Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

In Situ Иммунофлуоресцентное окрашивание аутофагии в мышечных клетках

doi: 10.3791/55908 Published: June 12, 2017

Summary

Активная аутофагия связана с продуктивной регенерацией мышц, которая необходима для активации мышечной стволовой клетки (MuSC). Здесь мы предоставляем протокол для обнаружения in situ LC3, маркера аутофагии в MyoD-положительных MuSCs участков мышечной ткани у контрольных и раненых мышей.

Abstract

Увеличение доказательств указывает на аутофагию как важнейший регуляторный процесс для сохранения гомеостаза тканей. Известно, что аутофагия участвует в развитии и регенерации скелетных мышц, а аутофагический процесс описан в нескольких мышечных патологиях и связанных с возрастом мышечных расстройствах. Недавно описанный блок аутофагического процесса, который коррелирует с функциональным истощением клеток-сателлитов при восстановлении мышц, подтверждает мнение о том, что активная аутофагия связана с продуктивной регенерацией мышц. Эти данные раскрывают решающую роль аутофагии в активации сателлитных клеток при регенерации мышц как в нормальных, так и в патологических состояниях, таких как мышечные дистрофии. Здесь мы предоставляем протокол для мониторинга аутофагического процесса во взрослом отделении мышечной стволовой клетки (MuSC) во время восстановительных состояний мышц. В этом протоколе описывается методика установки для визуализации in situ иммунофлуоресценции LC3, aUtophagy и MyoD, маркер миогенной линии, в отделах мышечной ткани у контрольных и раненых мышей. Представленная методология позволяет контролировать аутофагический процесс в одном конкретном клеточном отделении, купе MuSC, который играет центральную роль в организации регенерации мышц.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Регенерация скелетных мышц является результатом взаимодействия между взрослыми стволовыми клетками (Muscle Satellite Cells, MuSCs) и другими типами клеток, которые участвуют в регенеративном процессе. Гомеостаз мышц и функциональность поддерживаются комбинированными сигналами, возникающими из ниши мышцы и системных сигналов 1 , 2 . Сообщалось об изменениях в функциональности MuSC, мышечной нише и системных сигналах, что привело к снижению функциональных возможностей у пожилых людей 3 . MuSCs устанавливаются в нише под базальной пластинкой и при травме мышц активируются для восстановления поврежденных мышц 4 , 5 . Для обеспечения продуктивного регенеративного ответа крайне важно, чтобы MuSCs координировали различные процессы, необходимые для выхода из стадии покоя, самообновления и стадии пролиферативного расширенияМиогенной дифференциацией 6 . У пожилых людей и при мышечных хронических заболеваниях все эти функции скомпрометированы, что приводит к измененной функциональности мышц 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .

Макроаутофагия (далее именуемая аутофагией) становится важнейшим биологическим процессом, необходимым для сохранения гомеостаза тканей 14 . Аутофагический процесс охватывает механизмы торговли людьми, где части цитоплазмы, органеллы и белки поглощаются везикулами, которые в конечном итоге деградируют через лизосомальный путь, способствуя удалению токсических молекул и рециркуляции макромолакрупные петли. Это обеспечивает богатые энергией соединения для поддержки адаптации клеток и тканей при стрессе или других неблагоприятных условиях 15 , 16 . Вместе с активностью жизнедеятельности клеток аутофагия может также работать в качестве индуктора клеточной смерти, в зависимости от контекста ткани клетки ( например, нормальной ткани против раковой ткани) и типа стрессового стимула 17 , 18 .

Недавние данные свидетельствуют о том, что аутофагия необходима для поддержания мышечной массы и целостности myofiber 19 , 20 и, как сообщается , была нарушена при различных мышечных дистрофиях 21 , 22 , 23 , включая мышечную дистрофию Дюшенна (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. Аналогично, прогрессирующее восстановление аутофагического процесса наблюдалось у пожилых людей 31 , 32 , 33 , 34 , 35 после потери мышечной массы (называемой саркопенией) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , а также в выживании myofiber 38 .

