تقليل صرامة مخازن الغسيل. | ||
| ظروف الغسيل ليست صارمة بما فيه الكفاية. | زيادة عدد الغسيل. | |
| زيادة صرامة مخازن الغسيل. | ||
| وكان بيبيتد الكثير من الحمض النووي في قر. | تقليل كمية بيبيتد الحمض النووي في قر. | |
| شروط قر ليست الأمثل. | تحسين الظروف قر. | |
| تقليل عدد الدورات. | ||
| لا يوجد منتج أو منتج منخفض جدا في تفاعل قر لعينة المدخلات. | لم يكن هناك ما يكفي من الحمض النووي بيبيتد في قر. | زيادة كمية بيبيتد الحمض النووي في قر. |
| شروط قر ليست الأمثل. | تحسين الظروف قر. | |
| زيادة عدد الدورات. | ||
| لا يكفي لونين المستخدمة في التجربة. | زيادة كمية من لونين. | |
| لا توجد إشارة في السيطرة الإيجابية و / أو panH3 رقاقة. | لا يكفي لونين المستخدمة في التجربة. | زيادة كمية من لونين. |
| كمية الأجسام المضادة منخفضة جدا. | زيادة كمية الأجسام المضادة. | |
| مكافحةالجسم لديه خصوصية منخفضة. | تغيير الأجسام المضادة. | |
| شطف هو دون المستوى الأمثل. | تأكد من دوامة في كثير من الأحيان عينات للحفاظ على الخرز في الحل. |
الجدول 5: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Discussion
تشيب هو تقنية صالحة للتحقيق في ما إذا كانت البروتينات أو بتمس لها إثراء في مناطق الجينومية محددة. نتائج فحص رقاقة غالبا ما تكون صعبة للتفسير لأسباب بيولوجية أو فنية. الأسباب البيولوجية كثيرة و تشمل ضعف أو غير مباشر ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي. وهناك أيضا قيود تقنية، مثل خصوصية الأجسام المضادة محدودة وتحلل الخلايا غير فعالة أو القص الكروماتين. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها ( الجدول 5 ) يمكن أن تساعد القارئ على حل المشاكل التي قد تواجهها مع المقايسات رقاقة.
هذا البروتوكول، والاستفادة من جهاز أولتراسونيكاتور تركز التبريد، يسمح واحد لكفاءة القص لونين من ناضجة الماوس T- خط الخلية. وتتمثل الخطوة الحاسمة الرئيسية للبروتوكول من قبل القص من لونين، والتي يجب دائما أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا. ويقترح لتغيير عدد الخلايا وعدد دورات سونيكيشن. وعلاوة على ذلك، وقالت انها أرينغ الكفاءة يتأثر سلبا وجود سدز يترسب في العينات، والتي قد تشكل خلال تحلل الخلايا على الجليد مع سدز تحلل العازلة. في هذه الحالة، فمن الأفضل لاحتضان العينة بعد تحلل في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق للحد من وجود رواسب سدز. فمن المستحسن لتحسين البروتوكول للحصول على شظايا مقطوعة بين 200 و 500 نقطة في البوصة وتقييم دائما جودة القص من العينات قبل الشروع في مناعي. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الأمثل الوقت التثبيت، وكمية من الأجسام المضادة و / أو الخلايا، وظروف الغسيل الأمثل لكل الأجسام المضادة.
خطوة واحدة أكثر أهمية في اتخاذ إجراء رقاقة ناجحة هو اختيار الأجسام المضادة، والأجسام المضادة منخفضة النوعية تقلل بشكل كبير من كفاءة إمونوبريسيانتاتيون. سابقا، يسمح إجراء اختبار الجودة موحدة لتقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة في السوق سس = "كريف"> 19. واستند خط أنابيب الفرز على لطخة نقطة، وصمة عار الغربية، و تشيب، وتوفير قائمة من الكواشف عالية الجودة مناسبة ل تشيب 19 . في الآونة الأخيرة، تم تقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا باستخدام عالية الكثافة هيستون الببتيد ميكروأري منصات، مما يسمح لإنشاء قاعدة بيانات حول خصوصية الأجسام المضادة 20 . يمكن للقارئ استخدام هذه الأداة المفيدة لتحديد الأجسام المضادة الأكثر تحديدا التي يمكن استخدامها لتجارب رقاقة.
لم يتم اختبار هذا البروتوكول لخلايا T الأولية، وفي هذه الحالة، يجب على القارئ الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة الأخرى التي تؤدي بنجاح رقاقة على خلايا T الأولية 3 ، 4 ، 21 . ومن الجدير بالذكر، وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لأداء رقاقة على السلف الفأر خط T- الخلية، وكذلك على خط الخلايا البطانية الماوس.
ove_content "> 5 × 10 6 خلايا ينبغي أن تستخدم لكل مناعي لتحليل علامات هيستون لأن هذا البروتوكول يمكن أيضا أن تكون مناسبة، مع بعض التحسين، لأداء رقاقة على تفس أو العوامل المساعدة، فمن الأفضل لزيادة عدد الخلايا المستخدمة في إمونوبريسيانتاتيون في هذه الحالات.من أجل الوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا لكل تجربة، يمكن تجميع أكثر أليكوتس من المحللة المقطوعة معا قبل تمييع لونين في المخزن المؤقت التخفيف.ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لأداء رقاقة على البروتينات الذاتية التي لا ترتبط مباشرة إلى الحمض النووي. في هذه الحالة، قد يكون مطلوبا تثبيت مسبق مع بروسلينكرز البروتين البروتين (على سبيل المثال، ديميثيل أديبيميديت، دما) (انظر الملحق ب لمزيد من المعلومات). كان أداء ناجح من رقاقة على العوامل المساعدة سابقا من خلال أوفيركسريسينغ البروتينات التي تنصهر إلى علامة البيوتين. في هذه الحالة، تم تنقية البروتين مع ستريبتافيدين-كونجوغاتيد الخرز المغناطيسي، و قبل تثبيت مع دما تم تنفيذ 22 .
Disclosures
ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نحن ممتنون ل P. كيس و T. شميدت-ول للمساعدة التقنية الممتازة. وقد حظي هذا العمل بدعم من منحة البحوث التعاونية TRR81 وبرنامج هيزنبرغ (بو 1639 / 5-1) التابع لمؤسسة البحوث الألمانية، وجمعية ماكس بلانك، و إكسك 294 في فرايبورغ، ومجموعة التميز لنظام القلب الرئوي (إكبس) في جيسن إلى مرض السل
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
- Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
- Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
- Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
- Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
- Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
- Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
- Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
- Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
- Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
- Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
- Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
- Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
- White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
- Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
- Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).
