Summary
A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.
Abstract
O aumento da evidência aponta para a autofagia como um processo regulatório crucial para preservar a homeostase do tecido. Sabe-se que a autofagia está envolvida no desenvolvimento e regeneração do músculo esquelético, e o processo autofágico foi descrito em várias patologias musculares e distúrbios musculares relacionados à idade. Um bloco recentemente descrito do processo autofágico que se correlaciona com o esgotamento funcional das células satélites durante o reparo muscular reúne a noção de que a autofagia ativa é acoplada à regeneração muscular produtiva. Estes dados revelam o papel crucial da autofagia na ativação das células satélites durante a regeneração muscular em condições normais e patológicas, como distrofias musculares. Aqui, fornecemos um protocolo para monitorar o processo autofágico no compartimento adulto da célula tronco muscular (MuSC) durante as condições regenerativas musculares. Este protocolo descreve a metodologia de instalação para realizar a imunofluorescência in situ de LC3, umaMarcador de utofagy e MyoD, um marcador de linhagem miogênica, em seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. A metodologia relatada permite monitorar o processo autofágico em um compartimento celular específico, o compartimento MuSC, que desempenha um papel central na orquestação da regeneração muscular.
Introduction
A regeneração muscular esquelética é o resultado da interação entre células estaminais adultas (células musculares de músculo, MuSCs) e outros tipos de células envolvidas no processo regenerativo. A homeostase muscular e a funcionalidade são mantidas pelos sinais combinados decorrentes do nicho muscular e das indicações sistêmicas 1 , 2 . Ao longo da vida, foram relatadas mudanças na funcionalidade MuSC, no nicho muscular e nas pistas sistêmicas, levando ao declínio das capacidades funcionais nos idosos 3 . Os MuSCs são definidos em um nicho abaixo da lâmina basal e, após lesão muscular, são ativados para reparar os músculos danificados 4 , 5 . Para garantir uma resposta regenerativa produtiva, é crucial que os MuSCs coordenem os diferentes processos necessários para a saída da quiescência, a auto-renovação e o estágio de expansão proliferativa seguiramPela diferenciação miogênica 6 . Nos idosos e nas doenças crônicas musculares, todas essas funções são comprometidas, levando a funcionalidades musculares alteradas 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
A macroautofagia (referida a seguir como autofagia) está emergindo como um processo biológico crucial essencial para preservar a homeostase dos tecidos 14 . O processo autofágico inclui mecanismos de tráfico, em que partes de citoplasma, organelas e proteínas são engrossadas em vesículas que eventualmente são degradadas através da via do lisossoma, promovendo a remoção de moléculas tóxicas e a reciclagem de macromoleCules. Isso fornece compostos ricos em energia para apoiar a adaptação das células e tecidos sob estresse ou outras condições adversas 15 , 16 . Juntamente com a sua atividade de sobrevivência celular, a autofagia também pode funcionar como indutor de morte celular, dependendo do contexto do tecido celular ( por exemplo, tecido normal versus câncer) e do tipo de estímulo de estresse 17 , 18 .
Evidências recentes indicam que a autofagia é necessária para manter a massa muscular e a integridade da miofibra 19 , 20 e foi relatada como prejudicada em diferentes distrofias musculares 21 , 22 , 23 , incluindo a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. Da mesma forma, uma redução progressiva do processo autofágico foi observada nos idosos 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , após perda de massa muscular (referida como sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e na sobrevivência de miofibra 38 .
Uma relação estreita entre a autofagia e o potencial regenerativo dos músculos esqueléticos foi antecipada por um estudo do laboratório de Wagers, que mostrou que uma restrição calórica aumenta a disponibilidade e a atividade de MuSC 39 . Isso nãoFoi ainda apoiada pela recente observação de que o eixo Foxo3-Notch ativa o processo autofágico durante a auto-renovação 40 e a transição MuSC do estado quiescente para o estado proliferativo 41 . Esses dados concordam com a redução progressiva da autofagia basal de MuSCs jovens e antigos e geriátricos, em associação com o declínio numérico e funcional de MuSCs durante o envelhecimento 42 .