Тщательная связь между аутофагией и регенеративным потенциалом скелетных мышц ожидалась в результате исследования лаборатории Пауэра, которое показало, что ограничение калорийности увеличивает доступность и активность MuSC 39 . Это неПоследнее подтверждается недавним наблюдением, что ось Foxo3-Notch активирует аутофагический процесс во время самообновления 40 и переход MuSC от покоя к пролиферирующему состоянию 41 . Эти данные согласуются с постепенным снижением базальной аутофагии от молодых до старых и гериатрических MuSCs в сочетании с численным и функциональным снижением MuSC во время старения 42 .

В недавней работе мы продемонстрировали тесную связь между аутофагией и компенсаторной регенерацией мышц, которая отличает ранние стадии прогрессирования МДД. Соответственно, мы наблюдали уменьшенный аутофагический поток на более поздних стадиях прогрессирования заболевания, когда мышечная регенерация скомпрометирована и происходит осаждение фиброзной ткани. Интригующе мы показали, что в условиях регенерации аутофагия активируется в MuSC и что модуляция аутофагического процесса влияет на активацию MuSC и fuNctionality 30 .

В целом эти данные подчеркивают настоятельную необходимость изучения аутофагического процесса в MuSCs при регенерации мышц в нормальных и патологических условиях и на протяжении всей жизни. Здесь мы предоставляем протокол для мониторинга аутофагического процесса в MuSCs в восстановительных условиях мускулатуры путем проведения in situ иммуноокрашивания для микротрубочки-ассоциированного белка 1A / 1B-легкой цепи 3 (LC3), маркера аутофагии 43 и MyoD, маркера Миогенной линии, в отделах мышечной ткани у контрольных и раненых мышей. Представленная методология позволяет контролировать аутофагический процесс в одном конкретном клеточном отделении, MuSC, который играет ключевую роль в организации регенерации мышц.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мышей выращивали и поддерживали в соответствии со стандартными процедурами на животных, и все экспериментальные протоколы были одобрены Агентством по обеспечению благосостояния животных и внутренним комитетом по этическим исследованиям животных в соответствии с Министерством здравоохранения Италии и соответствовали Руководству NIH по уходу и использованию Лабораторные животные.

1. Мышечная травма и блок in vivo аутофагического потока

  1. Мышечная травма.
    1. Чтобы вызвать острую травму скелетных мышц, вводите 20 мкл 10 мкМ кардиотоксина (CTX) непосредственно в левую переднюю мышцу tibialis (TA) 2-месячных мышей C57BL / 6J, которые весом около 20 г. Используйте равное количество мужчин и женщин. Используйте невозмущенную контралатеральную конечность в качестве контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ. 10 мкМ CTX в 0,9% растворе хлорида натрия следует фильтровать (фильтр PVDF 0,22 мкм) и хранить при -20 ° C. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.
    2. Использование iNsulin с иглой 30 G, введите CTX в середине TA. Чтобы вызвать точную травму в TA, убедитесь, что игла шприца входит вблизи дистального сухожилия, глубиной 5 мм, от основания до верха мышцы ( рис. 1A ).
  2. Блокада аутофагического потока у невозмущенных и раненых мышей.
    1. Чтобы оценить аутофагический поток, через 24 ч после травмы (пи), вводить 50 мг / кг хлорохина (CLQ) каждые 24 ч в течение 4 дней путем внутрибрюшинной (IP) инъекции ( рисунок 1B ).
      1. Растворить CLQ (10 мг / мл) в PBS 1X и фильтровать через мембрану 0,2 мкм. Взвешивайте каждую мышь и вычисляйте количество CLQ для инъекции.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовьте и используйте CLQ-решение в тот же день. Запасы CLQ можно хранить в течение одного месяца при температуре -20 ° C. Поскольку аутофагия - это процесс, связанный с метаболизмом, всегда выполняйте CLQ-лечение всегда в одно и то же время ( то есть утром befoRe 10 AM).

