Summary
Actieve autofagie is geassocieerd met productieve spierregeneratie, die essentieel is voor het activeren van spierstamcellen (MuSC). Hier bieden we een protocol voor de in situ detectie van LC3, een autofagie marker in MyoD-positieve MuSCs van spierweefsel secties van controle en gewonde muizen.
Abstract
Toenemende bewijzen wijzen op autofagie als een cruciaal regulerend proces om weefsel homeostase te behouden. Het is bekend dat autofagie betrokken is bij ontwikkeling van de skeletspier en regeneratie, en het autofagische proces is beschreven in verscheidene spierpathologieën en leeftijdsgebonden spierstoornissen. Een recent beschreven blok van het autofagische proces dat correleert met de functionele uitputting van satellietcellen tijdens spierherstel ondersteunt het idee dat actieve autofagie gekoppeld is aan productieve spierregeneratie. Deze gegevens onthullen de cruciale rol van autofagie bij satellietcelactivering tijdens spierregeneratie in zowel normale als pathologische aandoeningen, zoals spierdystrofieën. Hier bieden we een protocol om het autofagische proces in het volwassen spierstamcel (MuSC) compartiment te monitoren tijdens spierregeneratieve condities. Dit protocol beschrijft de opzetmethode om in situ immunofluorescentie beeldvorming van LC3, een a uit te voerenUtophagy marker, en MyoD, een myogene afstammingsmarkering, in spierweefselsecties van controle en gewonde muizen. De gemelde methode maakt het mogelijk om het autofagische proces in een specifiek celcompartiment, het MuSC compartiment, te monitoren, dat een centrale rol speelt bij het regenereren van spieren.
Introduction
Skeletspierregeneratie is het gevolg van de interactie tussen volwassen stamcellen (Spier Satellietcellen, MuSCs) en andere celsoorten die betrokken zijn bij het regeneratieve proces. Spierhomeostase en functionaliteit worden gehandhaafd door de gecombineerde signalen die voortvloeien uit de spiernis en systemische cues 1 , 2 . Gedurende het hele leven zijn veranderingen in de MuSC-functionaliteit, de spiernis en de systemische signalen aangemeld, waardoor de functionele capaciteiten bij ouderen dalen 3 . MuSCs worden in een nis onder de basale lamina geplaatst en bij spierbesering geactiveerd om beschadigde spieren 4 , 5 te repareren. Om een productief regeneratief antwoord te waarborgen is het van cruciaal belang dat MuSCs verschillende processen coördineren die nodig zijn voor het verlaten van stilstand, de zelfvernieuwing en de proliferatieve expansie fase gevolgdDoor de myogene differentiatie 6 . Bij ouderen en bij spierchronische aandoeningen worden al deze functies gecompromitteerd, wat leidt tot gewijzigde spierfunctionaliteit 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Macroautophagy (hierna aangeduid als autofagie) komt tot uiting als een cruciaal biologisch proces dat essentieel is voor het behouden van weefsel homeostase 14 . Het autofagische proces omvat handelmeganismes, waarbij delen van cytoplasma, organellen en eiwitten in vesicles worden opgezwollen die uiteindelijk worden afgebroken via de lysosoomweg, het bevorderen van de verwijdering van toxische moleculen en de recycling van macromolecules. Dit biedt energie-rijke verbindingen om cel- en weefselaanpassing onder stress of andere ongunstige omstandigheden 15 , 16 te ondersteunen. Samen met de celoverlevingsactiviteit kan autofagie ook werken als een celdoodinducer, afhankelijk van de celweefselcontext ( bijv. Normaal versus kankerweefsel) en het type stressstimulus 17 , 18 .
Recent bewijzen wijzen erop dat autofagie nodig is om spiermassa en myofiberintegriteit 19 , 20 te behouden en is gerapporteerd te zijn in verschillende spierdystrofieën 21 , 22 , 23 , waaronder Duchenne Spierdystrofie (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. Op dezelfde manier is een progressieve vermindering van het autofagische proces waargenomen bij ouderen 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , na verlies van spiermassa (aangeduid als sarcopenie) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 en in het overleven van myofiber 38 .