Em um artigo recente, demonstramos uma estreita relação entre a autofagia e a regeneração muscular compensatória que distingue os estágios iniciais da progressão da DMD. Consequentemente, observamos um fluxo autofágico reduzido nos estágios posteriores da progressão da doença, quando a regeneração muscular é comprometida e a deposição de tecido fibrótico ocorre. Intrigantemente, mostramos que, em condições de regeneração, a autofagia é ativada nos MuSCs e que a modulação do processo autofágico afeta a ativação MuSC e o fuNação universal 30 .
No total, esses dados destacam a urgência de explorar o processo autofágico em MuSCs durante a regeneração muscular em condições normais e patológicas e ao longo da vida. Aqui, fornecemos um protocolo para monitorar o processo autofágico em MuSCs nas condições regenerativas musculares, realizando imunocoloração in situ para proteína 1A / 1B-cadeia leve 3 (LC3) associada a microtúbulos, um marcador de autofagia 43 e MyoD, um marcador de Linhagem miogênica, em seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. A metodologia relatada permite monitorar o processo autofágico em um compartimento celular específico, o MuSC, que desempenha um papel fundamental na orquesta da regeneração muscular.
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Protocol
Os ratos foram criados e mantidos de acordo com os procedimentos padrão das instalações de animais, e todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Garantia de Assistência Animal e pelo Comitê Ético de Pesquisa em Animais interno de acordo com o Ministério da Saúde italiano e cumprido o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório.
1. Lesão muscular e o bloco In-Vivo de Fluxo Autofágico
- Lesão muscular.
- Para induzir uma lesão aguda do músculo esquelético, injete 20 μL de cardiotoxina 10 μM (CTX) diretamente no músculo tibial anterior anterior (TA) de ratos C57BL / 6J de 2 meses que pesam aproximadamente 20 g. Use um número igual de machos e fêmeas. Use o membro contralateral imperturbável como controle.
NOTA: 10 μM de CTX em solução de cloreto de sódio a 0,9% devem ser filtrados (filtro PVDF de 0,22 μm) e armazenados a -20 ° C. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. - Usando um euSeringa nsulin com uma agulha de 30 G, injetar CTX no meio do TA. Para induzir uma lesão precisa no AT, assegure-se de que a agulha da seringa entre perto do tendão distal, com 5 mm de profundidade, do fundo para o topo do músculo ( Figura 1A ).
- Para induzir uma lesão aguda do músculo esquelético, injete 20 μL de cardiotoxina 10 μM (CTX) diretamente no músculo tibial anterior anterior (TA) de ratos C57BL / 6J de 2 meses que pesam aproximadamente 20 g. Use um número igual de machos e fêmeas. Use o membro contralateral imperturbável como controle.
- Bloqueio do fluxo autofágico em ratos não perturbados e feridos.
- Para avaliar o fluxo autofágico, 24 h Post-Injury (pi), administre 50 mg / kg de cloroquina (CLQ) a cada 24 h durante 4 dias por injeção intraperitoneal (IP) ( Figura 1B ).
- Dissolve CLQ (10 mg / mL) em PBS 1X e filtre-a através de uma membrana de 0,2 μm. Pesar todos os ratos e calcular a quantidade de CLQ para injetar.
NOTA: Prepare e use a solução CLQ no mesmo dia. O estoque CLQ pode ser armazenado por até um mês a -20 ° C. Uma vez que a autofagia é um processo relacionado ao metabolismo, sempre execute o tratamento CLQ sempre ao mesmo tempo (por exemplo, na manhã seguinteRe 10 AM).
- Dissolve CLQ (10 mg / mL) em PBS 1X e filtre-a através de uma membrana de 0,2 μm. Pesar todos os ratos e calcular a quantidade de CLQ para injetar.
- Para avaliar o fluxo autofágico, 24 h Post-Injury (pi), administre 50 mg / kg de cloroquina (CLQ) a cada 24 h durante 4 dias por injeção intraperitoneal (IP) ( Figura 1B ).
2. Seções de tecido muscular
- Sacrifício do rato.
- Eutanizar os ratos 5 dias após a lesão.
- Realize a eutanásia por luxação cervical ou por CO 2 (a seguir pela luxação cervical para confirmação). Uma vez que o processo de autofagia está relacionado aos hábitos de sono / alimentação do mouse, sempre sacrificar os ratos ao mesmo tempo, de preferência pela manhã ( ou seja, antes das 10:00 da manhã).
- Isolamento e inclusão de TA.
- Antes da dissecção, pulverize o mouse com etanol a 70%.