2. Разделения мышц

  1. Мышь жертву.
    1. Усыпьте мышей через 5 дней после травмы.
    2. Выполните эвтаназию путем вывиха шейки матки или СО 2 (за которым следует цервикальная дислокация для подтверждения). Поскольку процесс аутофагии связан с привычками к снову / еде мыши, всегда жертвуйте мышами одновременно, предпочтительно утром ( т.е. до 10 часов утра).
  2. Изоляция и включение TA.
    1. Перед вскрытием распылите мышь 70% этанолом.
    2. Используя ножницы, сделайте небольшой, перпендикулярный разрез (длиной 3 мм) на дорсальной коже мыши на уровне бедер. Сократите хвост и ноги, чтобы упростить удаление кожи. Потяните кожу к хвосту и удалите ее, чтобы выставить под мышцы; Мышца ТА легко локализуется, как показано на рисунке 2А
    3. С помощью двух щипцов схватите дистальные сухожилия.
    4. Сократите дистальные сухожилия; Сухожилия TA и экстензорного удлинителя longus (EDL) часто разрезаются совместно и затем разделяются (см. Шаг 2.2.6).
    5. Используя щипцы, держите мышцу TA сухожилием и осторожно подтяните мышцу к проксимальному концу (около колена, рис. 2B ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. В этот момент мышцы EDL и TA легко узнаваемы, TA больше и более поверхностно, чем EDL.
    6. Отделите TA от мышцы EDL, потянув два дистальных сухожилия в противоположных направлениях ( рисунок 2C ).
    7. Сократите проксимальное сухожилие.
    8. Используя щипцы, удалите тонкую фасцию, которая покрывает мышцы, не повреждая ткань.
    9. Удалите излишнюю влагу в образце с помощью бумажного полотенца. Убедитесь, что мышца не является ни влажной, ни чрезмерно сухой, так как чрезмерная влажность приведет к образованию сигаСущественный ущерб мышцам и поставить под угрозу следующее окрашивание.
    10. Поместите оптимальную температуру резки (OCT) на дно пресс-формы и поместите в нее мышцу в ориентации, показанной на рисунке 2D . Добавить 100% изопентан в химический стакан до тех пор, пока он не достигнет глубины примерно 3-4 см. Поместите стакан в контакт с жидким азотом в коробке из полистирола.
    11. Не допускайте попадания жидкого азота в стакан, так как он продуцирует пузырьковую пеньку, которая может повлиять на включение и повреждение мышечных секций.
    12. Наблюдайте за изопентаном и ждите, пока он не достигнет надлежащей температуры (от -140 ° C до -150 ° C); При соответствующей температуре твердый белый слой замороженного изопентана кристаллизуется на дне стакана.
    13. Если изопентан полностью замораживает твердое вещество, расплавьте его и охладите до температуры замерзания, прежде чем перейти к следующему этапу.
    14. Используя предварительно обработанные щипцы, деликатно опустите форму вИзопентана в течение приблизительно 20-30 с. Поместите замороженный образец в контейнер с сухим льдом, пока он не будет переведен на морозильник -80 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Протокол можно приостановить здесь.
  3. Криосекции мышечной ткани.
    1. После хотя бы одной ночи при -80 ° C выполните криообработку.
    2. Выньте криостат-нож и анти-валик из морозильника -20 ° C и поместите их на соответствующие опоры в шкаф криостата.
    3. Поместите каплю OCT на заглушку образца и поместите на него замороженный образец в вертикальной ориентации NS, как показано на рисунке 2D .