Een nauw verband tussen autofagie en het regeneratieve potentieel van skeletspieren werd verwacht door een studie van het laboratorium van Wagers, waaruit blijkt dat een caloriebeperking de beschikbaarheid en de activiteit van MuSC verhoogt 39 . Dit nrWerd verder ondersteund door de recente observatie dat de Foxo3-Notch-as het autofagische proces activeert tijdens zelfvernieuwing 40 en de MuSC-overgang van de rustende naar de prolifererende toestand 41 . Deze gegevens komen overeen met de geleidelijke vermindering van basale autofagie van jonge tot oude en geriatrische MuSCs, in samenhang met de numerieke en functionele afname van MuSC's tijdens veroudering 42 .
In een recent document bleek een nauwe relatie tussen autofagie en de compenserende spierregeneratie die de vroege stadia van DMD-progressie onderscheidt. Bijgevolg observeerden we een verminderde autofagische flux bij latere stadia van de ziekteprogressie, wanneer spierregeneratie gecompromitteerd is en fibrotische weefselafzetting optreedt. Opvallend, we hebben aangetoond dat bij regenererende omstandigheden autofagie geactiveerd wordt in MuSCs en dat het moduleren van het autofagische proces invloed heeft op MuSC-activering en fuNctionaliteit 30 .
Al deze gegevens duiden de urgentie op om het autofagische proces in MuSCs te onderzoeken tijdens spierregeneratie tijdens normale en pathologische omstandigheden en gedurende de levensduur. Hier voorzien we in een protocol om het autofagische proces in MuSCs te controleren in spierregeneratieve condities door in situ immunostaining voor microtubule-geassocieerde eiwit 1A / 1B-lichte keten 3 (LC3), een marker van autofagie 43 en MyoD, een marker van Myogene afstamming, in spierweefselsecties van controle en gewonde muizen. De gemelde methode maakt het mogelijk om het autofagische proces in een specifiek celcompartiment, de MuSC, te monitoren, die een sleutelrol speelt bij het regenereren van spieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen werden gefokt en gehandhaafd volgens de standaard dierlijke faciliteit procedures en alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Animal Welfare Assurance en het interne Animal Research Ethical Committee volgens het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid en voldoet aan de NIH Guide for Care and Use of Laboratoriumdieren.
1. Spierbesering en het In vivo Blok van Autofagische Flux
- Spierbesering.
- Om acuut skeletspierletsel te veroorzaken, injecteer 20 μL 10 μM cardiotoxine (CTX) voorraad direct in de linker tibialis anterior (TA) spier van 2 maanden oude C57BL / 6J muizen die ongeveer 20 g wegen. Gebruik een even aantal mannen en vrouwen. Gebruik de onbelaste contralaterale ledemaat als een controle.
OPMERKING: 10 μM CTX in 0,9% natriumchloride oplossing moet gefiltreerd worden (0,22 μm PVDF filter) en opgeslagen bij -20 ° C. Vermijd herhaalde vries-ontdooi cycli. - Een i gebruikenNsulin spuit met een 30 G-naald, injecteer CTX in het midden van de TA. Om een nauwkeurig letsel in de TA te veroorzaken, moet u ervoor zorgen dat de naald van de spuit in de buurt van de distale pees, 5 mm diep, van onder naar boven van de spier komt ( Figuur 1A ).
- Om acuut skeletspierletsel te veroorzaken, injecteer 20 μL 10 μM cardiotoxine (CTX) voorraad direct in de linker tibialis anterior (TA) spier van 2 maanden oude C57BL / 6J muizen die ongeveer 20 g wegen. Gebruik een even aantal mannen en vrouwen. Gebruik de onbelaste contralaterale ledemaat als een controle.
- Blockade van de autofagische flux in ongeperste en gewonde muizen.
- Om de autofagische flux te beoordelen, 24 uur na-letsel (pi), administreren elke 24 uur 50 mg / kg chloroquine (CLQ) per 4 d door intraperitoneale (IP) injectie ( Figuur 1B ).
- Los CLQ (10 mg / ml) in PBS 1X op en filtreer het door een 0,2 μm membraan. Weeg elke muis en bereken de hoeveelheid CLQ om te injecteren.
OPMERKING: Bereid en gebruik de CLQ oplossing op dezelfde dag. CLQ voorraad kan gedurende maximaal één maand bij -20 ° C worden opgeslagen. Aangezien autofagie een metabolisch gerelateerd proces is, moet u altijd tegelijkertijd de CLQ-behandeling uitvoeren ( dwz in de ochtendbefoOm 10 uur).