- O uso de tesoura faz uma pequena e perpendicular incisão (3 mm de comprimento) na pele dorsal do mouse ao nível dos quadris. Corte a cauda e os pés para simplificar a remoção da pele. Puxe a pele para a cauda e remova-a para expor os músculos subjacentes; O músculo TA é fácil de localizar, como mostrado na Figura 2A
- Com a ajuda de duas fórceps, aperte os tendões distal.
- Corte os tendões distal; Os tendões TA e extensor digitorium longus (EDL) são frequentemente cortados em conjunto e posteriormente separados (ver passo 2.2.6).
- Usando fórceps, segure o músculo TA pelo tendão e puxe cuidadosamente o músculo para a extremidade proximal (perto do joelho, Figura 2B ).
NOTA: Neste ponto, os músculos EDL e TA são facilmente reconhecíveis, sendo o TA maior e mais superficial do que o EDL. - Separe o TA do músculo EDL puxando os dois tendões distal nas direções opostas ( Figura 2C ).
- Corte o tendão proximal.
- Usando fórceps, remova a fáscia fina que cobre o músculo, sem danificar o tecido.
- Remova a umidade excessiva na amostra com a ajuda de uma toalha de papel. Certifique-se de que o músculo não esteja nem molhado, nem excessivamente seco, pois a umidade excessiva produzirá sigDano significativo ao músculo e compromete a próxima coloração.
- Coloque o composto Optimal Cutting Temperature (OCT) na parte inferior de um molde e coloque o músculo dentro dele, na orientação mostrada na Figura 2D . Adicione 100% de isopentano a um copo até atingir uma profundidade de aproximadamente 3-4 cm. Coloque o copo em contato com nitrogênio líquido em uma caixa de poliestireno.
- Não deixe o nitrogênio líquido entrar no copo, pois produzirá uma espuma borbulhante, o que pode afetar a inclusão e danificar as seções musculares.
- Observe o isopentano e aguarde até atingir a temperatura adequada (entre -140 ° C e -150 ° C); À temperatura apropriada, uma camada branca sólida de isopentano congelado cristaliza no fundo do copo.
- Se o isopentano congelar completamente o sólido, derreta-o e esfrie até a temperatura de congelação antes de prosseguir para o próximo passo.
- Usando fórceps pré-grelhados, delicadamente abaixe o molde emO isopentano por aproximadamente 20-30 s. Coloque a amostra congelada em um recipiente com gelo seco até que seja transferida para um congelador de -80 ° C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
- Criosecções de tecido muscular.
- Após pelo menos uma noite a -80 ° C, execute a criosecção.
- Pegue a faca criostática e a placa anti-rolo do congelador de -20 ° C e coloque-os nos respectivos suportes no gabinete do criostato.
- Coloque uma gota de OCT no talão da amostra e coloque sobre ela a amostra congelada, na orientação vertical NS, conforme visualizado na Figura 2D .
- Coloque o talão de amostra no mandril.
- Sem puxar o prato anti-rolo na faca, faça alguns cortes a 40 μm para se livrar de OCT que não inclui músculo. Quando o músculo se torna visível, reduza a espessura da fatia para 7-8 μm.
- Puxe para baixo a placa anti-roll até ficar alinhada comA ponta da faca ou um pouco acima dela.
- Corte as secções transversais de 7-8 μm de espessura e monte 3-4 fatias por lâmina histológica.
NOTA: A temperatura sugerida do criostato está entre -15 ° C e -23 ° C. As secções transversais das amostras são necessárias para a análise subsequente para identificar as células-tronco muscular na posição de nicho do satélite. - Para maximizar a aderência da seção, mantenha as lâminas à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos para evitar o seu desprendimento durante a incubação do anticorpo.
NOTA: O passo de secagem ao ar pode afetar a imunocoloração, proporcionando resultados ambíguos. Os slides podem ser armazenados sem fixação por vários meses a -80 ° C. O protocolo pode ser pausado aqui.
- Verificando danos musculares em criosecções de músculos TA ao realizar a coloração com hematoxilina eosina (H & E).
- Para avaliar a qualidade do músculo ( ou seja, a eficácia da lesão, isolamento muscular e inclusãoÍons e criosecções), realizam uma coloração H & E. Para cada ponto de tempo experimental, conserte um slide com 4% de PFA por 10 min. Após a fixação, lave bem as corrediças em várias mudanças de 1x PBS.
