Summary
Aktive Autophagie ist mit produktiven Muskelregeneration verbunden, die für die Muskelstammzell-Aktivierung (MuSC) essentiell ist. Hier stellen wir ein Protokoll für die in situ- Detektion von LC3, einen Autophagie-Marker in MyoD-positiven MuSCs von Muskelgewebeabschnitten von Kontroll- und verletzten Mäusen zur Verfügung.
Abstract
Zunehmende Beweise weisen auf Autophagie als einen entscheidenden regulatorischen Prozess zur Erhaltung der Gewebshomöostase. Es ist bekannt, dass Autophagie an der Skelettmuskelentwicklung und -regeneration beteiligt ist und der autophagische Prozess in mehreren Muskelpathologien und altersbedingten Muskelstörungen beschrieben wurde. Ein kürzlich beschriebener Block des autophagischen Prozesses, der mit der funktionellen Erschöpfung von Satellitenzellen während der Muskelreparatur korreliert, unterstützt die Vorstellung, dass aktive Autophagie mit einer produktiven Muskelregeneration gekoppelt ist. Diese Daten zeigen die entscheidende Rolle der Autophagie bei der Aktivierung von Satellitenzellen während der Muskelregeneration sowohl bei normalen als auch bei pathologischen Zuständen wie Muskeldystrophien. Hier stellen wir ein Protokoll zur Überwachung des autophagischen Prozesses im erwachsenen Muskelstammzell (MuSC) -Feld während Muskelregenerationsbedingungen zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt die Setup-Methodik zur Durchführung in situ Immunfluoreszenz-Bildgebung von LC3, aUtophagie-Marker und MyoD, eine myogene Linie Marker, in Muskelgewebe Abschnitte von der Kontrolle und verletzte Mäuse. Die beschriebene Methodik ermöglicht die Überwachung des autophagischen Prozesses in einem bestimmten Zellkompartiment, dem MuSC-Kompartiment, das eine zentrale Rolle bei der orchestrierenden Muskelregeneration spielt.
Introduction
Die Skelettmuskelregeneration ist das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen adulten Stammzellen (Muscle Satellite Cells, MuSCs) und anderen Zelltypen, die am regenerativen Prozess beteiligt sind. Die Muskelhomöostase und die Funktionalität werden durch die kombinierten Signale, die sich aus der Muskelnische und den systemischen Cues 1 , 2 ergeben, aufrechterhalten. Im Laufe des Lebens wurden Veränderungen in der MuSC-Funktionalität, der Muskelnische und den systemischen Stichworten berichtet, was zu einem Rückgang der funktionalen Kapazitäten bei älteren Menschen führte. MuSCs werden in eine Nische unterhalb der Basallamina gesetzt und bei Muskelverletzungen aktiviert, um beschädigte Muskeln 4 , 5 zu reparieren. Um eine produktive regenerative Reaktion zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass MuSCs verschiedene Prozesse koordinieren, die für den Ausstieg aus der Ruhe, die Selbsterneuerung und die proliferative Expansionsstufe erforderlich sindDurch die myogene Differenzierung 6 . Bei älteren und bei muskulären chronischen Erkrankungen werden alle diese Funktionen kompromittiert, was zu einer veränderten Muskelfunktionalität 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 führt .
Makroautophagie (nachstehend als Autophagie bezeichnet) entsteht als ein entscheidender biologischer Prozess, der für die Erhaltung der Gewebshomöostase unerlässlich ist. Der autophagische Prozess schließt Handlungsmechanismen ein, bei denen Teile von Zytoplasma, Organellen und Proteinen in Vesikel verschlungen werden, die schließlich über den Lysosomweg abgebaut werden, wodurch die Entfernung von toxischen Molekülen und das Recycling von Makromol gefördert wirdCules Dies liefert energiereiche Verbindungen zur Unterstützung der Zell- und Gewebeanpassung unter Stress oder anderen ungünstigen Bedingungen 15 , 16 . Zusammen mit seiner Zell-Überlebensaktivität kann Autophagie auch als Zell-Todes-Induktor arbeiten, je nach Zellgewebe-Kontext ( z. B. normales gegen Krebsgewebe) und der Art des Stressreizes 17 , 18 .
Der jüngste Beweis deutet darauf hin, dass Autophagie erforderlich ist, um die Muskelmasse und die Myofaser-Integrität 19 , 20 aufrechtzuerhalten und wurde in verschiedenen Muskeldystrophien 21 , 22 , 23 , einschließlich Duchenne Muskeldystrophie (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , beeinträchtigt , 28 , 29 , 30. Ebenso wurde bei einem älteren 31 , 32 , 33 , 34 , 35 eine fortschreitende Reduktion des autophagischen Prozesses nach einem Verlust der Muskelmasse (bezeichnet als Sarkopenie) 32 , 33 , 34 beobachtet , 35 , 36 , 37 und im Überleben von Myofiber 38 .