    4. Поместите образец заглушки на патрон.
    5. Не потянув за рулонную пластину на нож, сделайте несколько разрезов на 40 мкм, чтобы избавиться от OCT, который не включает мышцы. Когда мышца станет видимой, уменьшите толщину среза до 7-8 мкм.
    6. Сдвиньте антипрокатную пластину до тех пор, пока она не будет совмещена сКрай ножа или немного выше него.
    7. Вырежьте поперечные срезы толщиной 7-8 мкм и установите 3-4 ломтика на гистологический предмет.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуемая температура криостата составляет от -15 ° C до -23 ° C. Поперечные сечения образцов необходимы для последующего анализа, чтобы точно определить мышечные стволовые клетки в позиции нишевого спутника.
    8. Чтобы максимизировать сцепление секций, держите слайды при комнатной температуре в течение 10-15 минут, чтобы предотвратить их отрыв во время инкубации антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Стадия сушки на воздухе может повлиять на иммунную окраску, что дает неоднозначные результаты. Слайды можно хранить незафиксированными в течение нескольких месяцев при -80 ° C. Протокол можно приостановить здесь.
  4. Проверка на повреждение мышц при криосекциях мышц ТА, выполняя окрашивание гематоксилин-эозином (H & E).
    1. Оценить качество мышц ( т.е. эффективность травмы, мышечной изоляции и инклюзивностиИон и криоизоляция), выполняют окрашивание H & E. Для каждого экспериментального момента времени зафиксируйте один слайд с 4% PFA в течение 10 мин. После фиксации хорошо промойте слайды в нескольких изменениях 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Внимание. PFA является канцерогеном, и его следует тщательно обрабатывать.
    2. Возьмите один предмет слайда для каждой экспериментальной точки и поместите их в баню для окрашивания.
    3. Заполните банку гематоксилином 9 г / л до тех пор, пока секции не будут закрыты и не инкубируются в течение 8 мин.
    4. Переработать гематоксилин.
    5. Оставьте банку под проточной водой в течение 10 минут, чтобы удалить избыток гематоксилина.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Не допускайте попадания воды непосредственно на секции.
    6. Промыть стерилизованной водой.
    7. Инкубируйте секции с помощью эозина 0,5% (мас. / Об.) В подкисленном 90% этаноле в течение 1 мин.
    8. Переработайте эозин.
    9. Промыть дважды стерильной водой в течение 3 мин / промыть.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выполните следующие шаги на химическом кожухе.
    10. Промойте секции 70% этанолом.
    11. мытьСекции с 90% этанолом.
    12. Промойте секции 100% этанолом.
    13. Инкубируйте секции с 0,879 г / мл о-ксилола.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Внимание. O-ксилол является легковоспламеняющимся и умеренно токсичным. Манипулируйте им под химическим капюшоном, надевая защитное снаряжение, включая перчатки, лабораторное пальто и маску.
    14. Переработать о-ксилол.
    15. Положите слайды на лист бумаги, чтобы высохнуть.
    16. Закройте слайды с помощью быстротвердеющей, ксилольной монтажной среды.
    17. Проверьте качество участков под оптическим микроскопом с увеличением 10X (см . Рисунок 3 )
      ПРИМЕЧАНИЕ. Протокол можно приостановить здесь.