NOTA: Cuidado. O PFA é cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado. - Pegue um slide para cada ponto experimental e coloque-os em uma jarra de coloração.
- Encha o frasco com hematoxilina 9 g / L até as secções serem cobertas e incubar durante 8 min.
- Recicle a hematoxilina.
- Deixe o frasco sob água corrente durante 10 minutos para remover o excesso de hematoxilina.
NOTA: Certifique-se de não fluir a água diretamente para as seções. - Lavar com água esterilizada.
- Incubar as secções com eosina 0,5% (p / v) em etanol a 90% acidificado durante 1 min.
- Recicle a eosina.
- Lave duas vezes com água estéril por 3 minutos / lavagem.
NOTA: Execute as seguintes etapas em um capô químico. - Lave as secções com etanol a 70%.
- lavarAs seções com 90% de etanol.
- Lave as secções com 100% de etanol.
- Incube as secções com 0,879 g / mL de o-Xileno.
NOTA: Cuidado. O-Xileno é inflamável e moderadamente tóxico. Manipule-o sob uma capa química, usando equipamento de proteção, incluindo luvas, um bata de laboratório e uma máscara. - Recicle o o-Xileno.
- Coloque as lâminas sobre um pedaço de papel para secar.
- Feche os slides usando um meio de montagem com base em xileno rápido.
- Verifique a qualidade das seções sob um microscópio óptico com ampliação de 10X (veja a Figura 3 )
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
- Para avaliar a qualidade do músculo ( ou seja, a eficácia da lesão, isolamento muscular e inclusãoÍons e criosecções), realizam uma coloração H & E. Para cada ponto de tempo experimental, conserte um slide com 4% de PFA por 10 min. Após a fixação, lave bem as corrediças em várias mudanças de 1x PBS.
3. Imunomarcação para LC3 e MyoD em seções de tecido muscular ferido
- Fixação de seções de tecido muscular.
- Prepare uma câmara de incubação molhando um pedaço de papel e colocando-o no fundo de uma caixa de plástico fechável para manter um altoVelocidade de umidade dentro da câmara. Corrigir seções de tecido com 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS durante 10 min.
NOTA: Um pedaço de papel molhado é usado para evitar a secagem da amostra. Prepare PFA fresco ou use PFA armazenado a -20 ° C. Cuidado. PFA é tóxico; O pó deve ser manuseado com cuidado ao fazer a solução de estoque. Esta operação deve ser realizada em um capô químico, com equipamento de proteção, incluindo luvas, um bata de laboratório e uma máscara. Além disso, quando em solução, o PFA deve ser manipulado com cuidado. - Remova o PFA e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3 vezes.
- Prepare uma câmara de incubação molhando um pedaço de papel e colocando-o no fundo de uma caixa de plástico fechável para manter um altoVelocidade de umidade dentro da câmara. Corrigir seções de tecido com 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS durante 10 min.
- Permeabilização de seções de tecido muscular.
- Desenhe uma barreira hidrofóbica em torno das seções de tecido usando uma caneta pap.
NOTA: Este passo define a superfície ao redor das seções de tecido e minimiza o volume de anticorpos descritos nas etapas 3.4, 3.6, 3.7 e 3.9. - Cubra as secções com 200 μL de frio (-20 ° C)Metanol e coloque a câmara de incubação horizontalmente dentro de um congelador a -20 ° C durante 5 min.
- Retire a câmara de incubação do congelador, aspirar o metanol e lave as secções com 1X PBS durante 5-7 minutos à TA; Repita este passo 3x.
- Desenhe uma barreira hidrofóbica em torno das seções de tecido usando uma caneta pap.
- Bloqueio
- Prepare uma solução de bloco fresco de 4% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS 1x.
NOTA: A solução BSA pode ser armazenada durante 1 semana a 4 ° C. - Incube as secções com solução de bloqueio durante pelo menos 60 minutos à RT.
- Remova a solução de bloqueio.
- Prepare 100 μL de mistura anti-Fab diluyendo 20 μg / mL anti-Fab em 1x PBS. Incubar as secções com um fragmento F (ab) purificado por afinidade não conjugado de IgG anti-ratinho durante 1 h à TA.
- Prepare uma solução de bloco fresco de 4% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS 1x.
- Incubação primária de anticorpos.
