Summary
L'autophagie active est associée à la régénération musculaire productive, ce qui est essentiel pour l'activation des cellules souches musculaires (MuSC). Ici, nous fournissons un protocole pour la détection in situ de LC3, un marqueur autophagique dans les muSCs MyoD-positives de sections de tissu musculaire à partir de souris témoins et blessées.
Abstract
La preuve croissante indique que l'autophagie est un processus de réglementation crucial pour préserver l'homéostasie des tissus. On sait que l'autophagie est impliquée dans le développement et la régénération du muscle squelettique, et le processus autophagique a été décrit dans plusieurs pathologies musculaires et des troubles musculaires liés à l'âge. Un bloc récemment décrit du processus autophagique qui est en corrélation avec l'épuisement fonctionnel des cellules satellites pendant la réparation musculaire confirme l'idée que l'autophagie active est couplée à la régénération musculaire productive. Ces données révèlent le rôle crucial de l'autophagie dans l'activation des cellules satellites pendant la régénération musculaire dans des conditions normales et pathologiques telles que les dystrophies musculaires. Ici, nous fournissons un protocole pour surveiller le processus autophagique dans le compartiment de cellules souches musculaires adultes (MUSC) pendant les conditions de régénération musculaire. Ce protocole décrit la méthodologie d'installation pour effectuer une imagerie immunofluorescence in situ de LC3, et uneMarqueur d'utophagie et MyoD, un marqueur de lignée myogénique, dans des sections de tissus musculaires du contrôle et des souris blessées. La méthodologie déclarée permet de surveiller le processus autophagique dans un compartiment cellulaire spécifique, le compartiment MuSC, qui joue un rôle central dans l'orchestration de la régénération musculaire.
Introduction
La régénération du muscle squelettique est le résultat de l'interaction entre les cellules souches adultes (Cellules satellites musculaires, MuSC) et d'autres types de cellules impliquées dans le processus de régénération. L'homéostasie musculaire et la fonctionnalité sont maintenues par les signaux combinés découlant de la niche musculaire et des indices systémiques 1 , 2 . Tout au long de la vie, des changements dans la fonctionnalité MuSC, le niche musculaire et les indices systémiques ont été rapportés, entraînant le déclin des capacités fonctionnelles chez les personnes âgées 3 . Les MuSC sont placés dans une niche sous la lame basale et, lors d'une blessure musculaire, sont activés pour réparer les muscles endommagés 4 , 5 . Afin d'assurer une réponse régénératrice productive, il est essentiel que les MUSC coordonnent les différents processus nécessaires à la sortie de la quiescence, de l'auto-renouvellement et de l'expansion proliférative.Par la différenciation myogénique 6 . Chez les personnes âgées et dans les maladies chroniques musculaires, toutes ces fonctions sont compromises, entraînant une altération de la fonctionnalité musculaire 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
La macroatophagie (appelée ci-après autophagie) apparaît comme un processus biologique crucial essentiel pour préserver l'homéostasie des tissus 14 . Le processus autophagique englobe les mécanismes de traite, où des portions de cytoplasme, d'organelles et de protéines sont englouties dans des vésicules qui se dégradent éventuellement via la voie du lysosome, favorisant l'élimination des molécules toxiques et le recyclage du macromoleCules. Cela fournit des composés riches en énergie pour soutenir l'adaptation des cellules et des tissus sous contrainte ou d'autres conditions défavorables 15 , 16 . Avec l'activité de survie cellulaire, l'autophagie peut également fonctionner comme inducteur de la mort cellulaire, selon le contexte du tissu cellulaire ( p. Ex. Tissu normal versus cancer) et le type de stimulus de stress 17 , 18 .
Des preuves récentes indiquent que l'autophagie est nécessaire pour maintenir la masse musculaire et l'intégrité de la myofibre 19 , 20 et a été signalée comme étant altérée dans différentes dystrophies musculaires 21 , 22 , 23 , y compris la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. De même, une réduction progressive du processus autophagique a été observée chez les personnes âgées 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , après une perte de masse musculaire (appelée sarcopénie) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , et dans la survie de myofibres 38 .