3. Иммуноокрашивание для LC3 и MyoD в отделанных тканевых тканях

  1. Фиксация отделов мышечной ткани.
    1. Подготовьте инкубационную камеру, смачив лист бумаги и поместив ее на дно закрываемой пластиковой коробки, чтобы поддерживать высокий уровеньВлажность внутри камеры. Фиксируйте участки ткани с 4% параформальдегидом (PFA) в 1x PBS в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Во избежание сушки образца используется влажный лист бумаги. Подготовьте свежий PFA или используйте PFA, хранящийся при -20 ° C. Внимание. PFA токсичен; При приготовлении исходного раствора необходимо осторожно обращаться с порошком. Эта операция должна выполняться на химическом колпачке с защитным оборудованием, включая перчатки, лабораторное покрытие и маску. Кроме того, при решении PFA следует тщательно манипулировать.
    2. Удалите PFA и промойте секции 1x PBS в течение 5-7 мин; Повторите этот шаг 3 раза.
  2. Пермеабилизация отделов мышечной ткани.
    1. Нанесите гидрофобный барьер вокруг секций ткани, используя ручку.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг определяет поверхность вокруг участков ткани и сводит к минимуму объем антител, описанных в шагах 3.4, 3.6, 3.7 и 3.9.
    2. Накройте секции 200 мкл холодного (-20 ° C)Метанола и помещают инкубационную камеру горизонтально внутри морозильной камеры при -20 ° С в течение 5 мин.
    3. Удалите инкубационную камеру из морозильной камеры, аспирируйте метанол и промойте секции с помощью 1X PBS в течение 5-7 минут при комнатной температуре; Повторите этот шаг 3x.
  3. блокировка
    1. Подготовьте свежий блочный раствор 4% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в PBS 1x.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Решение BSA можно хранить в течение 1 недели при 4 ° C.
    2. Инкубируйте секции с блочным раствором не менее 60 минут при комнатной температуре.
    3. Удалите блокирующий раствор.
    4. Подготовьте 100 мкл анти-Fab-смеси, разбавив 20 мкг / мл анти-Fab в 1x PBS. Инкубируйте секции с неконъюгированным аффинно очищенным F (ab) фрагментом антимышиного IgG в течение 1 часа при RT.
  4. Инкубация первичных антител.
    1. Подготовьте 100 мкл первичной смеси антител для каждого слайда путем растворения LC3 и MyoD антител в 4% BSA в 1x PBS. Используйте 5 мкг /Мл анти-LC3 (кроличьего поликлонального антитела) и 10 мг / л анти-MyoD (мышиное моноклональное антитело). Инкубируйте смесь первичных антител в течение ночи при 4 ° C.
  5. Моет.
    1. Удалите смесь первичных антител.
    2. Промойте секции 1% BSA в 1X PBS в течение 10 мин; Повторите этот шаг 3x.
  6. Инкубация вторичных антител.
    1. Подготовьте 100 мкл смеси вторичных антител для каждого слайда. Растворить козьим антикролитом 488 (5 мкг / мл) и козьим антимышиным 594 (5 мкг / мл) в 4% BSA в 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте чрезмерного воздействия света, чтобы предотвратить отбеливание флуорохромом. Выполните следующие шаги в темноте.
    2. Инкубируйте секции со смесью вторичных антител в течение 45 мин при комнатной температуре.
    3. Удалите вторичную смесь антител и промойте секции 1x PBS в течение 5-7 мин; Повторите этот шаг 3x.
  7. Инкубация первичных антител.
    1. Разбавьте ламиниN-2 (α-2-цепное) моноклональное антитело (0,33 мкг / мл) в 4% BSA в 1x PBS с использованием 100 мкл смеси для каждого слайда. Инкубируйте секции в первичной смеси антител в течение 1-2 часов при комнатной температуре.
  8. Моет.
    1. Удалите смесь первичных антител.
    2. Промойте секции 1% BSA в 1X PBS в течение 10 мин; Повторите этот шаг 3x.
  9. Инкубация вторичных антител.
    1. Подготовьте 100 мкл смеси вторичных антител для каждого слайда, разбавив козьим антиратом 647 (5 мкг / мл) в 4% BSA в 1X PBS. Инкубируйте срезы в смеси вторичных антител в течение 45 мин при комнатной температуре.
    2. Удалите вторичную смесь антител и промойте секции 1x PBS в течение 5-7 мин; Повторите этот шаг 3x.
  10. 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
    1. Добавить 200 мкл 300 нМ раствора DAPI в 1x PBS для каждого слайда. Инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре. Храните раствор DAPI при температуре 4 ° C втемно.
    2. Промойте секции 1x PBS в течение 5-7 минут; Повторите этот шаг 3x.
  11. Монтаж окрашенных мышечных секций.
    1. Удалите избыток моющего раствора из секций.
    2. Поместите 10 мкл глицерина в 1x PBS (3: 1) на окрашенные участки посередине слайда и добавьте покровное покрытие, избегая образования пузырьков воздуха.