- Prepare 100 μL de mistura primária de anticorpos para cada lâmina, dissolvendo os anticorpos LC3 e MyoD em 4% de BSA em 1x PBS. Use 5 μg /ML de anti-LC3 (anticorpo policlonal de coelho) e 10 mg / L de anti-MyoD (anticorpo monoclonal de rato). Incubar a mistura primária de anticorpos durante a noite a 4 ° C.
- Lavagens.
- Remova a mistura primária de anticorpos.
- Lavar as secções com 1% de BSA em 1X PBS durante 10 min; Repita este passo 3x.
- Incubação secundária de anticorpos.
- Prepare 100 μL de mistura de anticorpos secundários para cada lâmina. Dissolver 488 de cabra anti-coelho (5 μg / mL) e 594 de cabra anti-ratinho (5 μg / mL) em BSA a 4% em 1x PBS.
NOTA: Evite a exposição excessiva à luz para evitar o branqueamento com fluorochrome. Execute as seguintes etapas no escuro. - Incubar as secções com a mistura de anticorpos secundário durante 45 minutos à TA.
- Remova a mistura de anticorpos secundários e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x.
- Prepare 100 μL de mistura de anticorpos secundários para cada lâmina. Dissolver 488 de cabra anti-coelho (5 μg / mL) e 594 de cabra anti-ratinho (5 μg / mL) em BSA a 4% em 1x PBS.
- Incubação primária de anticorpos.
- Diluir laminiAnticorpo monoclonal n-2 (cadeia α-2) (0,33 μg / mL) em BSA a 4% em 1x PBS usando 100 μL de mistura para cada slide. Incubar as secções na mistura de anticorpos primários durante 1-2 h à TA.
- Lavagens.
- Remova a mistura primária de anticorpos.
- Lavar as secções com 1% de BSA em 1X PBS durante 10 min; Repita este passo 3x.
- Incubação secundária de anticorpos.
- Prepare 100 μL de mistura de anticorpos secundários para cada lâmina diluyendo 647 de cabra anti-rato (5 μg / mL) em BSA a 4% em PBS 1X. Incubar as secções na mistura de anticorpos secundários durante 45 minutos à TA.
- Remova a mistura de anticorpos secundários e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x.
- 4 ', 6-Diamidino-2-fenilindole (DAPI).
- Adicione 200 μL de solução de DAPI 300 nM em 1x PBS a cada slide. Incubar durante 5 min à TA. Armazene a solução DAPI a 4 ° C noSombrio.
- Lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x.
- Montagem de seções musculares coradas.
- Remova o excesso de solução de lavagem das seções.
- Coloque 10 μL de glicerol em 1x PBS (3: 1) nas secções coradas no meio do slide e adicione um lamínula, evitando a formação de bolhas de ar.
4. Aquisição de microscopia confocal
- Adquira as imagens usando um microscópio confocal de quatro laser integrado com um sistema de captura de imagem e software analítico.
NOTA: MyoD é conjugado com um corante 594 que é um corante fluorescente vermelho brilhante, com excitação ideal para o laser de 594 nm (excitação: 590 nm, emissão: 617 nm). LC3 é conjugado com um corante 488 que é um corante fluorescente verde brilhante, com excitação ideal para a linha laser de 488 nm (excitação: 495 nm, emissão: 519 nm). Laminin é conjugado com um corante 647 que éUm corante brilhante fluorescente far-vermelho, com excitação ideal para a linha a laser de 647 nm (excitação: 650 nm, emissão: 668 nm). - Coloque os slides na bandeja do microscópio e use a ampliação 63X para detectar sinais nucleares. Concentre-se manualmente nas áreas regenerativas centrando os campos de regeneração ativa, confiando na morfologia muscular (veja a Figura 4 ).
NOTA: Enquanto o músculo não perturbado, o tamanho da miofibra é praticamente constante ( Figura 4A ), a regeneração muscular mediada por lesões pode ser reconhecida pela aparência de miofibras menores, que são as fibras recém formadas após a regeneração. Além disso, o músculo na regeneração ativa é caracterizado por um extenso infiltrado que é feito de macrófagos, precursores fibro-adipogênicos e células que estão localizados nos músculos danificados para orquestrar a regeneração muscular ( Figura 4B ). - Avaliar a coloração imunofluorescente em regenOcupando áreas focadas em MuSCs que estão localizados sob a lâmina basal das miofibras.