Une relation étroite entre l'autophagie et le potentiel régénérateur des muscles squelettiques a été anticipée par une étude du laboratoire de Wagers, qui a montré qu'une restriction calorique améliore la disponibilité et l'activité de MuSC 39 . C'est nonLa nouvelle observation a été confirmée par l'observation récente selon laquelle l'axe Foxo3-Notch active le processus autophagique pendant l'auto-renouvellement 40 et la transition MuSC de l'état de repos à l'état de prolifération 41 . Ces données concordent avec la réduction progressive de l'autophagie basale de jeunes et anciens et de MuSCs gériatriques, en association avec le déclin numérique et fonctionnel des MuSC pendant le vieillissement 42 .
Dans un article récent, nous avons démontré une relation étroite entre l'autophagie et la régénération musculaire compensatoire qui distingue les premiers stades de la progression de la DMD. En conséquence, nous avons observé un flux autophagique réduit aux stades ultérieurs de la progression de la maladie, lorsque la régénération musculaire est compromise et que le dépôt de tissu fibrotique se produit. D'une manière intrigante, nous avons montré que, dans les conditions de régénération, l'autophagie est activée dans les MUSC et que la modulation du processus autophagique affecte l'activation de MuSC et fuNationality 30 .
Dans l'ensemble, ces données mettent en évidence l'urgence d'explorer le processus autophagique dans les MUSC pendant la régénération musculaire dans des conditions normales et pathologiques et tout au long de la vie. Ici, nous fournissons un protocole pour surveiller le processus autophagique dans MuSC dans les conditions de régénération musculaire en effectuant l'immunocoloration in situ pour la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 (LC3) associée aux microtubules, un marqueur de l'autophagie 43 et MyoD, un marqueur de Lignée myogénique, dans les sections de tissu musculaire du contrôle et des souris blessées. La méthodologie déclarée permet de surveiller le processus autophagique dans un compartiment cellulaire spécifique, le MuSC, qui joue un rôle clé dans l'orchestration de la régénération musculaire.
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Protocol
Les souris ont été élevées et entretenues selon les procédures standard de l'installation animale et tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par l'Assurance du bien-être animal et le Comité éthique interne de recherche animale selon le ministère italien de la Santé et ont respecté le Guide NIH pour le soin et l'utilisation de Animaux de laboratoire.
1. Blessure musculaire et le bloc in vivo de flux autophagique
- Blessure musculaire.
- Pour induire une lésion musculaire squelettique aiguë, injecter 20 μL de cardiotoxine 10 μM (CTX) directement dans le muscle tibial antérieur (TA) de souris C57BL / 6J de 2 mois qui pèsent environ 20 g. Utilisez un nombre égal de mâles et de femelles. Utiliser le membre contralatéral non perturbé comme témoin.
REMARQUE: 10 μM de CTX dans une solution de chlorure de sodium à 0,9% doivent être filtrés (filtre PVDF 0,22 μm) et stockés à -20 ° C. Évitez les cycles répétés de congélation-décongélation. - À l'aide d'un iSeringue nsulin avec une aiguille 30 G, injecter CTX au milieu de la TA. Pour provoquer une blessure précise dans l'AT, assurez-vous que l'aiguille de la seringue entre dans le tendon distal, à 5 mm de profondeur, du bas vers le haut du muscle ( figure 1A ).
- Pour induire une lésion musculaire squelettique aiguë, injecter 20 μL de cardiotoxine 10 μM (CTX) directement dans le muscle tibial antérieur (TA) de souris C57BL / 6J de 2 mois qui pèsent environ 20 g. Utilisez un nombre égal de mâles et de femelles. Utiliser le membre contralatéral non perturbé comme témoin.
- Blocage du flux autophagique chez les souris non perturbées et blessées.
- Pour évaluer le flux autophagique, 24 h post-blessure (pi), administrer 50 mg / kg de chloroquine (CLQ) toutes les 24 h pendant 4 jours par injection intraperitoneale (IP) ( Figure 1B ).
- Dissoudre CLQ (10 mg / mL) dans PBS 1X et filtrer à travers une membrane de 0,2 μm. Pesez chaque souris et calculez la quantité de CLQ à injecter.