4. Конфокальная микроскопия

  1. Приобретайте изображения с помощью четырехлазерного конфокального микроскопа, интегрированного с системой захвата изображений и аналитическим программным обеспечением.
    ПРИМЕЧАНИЕ. MyoD конъюгирован с красителем 594, который является ярким красно-флуоресцентным красителем, с возбуждением, идеально подходящим для лазера на 594 нм (возбуждение: 590 нм, излучение: 617 нм). LC3 конъюгирован с красителем 488, который представляет собой ярко-зеленый флуоресцентный краситель с возбуждением, идеально подходящим для лазерной линии 488 нм (возбуждение: 495 нм, эмиссия: 519 нм). Ламинин конъюгирован с красителем 647, которыйЯркий красно-флуоресцентный краситель с возбуждением, идеально подходящим для лазерной линии 647 нм (возбуждение: 650 нм, эмиссия: 668 нм).
  2. Поместите слайды в лоток микроскопа и используйте увеличение 63X для обнаружения ядерных сигналов. Вручную сосредоточьтесь на регенеративных областях, центрируя поля активной регенерации, опираясь на морфологию мышц (см . Рисунок 4 ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя в невозмущенной мышце размер миофибры практически постоянный ( рисунок 4A ), опосредованная травмой регенерация мышц может быть распознана появлением меньших миофибрилл, которые являются вновь образованными волокнами после регенерации. Кроме того, мышца в активной регенерации характеризуется обширным инфильтратом, который сделан из макрофагов, фиброадипогенных предшественников и клеток, которые локализованы для поврежденных мышц, чтобы организовать регенерацию мышц ( рисунок 4B ).
  3. Оценить иммунофлуоресцентное окрашивание в регенеПутем фокусировки на MuSCs, которые расположены под базальной пластинкой миофибрилл.
  4. Сосредоточьтесь на MuSCs, которые являются положительными для MyoD-окрашивания и расположены внутри миофибрилл, отмеченных окрашиванием ламинином (см . Рис. 4B , белые стрелки).
  5. Используйте по крайней мере 3 мыши / экспериментальную группу и используйте микроскоп для получения 63-кратных изображений увеличения по меньшей мере для 7 полей для каждой экспериментальной группы.
  6. Как только регенерирующие области идентифицированы, сфокусируйтесь, используя окрашивание DAPI, а затем настройте другие одиночные каналы.
    1. Используйте следующие настройки микроскопа: канал A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, коэффициент усиления 791; Канал A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, коэффициент усиления 659; Канал A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, коэффициент усиления 719.
  7. После настройки фокуса отдельных каналов продолжайте приобретать изображения с размером кадра 1024 × 1024 и 12,61 мкс.
  8. Подсчитайте процент MyoD-положительных клеток (контроль за tОн правильно расположен под пластиной), которые отрицательны по LC3 и процент MyoD-положительных клеток, которые отображают сигнал LC3.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Процент MyoD-положительных клеток, которые имеют окрашивание LC3, является показанием этого протокола.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол описывает эффективный метод in situ для обнаружения аутофагии в MuSC во время мышечной регенерации.

CTX In Vivo Лечение:

Используйте CTX, чтобы вызвать повреждение мышц в мышцах TA и использовать невозмущенные мышцы в качестве органов управления. Поскольку аутофагия очень динамична, блокируйте аутофагический поток, выполняя IP-инъекции CLQ ( рисунок 1 ). Процедура CLQ необходима для оценки того, активен ли аутофагический поток или поддерживается на базальных уровнях.

Передняя изоляция Tibialis:

Изолируйте мышцу TA, как описано на рисунке 2 , и поместите ее в камеру для формования в ориентации NS, чтобы впоследствии получить поперечные срезы мышц. Этот шагИмеет решающее значение для достижения секций и для определения MuSCs в надлежащем месте под базальной пластиной myofiber.

Гистологическая экспертиза вызванного CTX повреждения мышц

Убедитесь, что мышечная травма произошла путем гистологического окрашивания. Выполните окраску H & E и проверьте под 10-кратным увеличением: в то время как невозмущенные мышцы отображают обычно неизменные размеры myofiber, типичные особенности поврежденных мышц включают нарушение миофибрилл, которые различаются по размеру и обильному воспалительному инфильтрату. Другим параметром, подтверждающим, что происходит регенеративный процесс, является центронуклеация миофибрилл, которая отсутствует в невозмущенных мышцах и является признаком образования новых волокон у мышей, подвергающихся активной регенерации ( рис. 3 ).

Автофагия связана с MyoD-poSitive Cells во время восстановления мышц:

Проведите иммунофлуоресцентное окрашивание, чтобы обнаружить MuSCs, идентифицированные как MyoD-положительные, которые отображают сигнал LC3. Ламининовое окрашивание полезно для размещения MuSCs в правильном положении в нише под базальной пластинкой ( рис. 4 ). Аутофагиальные базальные уровни различают невозмущенные скелетные мышцы и значительно увеличивают совпадение с регенерацией мышц 30 . Соответственно, неповрежденные мыши не проявляют никакой активации MuSC, обнаруженной отсутствием MyoD-положительных клеток и без сигнала LC3. И наоборот, при повреждении мышц MyoD-положительные MuSCs становятся положительными для LC3, демонстрируя, что аутофагический процесс активируется во время мышечной регенерации в активированных сателлитных клетках.