- Los CLQ (10 mg / ml) in PBS 1X op en filtreer het door een 0,2 μm membraan. Weeg elke muis en bereken de hoeveelheid CLQ om te injecteren.
- Om de autofagische flux te beoordelen, 24 uur na-letsel (pi), administreren elke 24 uur 50 mg / kg chloroquine (CLQ) per 4 d door intraperitoneale (IP) injectie ( Figuur 1B ).
2. Spierweefselafdelingen
- Muis offer.
- Euthanize de muizen 5 dagen na het letsel.
- Doe euthanasie door cervicale ontwrichting of door CO 2 (gevolgd door cervicale dislocatie ter bevestiging). Aangezien het autofagieproces verband houdt met slaap- en eetgewoonten, geef de muizen altijd tegelijkertijd op, bij voorkeur in de ochtend ( dus vóór 10 uur).
- TA isolatie en inclusie.
- Spuit de muis met 70% ethanol voor de dissectie.
- Met behulp van een schaar maakt u een kleine loodrechte incisie (3 mm lang) op de dorsale huid van de muis op het niveau van de heupen. Snijd de staart en de voeten om de huidverwijdering te vereenvoudigen. Trek de huid naar de staart en verwijder deze om de onderliggende spieren bloot te leggen; De TA spier is gemakkelijk te lokaliseren, zoals getoond in figuur 2A
- Grijp de distale pezen met behulp van twee pincetjes.
- Knip de distale pezen; De TEN- en extensor digitorium longus (EDL) pezen worden vaak gezamenlijk gesneden en later gescheiden (zie stap 2.2.6).
- Gebruik de tang om de T-spier vast te houden en trek de spier voorzichtig naar het proximale uiteinde (bij de knie, Figuur 2B ).
OPMERKING: op dit moment zijn de EDL- en TA-spieren gemakkelijk herkenbaar, de TA is groter en oppervlakkiger dan de EDL. - Scheid de TA uit de EDL-spier door de twee distale pezen in tegengestelde richting te trekken ( figuur 2C ).
- Snijd de proximale pees.
- Verwijder de dunne fascia die de spier bedekt, zonder het weefsel te beschadigen.
- Verwijder te veel vocht in het monster met behulp van een papieren handdoek. Zorg ervoor dat de spier niet nat is, noch overdreven droog, aangezien te veel vocht zich zal veroorzakenBelangrijke schade aan de spier en in gevaar brengen de volgende kleuring.
- Plaats de optimale snijtemperatuur (OCT) op de bodem van een matrijs en plaats de spier erin, in de richting die wordt weergegeven in figuur 2D . Voeg 100% isopentaan toe aan een beker tot het diepte van ongeveer 3-4 cm bereikt. Plaats de beker in contact met vloeibaar stikstof in een polystyreen doos.
- Laat de vloeibare stikstof niet in de beker, want het zal een bubbelschuim produceren, die de opname kan beïnvloeden en de spiersecties kunnen beschadigen.
- Let op het isopentaan en wacht tot het de juiste temperatuur bereikt (tussen -140 ° C en -150 ° C); Bij de juiste temperatuur zal een vaste witte laag bevroren isopentaan op de bodem van de beker kristalliseren.
- Als het isopentaan helemaal bevrijdt, smelt en koel het tot bevriezingstemperatuur voordat u verder gaat naar de volgende stap.
- Met behulp van voorgekookte tang, verlaag de vorm fijn inHet isopentaan voor ongeveer 20-30 s. Plaats het bevroren monster in een container met droogijs totdat het overgebracht wordt naar een -80 ° C vriezer.
OPMERKING: het protocol kan hier worden onderbroken.
- Spierweefselcryosecties.
- Na minstens een nacht bij -80 ° C, voer cryosectie uit.
- Breng het cryostatmes en de anti-rolplaat uit de -20 ° C vriezer en plaats ze op de respectieve steunen in de cryostatkast.
- Zet een druppel OCT op de steekproef en plaats het bevroren monster, in verticale NS-oriëntatie, zoals weergegeven in Figuur 2D .
- Plaats de steekproef op de chuck.