- Concentre-se em MuSCs que são positivos para a coloração MyoD e posicionados dentro das miofibras marcadas pela coloração de laminina (ver Figura 4B , setas brancas).
- Use pelo menos 3 ratos / grupo experimental e use o microscópio para adquirir imagens de ampliação 63X de pelo menos 7 campos para cada grupo experimental.
- Uma vez identificadas as áreas regenerativas, concentre-se na coloração DAPI e, em seguida, ajuste os outros canais individuais.
- Use as seguintes configurações de microscópio: Canal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Canal A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Canal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719.
- Depois de ajustar o foco dos canais individuais, proceda a adquirir as imagens com um tamanho de quadro de 1.024 x 1.024 e uma ocupação de pixels de 12,61 μs.
- Contagem da porcentagem de células MyoD-positivas (controle para tEle correta localização sob a lâmina) que são LC3-negativos e a porcentagem de células MyoD-positivas que exibem um sinal LC3.
NOTA: A porcentagem de células positivas para MyoD que exibem coloração LC3 é a leitura deste protocolo.
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Representative Results
Este protocolo descreve um método in situ eficiente para detectar autofagia em MuSCs durante a regeneração muscular.
Tratamentos CTX In Vivo :
Use CTX para induzir danos musculares nos músculos TA e use músculos não perturbados como controles. Uma vez que a autofagia é altamente dinâmica, bloqueie o fluxo autofágico realizando injeções IP de CLQ ( Figura 1 ). O tratamento CLQ é essencial para avaliar se o fluxo autofágico é ativo ou é mantido em níveis basais.
Isolamento anterior de Tibialis:
Isolar o músculo TA, conforme descrito na Figura 2 , e colocá-lo em uma câmara de molde na orientação NS para posteriormente obter seções transversais do tecido muscular. Este passoÉ crucial para alcançar seções e para identificar MuSCs na localização adequada abaixo da lâmina basal de miofibra.
Exame histológico de dano muscular induzido por CTX
Verifique se a lesão muscular ocorreu realizando coloração histológica. Execute a coloração H & E e verifique a ampliação de 10X: enquanto os músculos não perturbados exibem tamanhos de miofibras geralmente invariáveis, as características típicas dos músculos lesados incluem a interrupção das miofibras que são de tamanho diferente e infiltrado inflamatório abundante. Outro parâmetro para confirmar que o processo regenerativo está ocorrendo é a centro-nucleação das miofibras, que está ausente em músculos não imperturbados e é um sinal da formação de novas fibras em camundongos submetidos à regeneração ativa ( Figura 3 ).
Autophagy é acoplado a MyoD-poCélulas sensíveis durante a regeneração muscular:
Execute a coloração imunofluorescente para detectar MuSCs, identificados como MyoD-positivos, que exibem um sinal LC3. A coloração de Laminin é útil para localizar MuSCs na posição adequada no nicho abaixo da lâmina basal ( Figura 4 ). Os níveis basais autofágicos distinguem os músculos esqueléticos não perturbados e aumentam significativamente em coincidência com a regeneração muscular 30 . Conseqüentemente, ratos não feridos não mostram nenhuma ativação MuSC, detectada pela ausência de células MyoD positivas e sem sinal LC3. Por outro lado, após danos musculares, os MuSCs positivos para MyoD tornam-se positivos para LC3, demonstrando que o processo autofágico é ativado durante a regeneração muscular em células satélites ativadas.
Durante os estágios iniciais da resposta regenerativa, diferentes tipos celulares se localizam no site de tA lesão, incluindo células inflamatórias e precursores fibro-adipogênicos, tornando a área lesada densamente superlotada. É crucial distinguir entre todos os diferentes tipos de celular, focando a localização do MuSC debaixo da lâmina de miofibra e confiando na positividade do MyoD.
Em condições basais, a LC3 é expressa de forma ubíqua e é pouco detectada por imunofluorescência. Como resultado de autofagia elevada, esse padrão de coloração muda e se torna detectável principalmente no citoplasma. Ao avaliar a coloração MyoD / LC3, considere que os muSCs são células pequenas e que a região citoplasmática é limitada; Por isso que LC3 pode parecer perinuclear.