Eine enge Beziehung zwischen Autophagie und dem regenerativen Potenzial der Skelettmuskulatur wurde von einer Studie aus dem Labor von Wagers erwartet, die zeigte, dass eine Kalorienrestriktion die Verfügbarkeit und Aktivität von MuSC erhöht. Dieses neinWurde durch die jüngste Beobachtung weiter unterstützt, dass die Foxo3-Notch-Achse den autophagischen Prozess während der Selbsterneuerung 40 und den MuSC-Übergang vom Ruhe- zum Proliferationszustand 41 aktiviert. Diese Daten stimmen mit der fortschreitenden Verringerung der Basalautophagie von jungen zu alten und geriatrischen MuSCs in Verbindung mit dem numerischen und funktionalen Abfall der MuSCs während des Alterns überein 42 .
In einer neueren Arbeit zeigten wir eine enge Beziehung zwischen Autophagie und der kompensatorischen Muskelregeneration, die die frühen Stadien der DMD-Progression unterscheidet. Dementsprechend beobachteten wir einen reduzierten autophagischen Fluss bei späteren Stadien des Krankheitsverlaufs, wenn die Muskelregeneration beeinträchtigt ist und eine fibrotische Gewebeablagerung auftritt. Faszinierend zeigten wir, dass in regenerierenden Zuständen Autophagie in MuSCs aktiviert wird und dass die Modulation des autophagischen Prozesses die MuSC-Aktivierung und fu beeinflusstNktionalität 30
Insgesamt zeigen diese Daten die Dringlichkeit, den autophagischen Prozess in MuSCs während der Muskelregeneration in normalen und pathologischen Zuständen und während der gesamten Lebensdauer zu erforschen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Überwachung des autophagischen Prozesses in MuSCs in Muskelregenerationsbedingungen durch die Durchführung von in situ Immunfärbung für Mikrotubuli-assoziiertes Protein 1A / 1B-leichte Kette 3 (LC3), ein Marker von Autophagie 43 und MyoD, ein Marker von Myogene Abstammung, in Muskelgewebeabschnitten von der Kontrolle und verletzten Mäusen. Die genannte Methodik ermöglicht die Überwachung des autophagischen Prozesses in einem bestimmten Zellkompartiment, dem MuSC, das eine Schlüsselrolle bei der Orchestrierung der Muskelregeneration spielt.
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Protocol
Die Mäuse wurden nach den üblichen Tierfunktionsverfahren gezüchtet und gepflegt, und alle experimentellen Protokolle wurden von der Tierschutzversicherung und dem internen Tierforschungsethical Committee nach dem italienischen Gesundheitsministerium genehmigt und dem NIH Guide für die Pflege und Verwendung von Labortiere.
1. Muskelverletzung und der In-vivo- Block des autophagischen Flusses
- Muskelverletzung.
- Um eine akute Skelettmuskelverletzung zu induzieren, injizieren Sie 20 μl 10 μM Cardiotoxin (CTX) direkt im linken Tibialis anterior (TA) Muskel von 2 Monate alten C57BL / 6J Mäusen, die etwa 20 g wiegen. Verwenden Sie eine gleiche Anzahl von Männern und Frauen. Benutzen Sie das ungestörte kontralaterale Glied als Kontrolle.
HINWEIS: 10 μM CTX in 0,9% Natriumchloridlösung sollte filtriert werden (0,22 μm PVDF-Filter) und bei -20 ° C gelagert. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. - Mit einem iNsulin-Spritze mit einer 30 G-Nadel, injizieren CTX in der Mitte der TA. Um eine genaue Verletzung in der TA zu induzieren, stellen Sie sicher, dass die Nadel der Spritze in die Nähe der distalen Sehne, 5 mm tief, von der Unterseite bis zur Oberseite des Muskels eintritt ( Abbildung 1A ).
- Um eine akute Skelettmuskelverletzung zu induzieren, injizieren Sie 20 μl 10 μM Cardiotoxin (CTX) direkt im linken Tibialis anterior (TA) Muskel von 2 Monate alten C57BL / 6J Mäusen, die etwa 20 g wiegen. Verwenden Sie eine gleiche Anzahl von Männern und Frauen. Benutzen Sie das ungestörte kontralaterale Glied als Kontrolle.
- Blockade des autophagischen Flusses in ungestörten und verletzten Mäusen.
- Zur Beurteilung des autophagischen Flusses, 24 h Post-Injury (pi), verabreichen Sie 50 mg / kg Chloroquin (CLQ) alle 24 h für 4 d durch intraperitoneale (IP) Injektion (Abbildung 1B ).
- CLQ (10 mg / ml) in PBS 1X auflösen und durch eine 0,2 μm Membran filtrieren. Wiegen Sie jede Maus und berechnen Sie die Menge an CLQ zu injizieren.
HINWEIS: Vorbereitung und Verwendung der CLQ-Lösung am selben Tag. CLQ-Lager kann bis zu einem Monat bei -20 ° C gelagert werden. Da Autophagie ist ein Stoffwechsel-Prozess, immer immer CLQ Behandlung immer zur gleichen Zeit ( dh am Morgen befoRe 10 Uhr).
- CLQ (10 mg / ml) in PBS 1X auflösen und durch eine 0,2 μm Membran filtrieren. Wiegen Sie jede Maus und berechnen Sie die Menge an CLQ zu injizieren.
- Zur Beurteilung des autophagischen Flusses, 24 h Post-Injury (pi), verabreichen Sie 50 mg / kg Chloroquin (CLQ) alle 24 h für 4 d durch intraperitoneale (IP) Injektion (Abbildung 1B ).
2. Muskelgewebeabschnitte
- Mausopfer.
- Euthanize die Mäuse 5 Tage nach der Verletzung.
- Euthanasie durch zervikale Versetzung oder durch CO 2 durchführen (gefolgt von zervikaler Versetzung zur Bestätigung). Da der Autophagie-Prozess mit der Maus schläft / Essgewohnheiten verwandt ist, immer die Mäuse gleichzeitig opfern, vorzugsweise am Morgen ( dh vor 10 Uhr).
- TA Isolierung und Einbeziehung.
- Vor der Dissektion die Maus mit 70% Ethanol sprühen.
- Mit Schere machen einen kleinen, senkrechten Einschnitt (3 mm lang) auf die dorsale Haut der Maus auf der Ebene der Hüften. Schneiden Sie den Schwanz und die Füße, um die Hautentfernung zu vereinfachen. Ziehen Sie die Haut in Richtung Schwanz und entfernen Sie sie, um die darunter liegenden Muskeln auszusetzen. Der TA-Muskel ist leicht zu lokalisieren, wie in Abbildung 2A gezeigt
- Mit Hilfe von zwei Pinzetten greifen die distalen Sehnen.
- Schneide die distalen Sehnen; Die TA- und extensor digitorium longus (EDL) Sehnen werden oft gemeinsam geschnitten und später getrennt (siehe Schritt 2.2.6).
- Mit der Pinzette den TA-Muskel an der Sehne halten und den Muskel vorsichtig zum proximalen Ende hinaufziehen (in der Nähe des Knies, Abb. 2B ).
HINWEIS: An diesem Punkt sind die EDL- und TA-Muskeln leicht erkennbar, die TA ist größer und oberflächlicher als die EDL. - Trennen Sie den TA vom EDL-Muskel, indem Sie die beiden distalen Sehnen in die entgegengesetzten Richtungen ziehen (Abbildung 2C ).
- Schneide die proximale Sehne
- Mit Pinzette, entfernen Sie die dünne Faszie, die den Muskel bedeckt, ohne das Gewebe zu beschädigen.
- Entfernen Sie übermäßige Feuchtigkeit in der Probe mit Hilfe eines Papiertuches. Sicherstellen, dass der Muskel weder nass noch übermäßig trocken ist, da übermäßige Feuchtigkeit sig produziertEine deutliche Schädigung des Muskels und gefährden die nächste Färbung.
- Setzen Sie die optimale Schneidtemperatur (OCT) -Verbindung am Boden einer Form ein und legen Sie den Muskel in die in Abbildung 2D gezeigte Ausrichtung. Füge 100% Isopentan zu einem Becher hinzu, bis er eine Tiefe von ca. 3-4 cm erreicht. Stellen Sie das Becherglas mit flüssigem Stickstoff in einer Polystyrolbox in Berührung.
- Lassen Sie den flüssigen Stickstoff nicht in den Becher geben, da er einen sprudelnden Schaum produzieren wird, der die Einbeziehung beeinflussen und die Muskelabschnitte beschädigen kann.
- Beobachten Sie das Isopentan und warten Sie, bis es die richtige Temperatur erreicht (zwischen -140 ° C und -150 ° C); Bei der geeigneten Temperatur wird eine feste weiße Schicht aus gefrorenem Isopentan auf dem Boden des Bechers kristallisieren.
- Wenn das Isopentan vollständig festgefriert, schmelzen und es auf die Gefriertemperatur kühlen, bevor es weiter zum nächsten Schritt geht.
- Mit der vorgegossenen Pinzette die Form fein zerkleinernDas Isopentan für ca. 20-30 s. Legen Sie die gefrorene Probe in einen Behälter mit Trockeneis, bis sie auf einen Gefrierschrank von -80 ° C übertragen wird.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
- Muskelgewebe Kryosorten.