- Zet, zonder de anti-rolplaat op het mes te trekken, een aantal snijdingen van 40 μm om zich te ontdoen van OCT die geen spier bevat. Wanneer de spier zichtbaar wordt, verminder de schijfdikte tot 7-8 μm.
- Trek de anti-rolplaat naar beneden totdat deze afgestemd isDe rand van het mes of een beetje daarboven.
- Snijd transversale secties 7-8 μm dik en zet 3-4 plakjes per histologische dia.
OPMERKING: De voorgestelde cryostatietemperatuur is tussen -15 ° C en -23 ° C. Dwarsdoorsneden van de monsters zijn nodig voor de daaropvolgende analyse om de spierstamcellen in de satelliet-niche positie te bepalen. - Om de aanhechting van de sectie te maximaliseren, houd de dia's bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten, om te voorkomen dat ze losmaken tijdens antilichaam incubatie.
OPMERKING: De luchtdrogingsstap kan immunostaining beïnvloeden, waardoor dubbelzinnige resultaten worden verkregen. Slides kunnen gedurende enkele maanden onbeperkt bij -80 ° C worden opgeslagen. Het protocol kan hier worden onderbroken.
- Controleer op spierbeschadiging bij cryosecties van TA-spieren door hematoxyline-Eosin (H & E) -vlek te verrichten.
- Om de kwaliteit van de spier te evalueren ( dwz de effectiviteit van het letsel, spierisolatie en inclusieIon en cryosecties), voert een H & E-kleuring uit. Voor elke experimentele tijdspunt, fixeer een dia met 4% PFA gedurende 10 minuten. Na fixatie, was de slides goed in verschillende veranderingen van 1x PBS.
OPMERKING: Voorzichtigheid. PFA is kankerverwekkend en moet zorgvuldig worden behandeld. - Neem één glijbaan voor elk experimenteel punt en zet ze in een vlekpot.
- Vul de pot met 9 g / L hematoxyline tot de secties bedekt zijn en incubeer gedurende 8 minuten.
- Recycleer de hematoxyline.
- Laat de pot gedurende 10 minuten onder stromend water achterblijven om de overmaat hematoxyline te verwijderen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het water niet rechtstreeks op de afdelingen stroomt. - Wassen met gesteriliseerd water.
- Incubeer de secties met eosine 0,5% (w / v) in verzuurde 90% ethanol gedurende 1 minuut.
- Recycleer het eosin.
- Was gedurende 3 minuten / was tweemaal met steriel water.
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit bij een chemische afzuigkap. - Was de afdelingen met 70% ethanol.
- WassenDe secties met 90% ethanol.
- Was de secties met 100% ethanol.
- Incubeer de secties met 0,879 g / ml o-Xyleen.
OPMERKING: Voorzichtigheid. O-Xyleen is ontvlambaar en matig giftig. Manipuleer het onder chemische kap, beschermende uitrusting, met inbegrip van handschoenen, een laboratoriumjas en een masker. - Recycleer de o-Xyleen.
- Zet de dia's over een stuk papier om te drogen.
- Sluit de glijbanen met behulp van een snelharden, xyleen-opbouwmedium.
- Controleer de kwaliteit van de secties onder een optische microscoop bij 10X vergroting (zie figuur 3 )
OPMERKING: het protocol kan hier worden onderbroken.
- Om de kwaliteit van de spier te evalueren ( dwz de effectiviteit van het letsel, spierisolatie en inclusieIon en cryosecties), voert een H & E-kleuring uit. Voor elke experimentele tijdspunt, fixeer een dia met 4% PFA gedurende 10 minuten. Na fixatie, was de slides goed in verschillende veranderingen van 1x PBS.
3. Immunostaining voor LC3 en MyoD in gewonde spierweefselafdelingen
- Bevestiging van spierweefsel secties.
- Bereid een incubatiekamer door een stuk papier te bevochtigen en op de bodem van een afsluitbare plastic doos te plaatsen om een hoge lek te behoudenVeel vochtigheid in de kamer. Vaste weefselsecties met 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS gedurende 10 minuten.