REMARQUE: Préparez et utilisez la solution CLQ le même jour. Le stock CLQ peut être stocké jusqu'à un mois à -20 ° C. Étant donné que l'autophagie est un processus métabolique, procédez toujours au traitement CLQ toujours au même moment ( c.- à - d. Le matin befoÀ 10 heures du matin).
- Dissoudre CLQ (10 mg / mL) dans PBS 1X et filtrer à travers une membrane de 0,2 μm. Pesez chaque souris et calculez la quantité de CLQ à injecter.
- Pour évaluer le flux autophagique, 24 h post-blessure (pi), administrer 50 mg / kg de chloroquine (CLQ) toutes les 24 h pendant 4 jours par injection intraperitoneale (IP) ( Figure 1B ).
2. Sections de tissus musculaires
- Le sacrifice de la souris.
- Éuthaniser les souris 5 jours après la blessure.
- Effectuer l'euthanasie par dislocation cervicale ou par CO 2 (à suivre par dislocation cervicale pour confirmation). Étant donné que le processus d'autophagie est lié aux habitudes de sommeil / alimentation de la souris, sacrifiez toujours les souris en même temps, de préférence le matin ( c.-à-d. Avant 10 h).
- Isolation et inclusion de TA.
- Avant la dissection, pulvériser la souris avec 70% d'éthanol.
- L'utilisation de ciseaux fait une petite incision perpendiculaire (3 mm de long) sur la peau dorsale de la souris au niveau des hanches. Coupez la queue et les pieds pour simplifier l'élimination de la peau. Tirez la peau vers la queue et retirez-la pour exposer les muscles sous-jacents; Le muscle TA est facile à localiser, comme le montre la figure 2A
- Avec l'aide de deux pinces, saisissez les tendons distal.
- Couper les tendons distal; Les tendons TA et extensor digitorium longus (EDL) sont souvent coupés conjointement et ensuite séparés (voir étape 2.2.6).
- À l'aide d'une pince, maintenez le muscle AT par le tendon et tirez soigneusement le muscle vers l'extrémité proximale (près du genou, figure 2B ).
NOTE: À ce stade, les muscles EDL et TA sont facilement reconnaissables, le TA étant plus grand et plus superficiel que l'EDL. - Séparez la TA du muscle EDL en tirant les deux tendons distal dans les directions opposées ( Figure 2C ).
- Couper le tendon proximal.
- À l'aide d'une pince, retirez le fascia mince qui recouvre le muscle, sans endommager le tissu.
- Retirer l'humidité excessive dans l'échantillon à l'aide d'une serviette en papier. Assurez-vous que le muscle n'est ni humide, ni excessivement sec, car l'humidité excessive produira des signesUn dommage important au muscle et compromet la prochaine coloration.
- Placez le composé de température optimale de coupe (OCT) au bas d'un moule et placez le muscle dans celui-ci, dans l'orientation indiquée sur la figure 2D . Ajouter 100% d'isopentane à un bécher jusqu'à ce qu'il atteigne une profondeur d'environ 3-4 cm. Placez le bécher en contact avec de l'azote liquide dans une boîte en polystyrène.
- Ne laissez pas l'azote liquide entrer dans le bécher, car il produira une mousse bouillonnante, qui peut affecter l'inclusion et endommager les sections musculaires.
- Observez l'isopentane et attendez jusqu'à ce qu'il atteigne la température appropriée (entre -140 ° C et -150 ° C); À la température appropriée, une couche blanche solide d'isopentane congelé cristallisera au fond du bécher.
- Si l'isopentane gèle entièrement le solide, fondre et refroidir à la température de congélation avant de passer à l'étape suivante.
- À l'aide de pinces préchauffées, abaisser délicatement le moule dansL'isopentane pendant environ 20 à 30 s. Placez l'échantillon congelé dans un récipient avec de la glace carbonique jusqu'à ce qu'il soit transféré à un congélateur de -80 ° C.
REMARQUE: le protocole peut être mis en pause ici.
- Cryosections de tissus musculaires.
- Après au moins une nuit à -80 ° C, effectuez une cryotypie.
- Retirez le couteau cryostat et la plaque anti-roulement du congélateur -20 ° C et placez-les sur les supports respectifs dans l'armoire cryostat.