- Nach mindestens einer Nacht bei -80 ° C, kryosähen.
- Nehmen Sie das Kryostatmesser und die Anti-Roll-Platte aus dem Gefrierschrank -20 ° C und legen Sie sie auf die entsprechenden Träger in den Kryostatschrank.
- Setzen Sie einen Tropfen OCT auf den Probenstummel und legen Sie die gefrorene Probe in vertikaler NS-Orientierung auf, wie in Abbildung 2D dargestellt.
- Legen Sie den Probenstummel auf das Spannfutter.
- Ohne die Anti-Roll-Platte auf das Messer zu ziehen, machen Sie einige Schnitte bei 40 μm, um OCT loszuwerden, die keinen Muskel enthält. Wenn der Muskel sichtbar wird, reduzieren Sie die Schichtdicke auf 7-8 μm.
- Ziehen Sie die Anti-Roll-Platte nach unten, bis sie ausgerichtet istDer Rand des Messers oder ein wenig darüber.
- Schneiden Sie transversale Abschnitte von 7-8 μm dick und montieren Sie 3-4 Scheiben pro histologischer Rutsche.
HINWEIS: Die vorgeschlagene Kryostattemperatur liegt zwischen -15 ° C und -23 ° C. Für die anschließende Analyse werden Querschnitte der Proben benötigt, um die Muskelstammzellen in der Satelliten-Nischenposition zu lokalisieren. - Um die Adhärenz des Abschnitts zu maximieren, halten Sie die Objektträger bei Raumtemperatur für 10-15 min, um so ihre Ablösung während der Antikörperinkubation zu verhindern.
HINWEIS: Der Lufttrocknungsschritt könnte die Immunfärbung beeinträchtigen und mehrdeutige Ergebnisse liefern. Folien können für mehrere Monate bei -80 ° C nicht fixiert werden. Das Protokoll kann hier pausiert werden.
- Prüfung auf Muskelschäden bei Kryosationen von TA-Muskeln durch Hämatoxylin Eosin (H & E) Färbung.
- Um die Qualität des Muskels zu bewerten ( dh die Wirksamkeit der Verletzung, die Muskelisolation und die InklusionIonen und Kryoseiten), eine H & E-Färbung durchführen. Für jeden experimentellen Zeitpunkt fixieren Sie eine Folie mit 4% PFA für 10 min. Nach der Fixierung, waschen Sie die Folien gut in mehreren Änderungen von 1x PBS.
HINWEIS: Vorsicht. PFA ist krebserzeugend und muss sorgfältig behandelt werden. - Nehmen Sie eine Rutsche für jeden experimentellen Punkt und legen Sie sie in ein Färbeglas.
- Füllen Sie das Gefäß mit 9 g / l Hämatoxylin, bis die Abschnitte abgedeckt sind und für 8 min inkubieren.
- Recyceln Sie die Hämatoxylin.
- Lassen Sie das Gefäß unter fließendem Wasser für 10 min, um den Überschuss von Hämatoxylin zu entfernen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass das Wasser nicht direkt auf die Abschnitte fließt. - Mit sterilisiertem Wasser waschen.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit Eosin 0,5% (w / v) in angesäuertem 90% Ethanol für 1 min.
- Recyceln Sie den Eosin.
- Waschen Sie zweimal mit sterilem Wasser für 3 min / waschen.
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer Chemikalienhaube durch. - Die Abschnitte mit 70% Ethanol waschen.
- WaschenDie Abschnitte mit 90% Ethanol.
- Die Sektionen mit 100% igem Ethanol waschen.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit 0,879 g / ml O-Xylol.
HINWEIS: Vorsicht. O-Xylol ist brennbar und mäßig giftig. Manipulieren Sie es unter chemischer Haube, tragen Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, ein Laborkittel und eine Maske. - Recyceln Sie das o-Xylol.
- Setzen Sie die Folien über ein Stück Papier, um zu trocknen.
- Schließen Sie die Objektträger mit einem schnell härtenden, auf Xylol basierenden Montagemedium.
- Überprüfen Sie die Qualität der Abschnitte unter einem optischen Mikroskop bei 10facher Vergrößerung (siehe Abbildung 3 )
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
- Um die Qualität des Muskels zu bewerten ( dh die Wirksamkeit der Verletzung, die Muskelisolation und die InklusionIonen und Kryoseiten), eine H & E-Färbung durchführen. Für jeden experimentellen Zeitpunkt fixieren Sie eine Folie mit 4% PFA für 10 min. Nach der Fixierung, waschen Sie die Folien gut in mehreren Änderungen von 1x PBS.
3. Immunfärbung für LC3 und MyoD in verletzten Muskelgewebsabschnitten
- Fixierung von Muskelgewebeabschnitten
- Bereiten Sie eine Inkubationskammer vor, indem Sie ein Stück Papier benetzen und es auf den Boden einer verschließbaren Plastikbox legen, um ein hohes Le zu erhaltenFeuchtigkeit im Inneren der Kammer Fixieren Sie Gewebeschnitten mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS für 10 min.