OPMERKING: een nat papier wordt gebruikt om het monster te drogen. Bereid vers PFA of gebruik PFA opgeslagen bij -20 ° C. Voorzichtigheid. PFA is giftig; Het poeder moet met zorg behandeld worden bij het maken van de voorraadoplossing. Deze bewerking moet uitgevoerd worden op een chemische afzuigkap, met beschermende uitrusting, inclusief handschoenen, een laboratoriumjas en een masker. Ook, wanneer in oplossing, moet de PFA zorgvuldig worden gemanipuleerd. - Verwijder de PFA en wrijf de secties met 1x PBS gedurende 5-7 minuten; Herhaal deze stap 3 keer.
- Bereid een incubatiekamer door een stuk papier te bevochtigen en op de bodem van een afsluitbare plastic doos te plaatsen om een hoge lek te behoudenVeel vochtigheid in de kamer. Vaste weefselsecties met 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS gedurende 10 minuten.
- Permeabilisatie van spierweefselafdelingen.
- Teken een hydrofobe barrière rond de weefselsecties met behulp van een pappen.
OPMERKING: Deze stap definieert het oppervlak rond de weefselsecties en minimaliseert het volume van de antilichamen die beschreven worden in stappen 3.4, 3.6, 3.7 en 3.9. - Dek de secties met 200 μL koud (-20 ° C)Methanol en zet de incubatiekamer horizontaal in een vriezer bij -20 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder de incubatie kamer uit de diepvriezer, aspirateer de methanol en wrijf de secties met 1X PBS gedurende 5-7 minuten bij RT; Herhaal deze stap 3x.
- Teken een hydrofobe barrière rond de weefselsecties met behulp van een pappen.
- Het blokkeren
- Bereid een verse blokoplossing van 4% Bovine Serum Albumin (BSA) in PBS 1x op.
OPMERKING: BSA-oplossing kan 1 week bij 4 ° C opgeslagen worden. - Incubeer de secties met blokoplossing gedurende tenminste 60 minuten bij RT.
- Verwijder de blokkerende oplossing.
- Bereid 100 μL anti-Fab mix door 20 μg / ml anti-Fab in 1x PBS te verdunnen. Incubeer de secties met een ongeconjugeerd affiniteit gezuiverd F (ab) fragment van anti-muis IgG gedurende 1 uur bij RT.
- Bereid een verse blokoplossing van 4% Bovine Serum Albumin (BSA) in PBS 1x op.
- Incubatie van primaire antilichamen.
- Bereid 100 μL primaire antilichamenmix voor elke dia door LC3- en MyoD-antilichamen op te lossen in 4% BSA in 1x PBS. Gebruik 5 μg /Ml anti-LC3 (konijn polyklonaal antilichaam) en 10 mg / L anti-MyoD (monoklonaal monoklonaal antilichaam). Incubeer het primaire antilichamenmengsel overnacht bij 4 ° C.
- Wasbeurten.
- Verwijder de primaire antilichamenmix.
- Was de secties met 1% BSA in 1X PBS gedurende 10 minuten; Herhaal deze stap 3x.
- Secundaire antilichaam incubatie.
- Bereid 100 μL secundaire antilichamenmix voor elke dia. Geiten anti-konijn 488 (5 μg / ml) en geiten anti-muis 594 (5 μg / ml) in 4% BSA in 1x PBS oplossen.
OPMERKING: Vermijd overmatige blootstelling aan licht om fluorochroom bleken te voorkomen. Voer de volgende stappen uit in het donker. - Incubeer de secties met de secundaire antilichamenmix gedurende 45 min bij RT.
- Verwijder de secundaire antilichamenmix en wrijf de secties met 1x PBS gedurende 5-7 minuten; Herhaal deze stap 3x.
- Bereid 100 μL secundaire antilichamenmix voor elke dia. Geiten anti-konijn 488 (5 μg / ml) en geiten anti-muis 594 (5 μg / ml) in 4% BSA in 1x PBS oplossen.
- Incubatie van primaire antilichamen.
- Verdun laminiN-2 (a-2-keten) monoklonaal antilichaam (0,33 μg / ml) in 4% BSA in 1x PBS met 100 μl mengsel voor elke dia. Incubeer de secties in de primaire antilichamenmix gedurende 1-2 uur bij RT.
- Wasbeurten.
- Verwijder de primaire antilichamenmix.
- Was de secties met 1% BSA in 1X PBS gedurende 10 minuten; Herhaal deze stap 3x.