Figura 1: Tratamentos CTX In Vivo . ( A ) Para induzir dano muscular, injete 10 μL de 10 μM de direção CTXTight nos músculos TA esquerdos dos ratos WT de 2 meses de idade. Use o membro contralateral como controle. ( B ) Representação esquemática da lesão muscular induzida por cardiotoxina. 24 h pós-lesão, trate os ratos com injeções intraperitoneais de 50 mg / kg CLQ a cada 24 h por 4 dias e depois sacrificar os animais. Use ratos não feridos e não tratados como controles. Este protocolo permite o estudo do envolvimento do processo autofágico durante a regeneração muscular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolamento TA. ( A ) Imagem representativa da TA como parece antes do isolamento. ( B ) Depois de cortar o tendão distal, segure o músculo TA pelo tendão e cuidePuxe o músculo até a extremidade proximal (perto do joelho). ( C ) Discriminar a EDL do músculo TA, que é maior e mais superficial do que a EDL. Separe o TA do músculo EDL puxando os dois tendões distal em direções opostas. ( D ) Uma vez que o TA está isolado, coloque-o na câmara do molde, conforme descrito, na orientação NS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: CTX induz o dano muscular. Imagens representativas da coloração de H & E em seções de tecido transversal de TA de controles, não feridos ( A ) e 5 d pi ( B ) WT ratinhos. A coloração de H & E revela a morfologia de fibra normal em ratos de controle ( A ) e massivDano muscular e infiltrado nos músculos lesados ( B ), demonstrando uma morfologia alterada após a injeção de CTX. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Autofagia é acoplada às células MyoD-positivas durante a regeneração muscular. Imagens representativas de secções TA do controle ( A ) e do vírus ( B ) de camundongos WT imunossignados com LC3 (verde) e MyoD (vermelho). A corante de laminina (cian) marca fibras musculares e os núcleos são contrastados com DAPI (branco). Os painéis certos mostram imagens representativas do sinal de fusão. As setas brancas indicam células satélites que estão abaixo da lâmina basal da fibra marcada pela coloração de laminina. O seguimentoO protocolo ng permite a medição de autofagia através de coloração LC3 em células tronco muscular submetidas a linhagem miogênica, marcada por MyoD. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve como monitorar a autofagia nas células-tronco do músculo esquelético durante a regeneração muscular compensatória. Vários anticorpos para co-coloração de LC3 e MyoD foram testados, e aqueles que trabalham em seções de tecido de mouse e criam resultados bem-sucedidos estão listados aqui (ver Tabela de Materiais ). A permeabilização com metanol (ver passo 3.2.2) é altamente recomendável para coloração bem sucedida.
A limitação deste protocolo está ligada à variabilidade intrínseca dos camundongos, o que obriga o uso de pelo menos 3 ratos / grupo experimental. Esta metodologia reflete um passo adiante no estudo da autofagia durante a regeneração do músculo esquelético, como a maioria dos resultados Até agora foram feitas em células isoladas. A análise in situ permitiu o estudo da autofagia no ambiente natural, sem a necessidade de isolamento celular que possa afetar os processos metabólicos, como a autofagia.
"Devido à natureza altamente dinâmica do processo autofágico, os tratamentos CLQ são um passo crítico para monitorar o processo autofágico in vivo. CLQ bloqueia os estágios posteriores do processo autofágico, levando ao acúmulo LC3 quando a autofagia é sustentada. Portanto, o tratamento CLQ Torna o LC3 detectável por exame in situ . Nos músculos esqueléticos não perturbados, o processo autofágico basal não é aumentado pelo tratamento CLQ, como revelado pela ausência de acumulação LC3 detectável. No entanto, nos músculos regeneradores, o LC3 se acumula após o tratamento CLQ, demonstrando ativação autofágica . Um passo crítico é sacrificar os ratos ao mesmo tempo pela manhã ( ou seja, às 10 horas). Outro passo crítico no protocolo é a identificação do MuSC, que não deve ser trocado com outro tipo celular que preenche o músculo danificado durante a Resposta regenerativa. A identificação de MuSCs sob a lâmina basal que exibe a positividade de MyoD é o kEy para se concentrar em células de satélite.Em resumo, apresentamos um método in situ adequado para detectar o envolvimento do processo autofágico em MuSCs. Esta técnica pode servir de base para testes de abordagens farmacológicas para a modulação de autofagia, o que pode ser usado para melhorar a regeneração do músculo esquelético em condições normais e patológicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT para LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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