HINWEIS: Ein nasses Stück Papier wird verwendet, um das Trocknen der Probe zu vermeiden. Frische PFA zubereiten oder PFA bei -20 ° C aufbewahren. Vorsicht. PFA ist giftig; Das Pulver muss bei der Herstellung der Lagerlösung sorgfältig gehandhabt werden. Dieser Vorgang muss in einer chemischen Haube durchgeführt werden, mit Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhen, einem Laborkittel und einer Maske. Auch wenn in der Lösung die PFA sorgfältig manipuliert werden sollte. - Entfernen Sie die PFA und waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5-7 min; Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal.
- Bereiten Sie eine Inkubationskammer vor, indem Sie ein Stück Papier benetzen und es auf den Boden einer verschließbaren Plastikbox legen, um ein hohes Le zu erhaltenFeuchtigkeit im Inneren der Kammer Fixieren Sie Gewebeschnitten mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS für 10 min.
- Permeabilisierung von Muskelgewebeabschnitten
- Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere um die Gewebeabschnitte mit einem Papierstift.
HINWEIS: Dieser Schritt definiert die Oberfläche um die Gewebeschnitten und minimiert das Volumen der in den Schritten 3.4, 3.6, 3.7 und 3.9 beschriebenen Antikörper. - Die Abschnitte mit 200 μl kalt (-20 ° C)Methanol und legte die Inkubationskammer horizontal in einen Gefrierschrank bei -20 ° C für 5 min.
- Die Inkubationskammer aus dem Gefrierschrank nehmen, das Methanol absaugen und die Abschnitte mit 1X PBS für 5-7 min bei RT waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere um die Gewebeabschnitte mit einem Papierstift.
- Blockierung
- Bereiten Sie eine frische Blocklösung von 4% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS 1x vor.
HINWEIS: Die BSA-Lösung kann für 1 Woche bei 4 ° C aufbewahrt werden. - Die Abschnitte mit Blocklösung für mindestens 60 min bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie die Sperrlösung.
- Vorbereitung von 100 & mgr; l Anti-Fab-Mischung durch Verdünnen von 20 & mgr; g / ml Anti-Fab in 1x PBS. Inkubieren der Abschnitte mit einem unkonjugierten affinitätsgereinigten F (ab) -Fragment von anti-Maus-IgG für 1 h bei RT.
- Bereiten Sie eine frische Blocklösung von 4% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS 1x vor.
- Primäre Antikörper-Inkubation.
- 100 μl primäre Antikörpermischung für jede Folie durch Auflösen von LC3- und MyoD-Antikörpern in 4% BSA in 1x PBS vorbereiten. Verwenden Sie 5 μg /Ml anti-LC3 (polyklonaler Kaninchen-Antikörper) und 10 mg / l anti-MyoD (monoklonaler Maus-Antikörper). Inkubieren Sie die primäre Antikörpermischung über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen.
- Entfernen Sie den primären Antikörper-Mix.
- Die Abschnitte mit 1% BSA in 1X PBS für 10 min waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- Sekundäre Antikörper-Inkubation.
- 100 μl sekundäre Antikörpermischung für jede Folie vorbereiten. Das Ziegen-Anti-Kaninchen 488 (5 & mgr; g / ml) und die Ziegen-Anti-Maus 594 (5 & mgr; g / ml) in 4% BSA in 1x PBS auflösen.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Belichtung, um eine Fluorchrom-Bleiche zu verhindern. Führen Sie die folgenden Schritte im Dunkeln durch. - Inkubieren Sie die Sektionen mit der sekundären Antikörpermischung für 45 min bei RT.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörpermischung und waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5-7 min; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- 100 μl sekundäre Antikörpermischung für jede Folie vorbereiten. Das Ziegen-Anti-Kaninchen 488 (5 & mgr; g / ml) und die Ziegen-Anti-Maus 594 (5 & mgr; g / ml) in 4% BSA in 1x PBS auflösen.
- Primäre Antikörper-Inkubation.
- Lamini verdünnenN-2 (α-2-Ketten) monoklonaler Antikörper (0,33 μg / ml) in 4% BSA in 1x PBS unter Verwendung von 100 & mgr; l Mischung für jede Folie. Inkubieren Sie die Abschnitte in der primären Antikörpermischung für 1-2 h bei RT.
- Waschen.
- Entfernen Sie den primären Antikörper-Mix.
- Die Abschnitte mit 1% BSA in 1X PBS für 10 min waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- Sekundäre Antikörper-Inkubation.
- Vorbereitung von 100 & mgr; l Sekundärantikörpermischung für jede Folie durch Verdünnen von Ziegen-Anti-Ratten-647 (5 & mgr; g / ml) in 4% BSA in 1 × PBS. Inkubieren Sie die Sektionen im sekundären Antikörper-Mix für 45 min bei RT.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörpermischung und waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5-7 min; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Inkubation.
- Füge 200 μL 300 nM DAPI-Lösung in 1x PBS zu jeder Folie hinzu. 5 min bei RT inkubieren. Die DAPI - Lösung bei 4 ° C imdunkel.
- Die Abschnitte mit 1x PBS für 5-7 min waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- Befestigung von gefärbten Muskelabschnitten.
- Entfernen Sie den Überschuss der Waschlösung aus den Abschnitten.
- Legen Sie 10 μl Glycerin in 1x PBS (3: 1) auf die gefärbten Abschnitte in der Mitte des Objektträgers und fügen Sie ein Deckglas hinzu, wodurch die Bildung von Luftblasen vermieden wird.
4. Konfokale Mikroskopie Akquisition
- Erwerben Sie die Bilder mit einem Vier-Laser-konfokalen Mikroskop integriert mit einem Bild-Capture-System und analytische Software.
HINWEIS: MyoD ist mit einem 594-Farbstoff konjugiert, der ein heller Rot-Fluoreszenz-Farbstoff ist, mit einer Anregung, die sich ideal für den 594 nm-Laser eignet (Anregung: 590 nm, Emission: 617 nm). LC3 ist mit einem 488-Farbstoff konjugiert, der ein hellgrün-fluoreszierender Farbstoff ist, wobei die Anregung ideal für die 488 nm Laserlinie geeignet ist (Anregung: 495 nm, Emission: 519 nm). Laminin wird mit einem 647 Farbstoff konjugiertEin heller Far-Rot-Fluoreszenz-Farbstoff, mit Anregung ideal geeignet für die 647 nm Laserlinie (Anregung: 650 nm, Emission: 668 nm). - Legen Sie die Objektträger in das Mikroskop-Fach und verwenden Sie die 63fache Vergrößerung, um Kernsignale zu erkennen. Lehnen Sie sich auf die regenerativen Bereiche ein, indem Sie die Felder der aktiven Regeneration zentrieren und sich auf die Muskelmorphologie verlassen (siehe Abbildung 4 ).
HINWEIS: Während im ungestörten Muskel die Myofasergröße nahezu konstant ist (Abbildung 4A ), kann die Verletzungsvermittelte Muskelregeneration durch das Auftreten kleinerer Myofasern erkannt werden, die nach der Regeneration die neu gebildeten Fasern sind. Darüber hinaus ist der Muskel in der aktiven Regeneration durch ein umfangreiches Infiltrat gekennzeichnet, das aus Makrophagen, fibroadipogenen Vorläufern und Zellen besteht, die auf die beschädigten Muskeln lokalisiert sind, um die Muskelregeneration zu orchestrieren (Abbildung 4B ). - Bewerte die Immunfluoreszenzfärbung in regenDurch die Fokussierung auf MuSCs, die sich unter der Basallamina der Myofasern befinden.
- Konzentriere dich auf MuSCs, die positiv für die MyoD-Färbung sind und in Myofasern positioniert sind, die durch Lamininfärbung markiert sind (siehe Abbildung 4B , weiße Pfeile).
- Verwenden Sie mindestens 3 Mäuse / experimentelle Gruppe und verwenden Sie das Mikroskop, um 63fache Vergrößerungsbilder von mindestens 7 Feldern für jede experimentelle Gruppe zu erwerben.
- Sobald die regenerativen Bereiche identifiziert sind, konzentrieren Sie sich mit der DAPI-Färbung und passen Sie dann die anderen einzelnen Kanäle an.
- Verwenden Sie folgende Mikroskopeinstellungen: Kanal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Kanal A488 Pinhole 1.6 Airy Einheit, Verstärkung 659; Kanal A647 Pinhole 1.4 Airy Einheit, Gewinn 719.
- Nach dem Einstellen des Fokus der einzelnen Kanäle gehen Sie fort, um die Bilder mit einer Größe von 1.024 x 1.024 und einem 12,61 μs Pixel zu gewinnen.
- Zähle den Prozentsatz der MyoD-positiven Zellen (Kontrolle für tEr korrekte Lage unter der Lamina), die LC3-negativ sind und der Prozentsatz der MyoD-positiven Zellen, die ein LC3-Signal anzeigen.
HINWEIS: Der Prozentsatz der MyoD-positiven Zellen, die eine LC3-Färbung aufweisen, ist das Auslesen dieses Protokolls.
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente In-situ- Methode, um Autophagie in MuSCs während der Muskelregeneration zu erkennen.
CTX In vivo Behandlungen:
Verwenden Sie CTX, um Muskelschäden in TA-Muskeln zu induzieren und verwenden Sie ungestörte Muskeln als Kontrollen. Da Autophagie hochdynamisch ist, blockieren Sie den autophagischen Fluss durch die Durchführung von IP-Injektionen von CLQ (Abbildung 1 ). CLQ-Behandlung ist wichtig, um zu beurteilen, ob der autophagische Fluss aktiv ist oder auf basalen Ebenen gehalten wird.
Tibialis Anterior Isolation:
Isolieren Sie den TA-Muskel, wie in Abbildung 2 beschrieben, und legen Sie ihn in eine Formkammer in NS-Orientierung, um anschließend transversale Muskelgewebeabschnitte zu erhalten. Dieser SchrittIst entscheidend für die Erreichung von Abschnitten und die Identifizierung von MuSCs an der richtigen Stelle unter der myofiber basalen Lamina.
Hystologische Untersuchung von CTX-induzierten Muskelschäden
Vergewissern Sie sich, dass Muskelverletzungen durch histologische Färbung aufgetreten sind. Führen Sie H & E-Färbung durch und überprüfen Sie unter 10facher Vergrößerung: Während ungestörte Muskeln im Allgemeinen unveränderliche Myofaser-Größen zeigen, sind die typischen Merkmale der verletzten Muskeln die Störung von Myofasern, die sich in der Größe und reichlich entzündlichen Infiltrat unterscheiden. Ein weiterer Parameter, um zu bestätigen, dass der regenerative Prozess stattfindet, ist die Zentro-Keimbildung der Myofibers, die in ungestörten Muskeln fehlt und ein Zeichen für die Bildung neuer Fasern bei Mäusen ist, die sich einer aktiven Regeneration unterziehen (Abbildung 3 ).
Autophagie ist gekoppelt an MyoD-poSitive Zellen während der Muskelregeneration:
Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung durch, um MuSCs zu erkennen, die als MyoD-positiv identifiziert wurden und ein LC3-Signal anzeigen. Laminin-Färbung ist hilfreich, um MuSCs in der richtigen Position in der Nische unterhalb der Basallamina zu lokalisieren (Abbildung 4 ). Autophagische Basalstufen unterscheiden ungestörte Skelettmuskulatur und erhöhen den Koinzidenz mit der Muskelregeneration deutlich. Dementsprechend zeigen unverletzte Mäuse keine MuSC-Aktivierung, die durch die Abwesenheit von MyoD-positiven Zellen und kein LC3-Signal detektiert wird. Umgekehrt werden bei Muskelschäden MyoD-positive MuSCs für LC3 positiv, was zeigt, dass der autophagische Prozess während der Muskelregeneration in aktivierten Satellitenzellen aktiviert wird.
Während der Anfangsphasen der regenerativen Antwort lokalisieren sich verschiedene Zelltypen auf der Stelle von tEr Läsion, einschließlich entzündlicher Zellen und fibro-adipogene Vorläufer, wodurch die verletzten Bereich dicht überfüllt. Es ist entscheidend, zwischen allen verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden, die sich auf den MuSC-Standort unterhalb der Myofaser-Lamina konzentrieren und sich auf MyoD-Positivität verlassen.
In basalen Bedingungen wird LC3 ubiquitär ausgedrückt und wird durch Immunfluoreszenz kaum erkannt. Als Folge der erhöhten Autophagie ändert sich dieses Färbemuster und wird vor allem im Zytoplasma nachweisbar. Bei der Bewertung von MyoD / LC3-Färbung ist zu bedenken, dass MuSCs kleine Zellen sind und dass die zytoplasmatische Region begrenzt ist; Darum kann LC3 perinukär aussehen.
Abbildung 1: CTX In-vivo- Behandlungen. ( A ) Um Muskelschäden zu induzieren, injizieren Sie 10 μl 10 μM CTX direcIn den linken TA-Muskeln von 2 Monate alten WT-Mäusen. Benutze das kontralaterale Glied als Kontrolle. ( B ) Schematische Darstellung der Kardiotoxin-induzierten Muskelverletzung. 24 h nach der Verletzung, behandeln die Mäuse mit intraperitonealen Injektionen von 50 mg / kg CLQ alle 24 h für 4 Tage und dann opfern die Tiere. Verwenden Sie unbehandelte, unverletzte und verletzte Mäuse als Kontrollen. Dieses Protokoll erlaubt die Untersuchung der Beteiligung des autophagischen Prozesses während der Muskelregeneration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: TA-Isolierung. ( A ) Repräsentatives Bild der TA, wie es vor der Isolation aussieht. ( B ) Nach dem Schneiden der distalen Sehne, halten Sie den TA-Muskel an der Sehne und vorsichtigZiehen Sie den Muskel bis zum proximalen Ende (in der Nähe des Knies). ( C ) Diskriminieren Sie die EDL aus dem TA-Muskel, die größer und oberflächlicher als die EDL ist. Trennen Sie den TA vom EDL-Muskel, indem Sie die beiden distalen Sehnen in entgegengesetzte Richtungen ziehen. ( D ) Sobald das TA isoliert ist, legen Sie es in die Formkammer, wie beschrieben, in NS-Orientierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: CTX induziert Muskelschäden. Repräsentative Bilder von H & E-Färbung auf TA-transversalen Gewebeabschnitten von kontrollierten, unverletzten ( A ) und 5 d pi ( B ) WT-Mäusen. H & E-Färbung zeigt die normale Faser-Morphologie bei Kontrollmäusen ( A ) und MassivE Muskelschaden und infiltrieren in verletzten Muskeln ( B ), was eine beeinträchtigte Morphologie bei CTX-Injektion zeigt. Maßstab = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Autophagie ist während der Muskelregeneration an myoD-positive Zellen gekoppelt. Repräsentative Bilder von TA-Abschnitten von Kontrolle ( A ) und verletzten ( B ) WT-Mäusen, die mit LC3 (grün) und MyoD (rot) immunostainiert sind. Laminin (Cyan) Färbung markiert Muskelfasern und Kerne werden mit DAPI (weiß) gegengefärbt. Die rechten Felder zeigen repräsentative Bilder des Merge-Signals. Weiße Pfeile zeigen Satellitenzellen an, die unterhalb der Basallamina der Faser sind, die durch Lamininfärbung gekennzeichnet ist. Die folgendenNg-Protokoll erlaubt die Messung der Autophagie durch LC3-Färbung in Muskelstammzellen, die sich einer myogenen Linie unterziehen, die von MyoD markiert ist. Maßstab = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie man Autophagie in Skelettmuskel Stammzellen während der kompensatorischen Muskelregeneration zu überwachen. Mehrere Antikörper für die Co-Färbung von LC3 und MyoD wurden ausprobiert, und diejenigen, die in Mausgewebeabschnitten arbeiten und erfolgreiche Ergebnisse erstellen, sind hier aufgelistet (siehe Materialtabelle ). Die Permeabilisierung mit Methanol (siehe Schritt 3.2.2) ist für eine erfolgreiche Färbung sehr zu empfehlen.
Die Begrenzung dieses Protokolls hängt mit der intrinsischen Variabilität der Mäuse zusammen, die die Verwendung von mindestens 3 Mäusen / experimentellen Gruppen zwingt. Diese Methodik spiegelt einen Schritt vorwärts in der Studie der Autophagie während der Skelettmuskelregeneration, als die Mehrheit der Ergebnisse auf Wurden nun in isolierten Zellen hergestellt. Die in situ- Analyse erlaubte die Untersuchung von Autophagie in der natürlichen Umgebung, ohne die Notwendigkeit einer Zellisolation, die metabolische Prozesse, wie Autophagie beeinflussen könnte.
"> Angesichts der hochdynamischen Natur des autophagischen Prozesses sind die CLQ-Behandlungen ein kritischer Schritt zur Überwachung des autophagischen Prozesses in vivo. CLQ blockiert die späteren Stadien des autophagischen Prozesses, was zu einer LC3-Akkumulation führt, wenn Autophagie aufrechterhalten wird Macht die LC3 durch eine in situ- Untersuchung nachweisbar, bei ungestörten Skelettmuskeln wird der basale autophagische Prozess durch die CLQ-Behandlung nicht weiter erhöht, wie sich aus der Abwesenheit einer nachweisbaren LC3-Akkumulation ergibt. Bei der Regeneration der Muskeln sammelt sich LC3 jedoch bei der CLQ-Behandlung und zeigt autophagische Aktivierung Ein kritischer Schritt ist, die Mäuse zur gleichen Zeit am Morgen ( dh um 10 Uhr) zu opfern. Ein weiterer kritischer Schritt im Protokoll ist die Identifizierung von MuSC, die nicht mit einem anderen zellulären Typ, der beschädigte Muskeln bevölkert, ausgetauscht werden kann Regenerative Antwort Die Identifizierung von MuSCs unter der Basallamina, die MyoD Positivität zeigt, ist die kUm sich auf Satellitenzellen zu konzentrieren.Zusammenfassend stellen wir eine geeignete in situ- Methode vor, um die Beteiligung des autophagischen Prozesses in MuSCs zu erkennen. Diese Technik kann als Grundlage für Tests von pharmakologischen Ansätzen zur Autophagie-Modulation dienen, die zur Verbesserung der Skelettmuskelregeneration bei normalen und pathologischen Zuständen verwendet werden könnten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIAMS AR064873, Epigen Project PB unterstützt. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT zu LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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