- Secundaire antilichaam incubatie.
- Bereid 100 μL secundaire antilichamenmix voor elke dia door verdunning van geiten-anti-rat 647 (5 μg / ml) in 4% BSA in 1X PBS. Incubeer de secties in de secundaire antilichamenmix gedurende 45 min bij RT.
- Verwijder de secundaire antilichamenmix en wrijf de secties met 1x PBS gedurende 5-7 minuten; Herhaal deze stap 3x.
- 4 ', 6-Diamidino-2-fenylindool (DAPI) incubatie.
- Voeg 200 μL 300 nM DAPI oplossing in 1x PBS toe aan elke dia. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Bewaar de DAPI-oplossing bij 4 ° C in dedonker.
- Was de secties met 1x PBS gedurende 5-7 minuten; Herhaal deze stap 3x.
- Montage van gekleurde spiergedeelten.
- Verwijder de overtollige wasoplossing uit de secties.
- Plaats 10 μL glycerol in 1x PBS (3: 1) op de gekleurde secties in het midden van de glijbaan en voeg een deklaag toe, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
4. Confocal Microscopy Acquisition
- Verkrijg de beelden met behulp van een vier-laser confocal microscoop geïntegreerd met een beeld capture systeem en analytische software.
OPMERKING: MyoD is geconjugeerd met een 594 kleurstof die een heldere rood-fluorescerende kleurstof is, met excitatie ideaal voor de 594 nm laser (excitatie: 590 nm, emissie: 617 nm). LC3 is geconjugeerd met een 488 kleurstof die een heldere groene fluorescerende kleurstof is, met excitatie ideaal voor de 488 nm laserlijn (excitatie: 495 nm, emissie: 519 nm). Laminine is geconjugeerd met een 647 kleurstof die isEen heldere roodrood fluorescerende kleurstof, met excitatie ideaal voor de 647 nm laserlijn (excitatie: 650 nm, emissie: 668 nm). - Plaats de glijbanen in de microscooplade en gebruik 63X vergroting om kernsignalen te detecteren. Focus op de regeneratieve gebieden door de velden van actieve regeneratie centraal te stellen, gebaseerd op spiermorfologie (zie figuur 4 ).
OPMERKING: Terwijl de spierregeneratie in een onverstoorde spier nauwelijks constant is ( Figuur 4A ), kan de spierregeneratie door letsel worden herkend door kleiner myofibers, die de nieuw gevormde vezels zijn na regeneratie. Bovendien wordt de spier in actieve regeneratie gekenmerkt door een uitgebreid infiltraat dat is gemaakt van macrofagen, fibro-adipogene precursoren en cellen die zich bevinden op de beschadigde spieren om spierregeneratie te organiseren ( Figuur 4B ). - Evalueer de immunofluorescerende kleuring in het regenEratieve gebieden door te concentreren op MuSC's die zich bevinden onder de basale lamina van de myofibers.
- Focus op MuSC's die positief zijn voor MyoD-kleuring en gepositioneerd in myofibers die worden gemarkeerd door laminine-kleuring (zie Figuur 4B , witte pijlen).
- Gebruik ten minste 3 muizen / experimentele groepen en gebruik de microscoop om 63X vergrotingsafbeeldingen van ten minste 7 velden te verkrijgen voor elke experimentele groep.
- Zodra de regeneratieve gebieden zijn geïdentificeerd, focus met behulp van de DAPI-kleuring en pas de andere enkele kanalen aan.
- Gebruik de volgende microscoopinstellingen: Kanaal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Kanaal A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Kanaal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719.
- Nadat u de focus van de enkele kanalen heeft aangepast, ga dan verder om de beelden te verkrijgen op een afmeting van 1.024 x 1.024 en een pixel van 12,61 μs.
- Tel het percentage van MyoD-positieve cellen (controle voor tHij corrigeert de locatie onder de lamina) die LC3-negatief zijn en het percentage MyoD-positieve cellen die een LC3-signaal weergeven.
OPMERKING: Het percentage van MyoD-positieve cellen die LC3-kleuring vertonen is de uitlezing van dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft een efficiënte in situ methode om autofagie in MuSCs te detecteren tijdens spierregeneratie.
CTX In Vivo Behandelingen:
Gebruik CTX om spierbeschadiging in de TA-spieren te veroorzaken en gebruik de ongeblokkeerde spieren als controles. Aangezien autofagie zeer dynamisch is, blokkeren de autofagische flux door IP injecties van CLQ uit te voeren ( Figuur 1 ). CLQ behandeling is essentieel om te beoordelen of de autofagische flux actief is of bij basale niveaus wordt gehouden.
Tibialis Anterior Isolatie:
Isoleer de TA spier, zoals beschreven in Figuur 2 , en plaats het in een vormkamer in NS-oriëntatie om vervolgens transversale spierweefselafdelingen te verkrijgen. Deze stapIs cruciaal om secties te bereiken en MuSCs te identificeren op de juiste locatie onder de myofiber basale lamina.
Hystologische onderzoek van CTX-geïnduceerde spierbeschadiging
Controleer of spierletsel zich voordoet door het uitvoeren van histologische kleuring. Voer H & E-kleuring uit en controleer onder 10X vergroting: terwijl de ongeblokkeerde spieren over het algemeen onafwijkende myofibergroottes tonen, omvatten de kenmerkende eigenschappen van gewonde spieren de verstoring van myofibers die verschillend zijn in grootte en overvloedig ontstekingsinfectie. Een andere parameter om te bevestigen dat het regeneratieve proces plaatsvindt is de centro-nucleatie van de myofibers, die afwezig is in niet-gespierde spieren en een teken is van de vorming van nieuwe vezels bij muizen die actieve regeneratie ondergaan ( Figuur 3 ).
Autofagy is gekoppeld aan MyoD-poZieke cellen tijdens spierregeneratie:
Voer immunofluorescente kleuring uit om MuSCs te detecteren, geïdentificeerd als MyoD-positief, dat een LC3-signaal weergeeft. Lamininevervulling is handig om MuSCs in de juiste positie te lokaliseren in de niche onder de basale lamina ( Figuur 4 ). Autofagische basale niveaus onderscheiden onopgebroken skeletspieren en vergroten bij toeval bij toeval met spierregeneratie 30 . Bijgevolg tonen niet-geïnjureerde muizen geen MuSC-activering, gedetecteerd door de afwezigheid van MyoD-positieve cellen en geen LC3-signaal. Omgekeerd, bij spierbeschadiging, worden MyoD-positieve MuSCs positief voor LC3, waarbij wordt aangetoond dat het autofagische proces geactiveerd wordt tijdens spierregeneratie in geactiveerde satellietcellen.
Tijdens de eerste fase van de regeneratieve reactie lokaliseren verschillende cellulaire typen naar de plaats van tHij letsel, inclusief ontstekingscellen en fibro-adipogene precursoren, waardoor het gewond gebied dicht overvol is. Het is van cruciaal belang om te onderscheiden tussen alle verschillende cellulaire typen, waarbij de nadruk ligt op de MuSC-locatie onder de myofiber-lamina en op MyoD-positiviteit vertrouwt.
Bij basale condities wordt LC3 alomtegenwoordig uitgedrukt en wordt nauwelijks gedetecteerd door immunofluorescentie. Als gevolg van verhoogde autofagie verandert dit kleurpatroon vooral in het cytoplasma. Bij het evalueren van MyoD / LC3-kleuring beschouwt u dat MuSC's kleine cellen zijn en dat het cytoplasmatische gebied beperkt is; Dit is waarom LC3 perinuclear kan kijken.
Figuur 1: CTX In Vivo Behandelingen. ( A ) Om spierbeschadiging te veroorzaken, injecteer 10 μL 10 μM CTX direcTik in de linker TA spieren van 2 maanden oude WT muizen. Gebruik de contralaterale ledemaat als een controle. ( B ) Schematische weergave van cardiotoxine geïnduceerde spierbesering. 24 uur na het letsel, behandel de muizen met intraperitoneale injecties van 50 mg / kg CLQ elke 24 uur gedurende 4 dagen en offer de dieren vervolgens. Gebruik onbehandelde onbeschadigde en gewonde muizen als controles. Dit protocol zorgt voor de studie van de betrokkenheid van het autofagische proces tijdens spierregeneratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: TA Isolatie. ( A ) Representatieve afbeelding van de TA zoals het uitkijkt voor isolatie. ( B ) Na het snijden van de distale pees, houd de TA spier door de pees vast en zorgvuldigTrek de spier naar het proximale uiteinde (bij de knie). ( C ) Disciplineer de EDL van de TA spier, die groter en oppervlakkiger is dan de EDL. Scheid de TA uit de EDL spier door de twee distale pezen in tegengestelde richtingen te trekken. ( D ) Zodra de TA geïsoleerd is, plaats deze in de vormkamer, zoals beschreven, in NS-oriëntatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: CTX veroorzaakt spierschade. Representatieve afbeeldingen van H & E-kleuring op TA-transversale weefselsecties uit controle, onbeschadigde ( A ) en 5 dpi ( B ) WT muizen. H & E-kleuring onthult normale vezelmorfologie in controle muizen ( A ) en massivE spierbeschadiging en infiltreer in gewonde spieren ( B ), waarbij een verminderde morfologie bij CTX-injectie wordt aangetoond. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Autofagie is gekoppeld aan MyoD-positieve cellen tijdens spierregeneratie. Representatieve afbeeldingen van TA secties van controle ( A ) en gewonde ( B ) WT muizen die immunogevend zijn met LC3 (groen) en MyoD (rood). Laminine (cyaan) vlekken markeert vezelsvezels, en kernen zijn tegensterkte met DAPI (wit). De rechterpanelen tonen representatieve afbeeldingen van het merge-signaal. Witte pijlen wijzen op satellietcellen die onder de basale lamina van de vezel zijn gemarkeerd door lamininkleuring. De followiNg protocol maakt het mogelijk om autofagie te meten door middel van LC3-kleuring in spierstamcellen die myogene afstamming ondergaan, gemarkeerd door MyoD. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe autofagie in stamcellen van de skeletspier wordt gecontroleerd tijdens compenserende spierregeneratie. Verscheidene antilichamen voor het co-stainen van LC3 en MyoD werden geprobeerd, en degenen die in muisweefselafdelingen werken en succesvolle resultaten opleveren, worden hier vermeld (zie Materialtabel ). De permeabilisatie met methanol (zie stap 3.2.2) wordt sterk aanbevolen voor succesvolle kleuring.
De beperking van dit protocol is gekoppeld aan de intrinsieke variabiliteit van de muizen, die het gebruik van ten minste 3 muizen / experimentele groep dwingt.Deze methodologie weerspiegelt een stap vooruit in de studie van autofagie tijdens de regeneratie van de skeletspier, aangezien de meerderheid van de resultaten oplevert Tot nu toe werden in geïsoleerde cellen gemaakt. De in situ analyse is toegestaan voor de studie van autofagie in de natuurlijke omgeving, zonder dat er een celisolatie nodig is die metabolische processen kan beïnvloeden, zoals autofagie.
"> Gezien de zeer dynamische aard van het autofagische proces, zijn de CLQ-behandelingen een cruciale stap om het autofagische proces in vivo te volgen. CLQ blokkeert de latere stadia van het autofagische proces, wat leidt tot accumulatie van LC3 wanneer autofagie wordt onderhouden. Maakt LC3 detecteerbaar door in situ onderzoek. Bij ongeperforeerde skeletspieren wordt het basale autofagische proces niet verder verhoogd door CLQ-behandeling, zoals blijkt uit de afwezigheid van detecteerbare LC3-accumulatie. Bij regeneratie van spieren verzamelt LC3 zich bij CLQ-behandeling, waarbij autofagische activering wordt aangetoond. Een kritische stap is om de muizen tegelijkertijd op te offeren ( dwz om 10 uur). Een andere kritische stap in het protocol is de identificatie van MuSC, die niet met een ander cellulair type moet worden vervangen die beschadigde spieren bevolkt tijdens de Regeneratieve respons. De identificatie van MuSC's onder de basale lamina die MyoD positiviteit vertonen is de kOog om zich te concentreren op satellietcellen.Samenvattend presenteren wij een geschikte in situ methode om de betrokkenheid van het autofagische proces in MuSCs te detecteren. Deze techniek kan dienen als basis voor testen van farmacologische benaderingen bij autofagmodulatie, die gebruikt kunnen worden om de regeneratie van de skeletspier te verbeteren bij normale en pathologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT naar LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
References
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