- Mettez une goutte d'OCT sur le talon de l'échantillon et placez-le sur l'échantillon congelé, en orientation NS verticale, tel que visualisé sur la figure 2D .
- Placez le talon d'échantillon sur le mandrin.
- Sans tirer la plaque anti-roulement sur le couteau, faites quelques coupes à 40 μm pour éliminer les PTOM qui ne comprennent pas les muscles. Lorsque le muscle devient visible, réduisez l'épaisseur de la tranche à 7-8 μm.
- Retirer la plaque anti-roulement jusqu'à ce qu'elle soit alignée avecLe bord du couteau ou un peu au-dessus.
- Couper les sections transversales de 7 à 8 μm d'épaisseur et monter 3-4 tranches par lame histologique.
REMARQUE: La température recommandée du cryostat est comprise entre -15 ° C et -23 ° C. Des coupes transversales des échantillons sont nécessaires pour l'analyse ultérieure pour identifier les cellules souches musculaires dans la position de niche du satellite. - Pour maximiser l'adhérence de la section, garder les diapositives à température ambiante pendant 10 à 15 minutes afin d'éviter leur détachement pendant l'incubation des anticorps.
NOTE: L'étape de séchage à l'air pourrait affecter l'immunocoloration, fournissant des résultats ambigus. Les diapositives peuvent être conservées sans fixation pendant plusieurs mois à -80 ° C. Le protocole peut être mis en pause ici.
- Vérification des dommages musculaires dans les criosections des muscles TA en effectuant une coloration par l'éosine à l'hématoxyline (H & E).
- Évaluer la qualité du muscle ( c.-à-d. L'efficacité de la lésion, l'isolement musculaire et l'inclusionIon, et criosections), effectuer une coloration H & E. Pour chaque point de temps expérimental, réparer une diapositive avec 4% de PFA pendant 10 min. Après la fixation, lavez les glissières bien dans plusieurs changements de 1x PBS.
REMARQUE: Attention. Le PFA est cancérogène et doit être manipulé avec soin. - Prenez une diapositive pour chaque point expérimental et placez-les dans un pot de coloration.
- Remplir le pot avec une hématoxyline à 9 g / L jusqu'à ce que les sections soient recouvertes et incuber pendant 8 min.
- Recyclez l'hématoxyline.
- Laissez le pot sous l'eau courante pendant 10 minutes pour éliminer l'excès d'hématoxyline.
REMARQUE: Assurez-vous de ne pas couler l'eau directement sur les sections. - Laver à l'aide d'eau stérilisée.
- Incuber les sections avec de l'éosine à 0,5% (p / v) dans de l'éthanol acidifié à 90% pendant 1 min.
- Recyclez l'eosine.
- Laver deux fois avec de l'eau stérile pendant 3 min / laver.
REMARQUE: procédez comme suit à un capot chimique. - Lavez les sections avec 70% d'éthanol.
- lavageLes sections avec 90% d'éthanol.
- Lavez les sections à 100% d'éthanol.
- Incuber les sections avec 0,879 g / ml d'o-Xylène.
REMARQUE: Attention. L'o-Xylène est inflammable et modérément toxique. Manipulez-le sous un capot chimique, portant un équipement de protection, y compris des gants, une blouse de laboratoire et un masque. - Recyclez l'o-Xylène.
- Mettez les glissières sur un morceau de papier pour sécher.
- Fermez les diapositives à l'aide d'un support de fixation à base de xylène rapide.
- Vérifiez la qualité des sections sous un microscope optique au grossissement 10X (voir la figure 3 )
REMARQUE: le protocole peut être mis en pause ici.
- Évaluer la qualité du muscle ( c.-à-d. L'efficacité de la lésion, l'isolement musculaire et l'inclusionIon, et criosections), effectuer une coloration H & E. Pour chaque point de temps expérimental, réparer une diapositive avec 4% de PFA pendant 10 min. Après la fixation, lavez les glissières bien dans plusieurs changements de 1x PBS.
3. Immunomarquage pour LC3 et MyoD dans les sections de tissus musculaires blessés
- Fixation des sections de tissu musculaire.
- Préparer une chambre d'incubation en mouillant un morceau de papier et en le plaçant au fond d'une boîte en plastique fermable pour maintenir un hautVel d'humidité à l'intérieur de la chambre. Réparer les sections de tissu avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA) dans 1x PBS pendant 10 min.
REMARQUE: Un morceau de papier humide est utilisé pour éviter de sécher l'échantillon. Préparez PFA frais ou utilisez PFA stocké à -20 ° C. Mise en garde. PFA est toxique; La poudre doit être manipulée avec soin lors de la fabrication de la solution stock. Cette opération doit être effectuée dans un capot chimique, avec un équipement de protection, y compris des gants, une blouse de laboratoire et un masque. De plus, en solution, le PFA doit être manipulé avec précaution. - Retirez le PFA et lavez les sections avec 1x PBS pendant 5 à 7 minutes; Répétez cette étape 3 fois.
- Préparer une chambre d'incubation en mouillant un morceau de papier et en le plaçant au fond d'une boîte en plastique fermable pour maintenir un hautVel d'humidité à l'intérieur de la chambre. Réparer les sections de tissu avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA) dans 1x PBS pendant 10 min.
- Perméabilisation des sections de tissu musculaire.
- Dessinez une barrière hydrophobe autour des sections de tissu en utilisant un stylo pap.
NOTE: Cette étape définit la surface autour des sections de tissu et minimise le volume d'anticorps décrit aux étapes 3.4, 3.6, 3.7 et 3.9. - Couvrir les sections avec 200 μL de froid (-20 ° C)Metanol et mettre la chambre d'incubation horizontalement à l'intérieur d'un congélateur à -20 ° C pendant 5 min.
- Retirer la chambre d'incubation du congélateur, aspirer le méthanol et laver les sections avec 1X PBS pendant 5 à 7 minutes à la température ambiante; Répétez cette étape 3x.
- Dessinez une barrière hydrophobe autour des sections de tissu en utilisant un stylo pap.
- Blocage
- Préparer une solution de blocs frais de 4% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans PBS 1x.
REMARQUE: la solution BSA peut être stockée pendant 1 semaine à 4 ° C. - Incuber les sections avec une solution de bloc pendant au moins 60 minutes à la RT.
- Retirez la solution de blocage.
- Préparer 100 μL de mélange anti-Fab en diluant 20 μg / mL anti-Fab dans 1x PBS. Incuber les sections avec un fragment F (ab) purifié par affinité sans contrainte d'IgG anti-souris pendant 1 h à la température ambiante.
- Préparer une solution de blocs frais de 4% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans PBS 1x.
- Incubation d'anticorps primaire.
- Préparer 100 μL de mélange d'anticorps primaire pour chaque diapositive en dissolvant les anticorps LC3 et MyoD dans 4% de BSA dans 1x PBS. Utiliser 5 μg /Ml d'anti-LC3 (anticorps polyclonal de lapin) et 10 mg / L d'anti-MyoD (anticorps monoclonal de souris). Incuber le mélange d'anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C.
- Lavages.
- Retirer le mélange d'anticorps primaire.
- Laver les sections avec 1% de BSA dans 1X PBS pendant 10 min; Répétez cette étape 3x.
- Incubation secondaire d'anticorps.
- Préparez 100 μL de mélange d'anticorps secondaire pour chaque diapositive. Dissoudre le chèvre anti-lapin 488 (5 μg / mL) et la chèvre anti-souris 594 (5 μg / mL) dans de la BSA à 4% dans 1x PBS.
REMARQUE: Évitez l'exposition excessive à la lumière pour éviter le blanchiment au fluorochrome. Effectuez les étapes suivantes dans l'obscurité. - Incuber les sections avec le mélange d'anticorps secondaire pendant 45 minutes à la RT.
- Retirer le mélange d'anticorps secondaire et laver les sections avec 1x PBS pendant 5 à 7 minutes; Répétez cette étape 3x.
- Préparez 100 μL de mélange d'anticorps secondaire pour chaque diapositive. Dissoudre le chèvre anti-lapin 488 (5 μg / mL) et la chèvre anti-souris 594 (5 μg / mL) dans de la BSA à 4% dans 1x PBS.
- Incubation d'anticorps primaire.
- Diluer laminiAnticorps monoclonal n-2 (α-2-chaîne) (0,33 μg / mL) dans BSA à 4% dans 1x PBS en utilisant 100 μL de mélange pour chaque diapositive. Incuber les sections dans le mélange d'anticorps primaire pendant 1-2 h à la température ambiante.
- Lavages.
- Retirer le mélange d'anticorps primaire.
- Laver les sections avec 1% de BSA dans 1X PBS pendant 10 min; Répétez cette étape 3x.
- Incubation secondaire d'anticorps.
- Préparez 100 μL de mélange d'anticorps secondaires pour chaque diapositive en diluant le chèvre anti-rat 647 (5 μg / mL) dans 4% de BSA dans 1X PBS. Incuber les sections dans le mélange d'anticorps secondaire pendant 45 minutes à la RT.
- Retirer le mélange d'anticorps secondaire et laver les sections avec 1x PBS pendant 5 à 7 minutes; Répétez cette étape 3x.
- 4 ', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI).
- Ajouter 200 μL de solution de DAPI 300 nM dans 1x PBS à chaque diapositive. Incuber pendant 5 min à la RT. Conserver la solution DAPI à 4 ° C dans lefoncé.
- Laver les sections avec 1x PBS pendant 5 à 7 minutes; Répétez cette étape 3x.
- Montage des sections musculaires colorées.
- Retirer l'excès de solution de lavage des sections.
- Placer 10 μL de glycérol dans 1x PBS (3: 1) sur les sections teintes au milieu de la glissière et ajouter un lamelle, évitant ainsi la formation de bulles d'air.
4. Acquisition de microscopie confocale
- Acquérir les images en utilisant un microscope confocal à quatre laser intégré avec un système de capture d'image et un logiciel d'analyse.
REMARQUE: MyoD est conjugué avec un colorant 594 qui est un colorant fluorescent rouge brillant, avec une excitation idéale pour le laser 594 nm (excitation: 590 nm, émission: 617 nm). Le LC3 est conjugué avec un colorant 488 qui est un colorant fluorescent vert clair, avec une excitation idéale pour la ligne laser 488 nm (excitation: 495 nm, émission: 519 nm). Le strainin est conjugué avec un colorant 647 qui estUn colorant brillant fluorescent lointain-rouge, avec une excitation idéale pour la ligne laser 647 nm (excitation: 650 nm, émission: 668 nm). - Placez les diapositives dans le bac du microscope et utilisez un grossissement de 63X pour détecter les signaux nucléaires. Concentrez-vous manuellement sur les zones régénératrices en centrant les champs de régénération active, en s'appuyant sur la morphologie musculaire (voir la figure 4 ).
NOTE: Dans le muscle non perturbé, la taille des myofibres est pratiquement constante ( figure 4A ), la régénération musculaire médiée par les blessures peut être reconnue par l'apparition de petites myofibres, qui sont les fibres nouvellement formées après la régénération. En outre, le muscle en régénération active se caractérise par un infiltrage important qui est constitué de macrophages, de précurseurs fibro-adipogènes et de cellules localisées sur les muscles endommagés pour organiser la régénération musculaire ( figure 4B ). - Évaluer la coloration immunofluorescente dans le regenEn mettant l'accent sur les MUSC qui sont situés sous la lame basale des myofibres.
- Concentrez-vous sur les MUSC qui sont positifs pour la coloration MyoD et positionnés dans les myofibres marqués par la coloration à la laminine (voir la figure 4B , flèches blanches).
- Utilisez au moins 3 souris / groupe expérimental et utilisez le microscope pour acquérir des images de grossissement 63X d'au moins 7 champs pour chaque groupe expérimental.
- Une fois que les zones régénératives sont identifiées, concentrez-vous avec la coloration DAPI, puis ajustez les autres canaux individuels.
- Utilisez les paramètres de microscope suivants: Canal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Channel A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Channel A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719.
- Après avoir ajusté la mise au point des canaux individuels, procédez à l'acquisition des images à une taille de cadre de 1 024 x 1 024 et à un intervalle de pixels de 12,61 μs.
- Comptez le pourcentage de cellules MyoD positives (contrôle pour tIl corrige l'emplacement sous la lame) qui sont négatifs pour le LC3 et le pourcentage de cellules MyoD-positives qui affichent un signal LC3.
REMARQUE: Le pourcentage de cellules MyoD positives qui présentent une coloration LC3 est la lecture de ce protocole.
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Representative Results
Ce protocole décrit une méthode in situ efficace pour détecter l'autophagie dans les MUSC pendant la régénération musculaire.
Traitements CTX In Vivo :
Utilisez CTX pour induire des dommages musculaires dans les muscles TA et utilisez des muscles non perturbés comme témoins. Puisque l'autophagie est très dynamique, bloquez le flux autophagique en effectuant des injections IP de CLQ ( Figure 1 ). Le traitement CLQ est essentiel pour évaluer si le flux autophagique est actif ou est conservé au niveau basal.
Isolation antérieure de Tibialis:
Isoler le muscle AT, tel que décrit à la Figure 2 , et le placer dans une chambre de moule dans l'orientation NS pour ensuite obtenir des sections transversales du tissu musculaire. Cette étapeEst crucial pour atteindre les sections et pour identifier MuSCs au bon emplacement sous la lame basique de la myofibre.
Examen hystologique du dommage musculaire induit par CTX
Vérifiez que des blessures musculaires se sont produites en effectuant une coloration histologique. Effectuez la coloration H & E et vérifiez sous un grossissement de 10X: les muscles non perturbés affichent des dimensions de myofibres généralement invariantes, les caractéristiques typiques des muscles blessés incluent la perturbation des myofibres qui sont de taille différente et un infiltrat inflammatoire abondant. Un autre paramètre pour confirmer que le processus de régénération se déroule est la centro-nucléation des myofibres, qui est absente dans les muscles non perturbés et est un signe de formation de nouvelles fibres chez la souris subissant une régénération active ( figure 3 ).
Autophagy est couplé à MyoD-poCellules sensibles pendant la régénération musculaire:
Effectuer une coloration immunofluorescente pour détecter les MUSC, identifiés comme MyoD-positive, qui affichent un signal LC3. La coloration au stratifiant est utile pour localiser les MUSC dans la position appropriée dans la niche sous la lame basale ( Figure 4 ). Les niveaux basiques autophagiques distinguent les muscles squelettiques non perturbés et augmentent de façon significative en coïncidence avec la régénération musculaire 30 . En conséquence, les souris non blessées ne montrent aucune activation MuSC, détectée par l'absence de cellules MyoD positives et sans signal LC3. À l'inverse, lors d'un endommagement musculaire, les muSCs MyoD positifs deviennent positifs pour LC3, démontrant que le processus autophagique est activé pendant la régénération musculaire dans les cellules satellites activées.
Au cours des étapes initiales de la réponse régénérative, différents types cellulaires se localisent sur le site de tLa lésion, y compris les cellules inflammatoires et les précurseurs fibro-adipogènes, rendant la zone blessée fortement surpeuplée. Il est crucial de distinguer entre tous les différents types cellulaires, en se concentrant sur l'emplacement MuSC sous la lame de myofibre et en s'appuyant sur la positivité MyoD.
Dans les conditions basales, la LC3 est exprimée de manière omniprésente et est à peine détectée par immunofluorescence. À la suite d'une autophagie élevée, ce modèle de coloration change et devient détectable principalement dans le cytoplasme. Lors de l'évaluation de la coloration MyoD / LC3, considérez que les MUSC sont de petites cellules et que la région cytoplasmique est limitée; C'est pourquoi LC3 peut paraître périnucléaire.
Figure 1: traitements CTX In Vivo . ( A ) Pour induire des dégâts musculaires, injecter 10 μL de 10 μM CTX direcDans les muscles TA gauche des souris WT de 2 mois. Utilisez le membre contralateral comme un contrôle. ( B ) Représentation schématique de la lésion musculaire induite par la cardiotoxine. 24 h après la blessure, traiter les souris avec des injections intrapéritonéales de 50 mg / kg CLQ toutes les 24 h pendant 4 jours puis sacrifier les animaux. Utiliser les souris non blessées et non blessées comme témoins. Ce protocole permet l'étude de l'implication du processus autophagique pendant la régénération musculaire. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Isolation TA. ( A ) Image représentative de la TA comme elle l'examine avant l'isolement. ( B ) Après avoir coupé le tendon distal, maintenez le muscle TA par le tendon et prudentTirez le muscle vers l'extrémité proximale (près du genou). ( C ) Discrimine l'EDL du muscle TA, qui est plus large et plus superficiel que l'EDL. Séparez la TA du muscle EDL en tirant les deux tendons distal dans des directions opposées. ( D ) Une fois que le TA est isolé, placez-le dans la chambre du moule, comme décrit, en orientation NS. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: CTX induit des dommages musculaires. Des images représentatives de la coloration H & E sur les sections transversales de tissu TA à partir des souris témoins, non blessées ( A ) et 5 d pi ( B ) WT. La coloration H & E révèle une morphologie fibreuse normale chez les souris témoins ( A ) et massivDommage musculaire et infiltration dans les muscles blessés ( B ), démontrant une morphologie altérée lors de l'injection CTX. Barre d'échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: L'autophagie est couplée aux cellules MyoD positives pendant la régénération musculaire. Images représentatives des sections TA du contrôle ( A ) et des souris blessées ( B ) WT immunostained avec LC3 (vert) et MyoD (rouge). Les taches de stratification (cyan) et les fibres musculaires et les noyaux sont contrastés avec DAPI (blanc). Les panneaux de droite montrent des images représentatives du signal de fusion. Les flèches blanches indiquent des cellules satellites qui se trouvent sous la lame basale de la fibre marquée par la coloration à la laminine. Le suiviLe protocole ng permet de mesurer l'autophagie à travers la coloration LC3 dans des cellules souches musculaires subissant une lignée myogénique, marquée par MyoD. Barre d'échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole décrit comment surveiller l'autophagie dans les cellules souches du muscle squelettique pendant la régénération musculaire compensatoire. Plusieurs anticorps pour la co-coloration de LC3 et MyoD ont été essayés, et ceux qui travaillent dans des sections de tissus de souris et créent des résultats réussis sont listés ici (voir la Table des matériaux ). La perméabilisation avec le méthanol (voir étape 3.2.2) est fortement recommandée pour une coloration réussie.
La limitation de ce protocole est liée à la variabilité intrinsèque des souris, ce qui implique l'utilisation d'au moins 3 souris / groupe expérimental. Cette méthodologie reflète un pas en avant dans l'étude de l'autophagie lors de la régénération du muscle squelettique, la majorité des résultats Jusqu'à maintenant étaient fabriqués dans des cellules isolées. L'analyse in situ a permis d'étudier l'autophagie dans l'environnement naturel, sans avoir besoin d'isoler les cellules qui pourrait affecter les processus métaboliques, comme l'autophagie.
"> Étant donné la nature très dynamique du processus autophagique, les traitements CLQ sont une étape critique pour la surveillance du processus autophagique in vivo. CLQ bloque les étapes ultérieures du processus autophagique, entraînant une accumulation de LC3 lorsque l'autophagie est maintenue. Par conséquent, le traitement CLQ Rend le LC3 détectable par un examen in situ . Dans les muscles squelettiques non perturbés, le processus autophagique basal n'est pas encore augmenté par le traitement CLQ, comme en témoigne l'absence d'accumulation détectable de LC3. Cependant, dans les muscles régénérants, le LC3 s'accumule lors du traitement CLQ, démontrant une activation autophagique Une étape critique consiste à sacrifier les souris en même temps le matin ( c.- à -d. À 10 heures). Une autre étape critique dans le protocole est l'identification de MuSC, qui ne doit pas être échangé avec un autre type cellulaire qui remplit les muscles endommagés pendant la période Réponse regénérative. L'identification des MuSC sous la lame basale qui affiche la positivité MyoD est la kPour centrer sur les cellules satellites.En résumé, nous présentons une méthode in situ appropriée pour détecter l'implication du processus autophagique dans les MUSC. Cette technique peut servir de base aux tests d'approches pharmacologiques de la modulation autophagique, qui pourraient être utilisés pour améliorer la régénération du muscle squelettique dans des conditions normales et pathologiques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT à LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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