На начальных стадиях регенеративного ответа различные клеточные типы локализуются на участке tОн поражает, включая воспалительные клетки и фиброадипогенные предшественники, что приводит к тому, что поврежденная область плотно переполнена. Крайне важно различать все различные типы клеток, фокусируясь на местоположении MuSC под слоем myofiber и полагаясь на положительность MyoD.

В базальных условиях LC3 экспрессируется повсеместно и едва обнаруживается иммунофлюоресценцией. В результате повышенной аутофагии эта картина окрашивания изменяется и становится заметной в основном в цитоплазме. Оценивая окрашивание MyoD / LC3, считайте, что MuSCs являются маленькими клетками и что цитоплазматическая область ограничена; Это то, почему LC3 может выглядеть perinuclear.

Рисунок 1
Рисунок 1: CTX In Vivo . ( A ) Чтобы вызвать повреждение мышц, вводите 10 мкл 10 мкМ CTX directcВ левых мышцах TA 2-месячных мышей WT. Используйте контралатеральный член как контроль. ( B ) Схематическое изображение индуцированного кардиотоксином мышечной травмы. Через 24 часа после травмы лечить мышей внутрибрюшинными инъекциями 50 мг / кг CLQ каждые 24 часа в течение 4 дней, а затем жертвовать животными. В качестве контроля используйте необработанных не пострадавших и раненых мышей. Этот протокол позволяет изучать участие аутофагического процесса во время регенерации мышц. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Изоляция TA. ( A ) Репрезентативный образ TA, который выглядит перед изоляцией. ( B ) После разреза дистального сухожилия удерживайте мышцу TA сухожилием и осторожноПодтяните мышцу к проксимальному концу (около колена). ( C ) Дискриминация EDL от мышцы TA, которая больше и более поверхностна, чем EDL. Отделите TA от мышцы EDL, потянув два дистальных сухожилия в противоположных направлениях. ( D ) После того, как TA выделен, поместите его в камеру пресс-формы, как описано, в ориентации NS. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: CTX вызывает повреждение мышц. Репрезентативные изображения окрашивания H & E на участках трансверсальной ткани TA из контрольных, не поврежденных ( A ) и 5 ​​d pi ( B ) мышей WT. Окрашивание H & E показывает нормальную морфологию волокон у контрольных мышей ( A ) и массивПовреждение мышц и проникновение в поврежденные мышцы ( B ), демонстрирующие нарушение морфологии при инъекции CTX. Шкала шкалы = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Аутофагия связана с MyoD-положительными клетками во время регенерации мышц. Репрезентативные изображения участков TA из контрольной группы ( A ) и раненых ( B ) мышей WT, иммунизированных LC3 (зеленый) и MyoD (красный). Ламинин (голубой) окрашивает следы мышечных волокон, а ядра контрастируют с DAPI (белый). Правые панели показывают репрезентативные изображения сигнала слияния. Белые стрелки указывают на сателлитные клетки, которые находятся под базальной пластинкой волокна, отмеченной окрашиванием ламинином. ПоследовательностьПротокол ng позволяет измерять аутофагию через окрашивание LC3 в мышечных стволовых клетках, подвергающихся миогенной линии, отмеченной MyoD. Шкала шкалы = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этом протоколе описывается, как контролировать аутофагию в стволовых клетках скелетных мышц во время компенсаторной регенерации мышц. Проанализированы несколько антител для совместного окрашивания LC3 и MyoD, и те, которые работают в срезах ткани мыши и создают успешные результаты, перечислены здесь (см. Таблицу материалов ). Для успешного окрашивания настоятельно рекомендуется пермеабилизация метанолом (см. Шаг 3.2.2).

Ограничение этого протокола связано с внутренней изменчивостью мышей, что заставляет использовать не менее 3 мышей / экспериментальной группы. Эта методология отражает шаг вперед в изучении аутофагии при регенерации скелетных мышц, поскольку большинство результатов Теперь были сделаны в изолированных клетках. Анализ in situ позволил изучить аутофагию в естественной среде без необходимости выделения клеток, которые могут влиять на метаболические процессы, такие как аутофагия.

«Учитывая высокий динамический характер аутофагического процесса, лечение CLQ является критическим шагом для мониторинга аутофагического процесса in vivo. CLQ блокирует более поздние стадии аутофагического процесса, приводя к накоплению LC3 при сохранении аутофагии. Поэтому CLQ-обработка Делает LC3 детектируемым путем исследования на месте . В невозмущенных скелетных мышцах базальный аутофагический процесс не увеличивается при CLQ-обработке, что выявляется в отсутствии обнаруживаемого накопления LC3. Однако в регенерирующих мышцах LC3 накапливается при CLQ-обработке, демонстрируя аутофагическую активацию Критическим шагом является пожертвование мышей в одно и то же время утром ( т . Е. В 10 часов утра). Еще одним критическим шагом в протоколе является идентификация MuSC, который не должен меняться с другим клеточным типом, который населяет поврежденную мышцу во время Регенеративный ответ. Идентификация MuSC под базальной пластинкой, которая отображает положительность MyoD, равна kЧтобы сосредоточиться на спутниковых ячейках.

Таким образом, мы представляем подходящий метод in situ для обнаружения участия аутофагического процесса в MuSC. Этот метод может служить основой для испытаний фармакологических подходов к модуляции аутофагии, которые могут быть использованы для улучшения регенерации скелетных мышц в нормальных и патологических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT для LL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 WT mice
Cardiotoxin 1 Latoxan L8102
Millex-VV Merck Millipore SLVV033RS Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Chloroquine diphosphate salt Sigma-Aldrich C6628 Caution:
Harmful if swallowed
BD Micro-Fine + 0.5 mL BD 324825
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura Finetek 25608-930
Tissue-Tek Cryomold Intermediate Sakura Finetek 4566
2-Methylbutane Sigma-Aldrich 277258
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma-Aldrich HHS32
Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110132
o-Xylene Sigma-Aldrich X1040 Caution:
Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Caution:
Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-094
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Eukitt - Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-007-003
LC3B Antibody Cell signaling Technology 2775
Monoclonal mouse anti-MyoD
(concentrated) clone 5.8A
DAKO - Agilent Pathology Solutions M3512
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody Enzo Life Sciences 4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Life technologies A11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody Life technologies A21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3, (1), (2013).
  2. Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490, (7420), 355-360 (2012).
  3. Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
  4. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, (6), 329-340 (2013).
  5. Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4, (10), 1338-1341 (2005).
  6. Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  7. Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20, (3), 265-271 (2014).
  8. Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20, (3), 255-264 (2014).
  9. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506, (7488), 316-321 (2014).
  10. Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
  11. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20, (10), 1174-1181 (2014).
  12. Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20, (10), 1182-1186 (2014).
  13. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280, (17), 4100-4108 (2013).
  14. Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40, (2), 280-293 (2010).
  15. Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23, (2), 198-206 (2011).
  16. Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24, (1), 69-79 (2014).
  17. Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
  18. Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8, (1), e53664 (2013).
  19. Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24, (12), 635-643 (2013).
  20. Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584, (7), 1411-1416 (2010).
  21. Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16, (11), 1313-1320 (2010).
  22. Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11, (12), 2142-2152 (2015).
  23. Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7, (4), 426-428 (2011).
  24. De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
  25. Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23, (6), 1492-1505 (2014).
  26. Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181, (2), 583-592 (2012).
  27. Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
  28. Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12, (4), 705-706 (2016).
  29. Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (41), 12864-12869 (2015).
  30. Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23, (11), 1839-1849 (2016).
  31. Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (9), 3374-3379 (2008).
  32. Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146, (5), 682-695 (2011).
  33. Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325, (5937), 201-204 (2009).
  34. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, (1), 27-42 (2008).
  35. Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14, (3), 422-428 (2016).
  36. Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106, (48), 20405-20410 (2009).
  37. Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. (2014).
  38. Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126, (Pt 23), 5325-5333 (2013).
  39. Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10, (5), 515-519 (2012).
  40. Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2, (4), 414-426 (2014).
  41. Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33, (23), 2782-2797 (2014).
  42. Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529, (7584), 37-42 (2016).
  43. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, (1), 1-222 (2016).
<em>In Situ</em> Иммунофлуоресцентное окрашивание аутофагии в мышечных клетках
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castagnetti, F., Fiacco, E., Imbriano, C., Latella, L. In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55908, doi:10.3791/55908 (2017).More

Castagnetti, F., Fiacco, E., Imbriano, C., Latella, L. In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55908, doi:10.3791/55908 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter