ويتجلى المناعة المستندة إلى شعري استخدام منصة تجارية لقياس البروتينات المستهدفة من مجموع البروتين الأعمال التحضيرية. وباﻹضافة إلى ذلك، المعلمات المقايسة وقت التعرض وتركيز البروتين، وتمييع جسم هي الأمثل لنظام نموذجي ثقافة خلية.
التكنولوجيات الجديدة التي تستخدم المستندة إلى الشعرية تحديدكم وعد تقييم البروتين أسرع وأكثر الكمية مقارنة بتحديدكم التقليدية. مشابهة لفحوصات البروتين على جسم الأخرى، التحسين من المعلمات على أساس شعري المناعة، مثل تركيز البروتين، وتمييع جسم، ووقت التعرض غير شرطا أساسيا هاما لتوليد ذات مغزى ويمكن الاعتماد عليها البيانات. القياسات يجب أن تقع ضمن النطاق الخطي للمقايسة طرديا مع التغيرات في تركيز ليستي فيها التغييرات في إشارة. عملية اختيار التركيزات ليساتي المناسب وتخفيف جسم وأوقات التعرض في خط الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية، بياس-2B، يتجلى هنا. ويرد التحليل الخطي أكثر من مجموعة من تركيزات البروتين استخراج خلية كاملة مع الأجسام المضادة p53 و α-tubulin. يعتبر مثالاً لإشارة التوقف في تركيزات أعلى مع مرات التعرض الطويل، ويظهر منحنى تمييع جسم α-tubulin مما يدل على تشبع. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن النتائج التجريبية مثال لتعامل ميتوتريكسات الخلايا باستخدام معلمات الأمثل.
قياس التعبير البروتين في الخلية ليساتيس استخدام أنظمة الفصل الحجم أو تهمة تحديدكم الغرواني الكهربي الشعرية ويوفر العديد من المزايا تحديدكم التقليدية. على سبيل المثال، عند مقارنته للطخة غربية، الإجراء الآلي القائم على شعري يلغي الحاجة للمواد الهلامية، أجهزة نقل، ويغسل دليل. وباﻹضافة إلى ذلك، مطلقة كمية البروتين المطلوب حوالي 10 مرات أقل، مما يجعل الأنظمة المستندة إلى الشعرية مثالية للاستخدام مع أنواع نادرة من الخلية أو عينة محدودة1،2. النتائج يتم الحصول عليها في أقل من 3 ح باستخدام النظم الآلية وأثبتت سابقا أن تكون أكثر من الكمية واستنساخه من الغربية التقليدية لطخة الإجراءات3،،من45. عملية لفحوصات على أساس الحجم يتكون من تحميل العينات المحتوية على دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، ديثيوثريتول (DTT)، والمسمى فلوريسسينتلي علامات الوزن الجزيئي في الأعمدة الشعرية التي تتضمن مصفوفات التراص والانفصال. الجهد المطبقة على الشعيرات الدموية يفصل البروتينات في عينات وفقا لحجم، والأشعة فوق البنفسجية يشل البروتينات المنفصلين عن ذويهم على الحائط الشعرية. الشعرية ومن ثم سبر المناعية مع محددة الهدف الأساسي جسم والفجل البيروكسيديز (HRP)-الجسم المضاد الثانوي مترافق. لومينول وبيروكسيد تحفيز الجيل الخفيفة تشيميلومينيسسينت الذي يقاس بكاميرا جهاز إلى جانب (CCD) تهمة وتحليلها إلى قوانتيتاتي البروتين.
على الرغم من السهولة النسبية وسرعة من منصة المناعة الغرواني الكهربي الآلي القائم على الشعرية، المهم الأمثل لظروف المقايسة مثل تركيز البروتين، وتمييع جسم، ووقت التعرض للحصول على الدقة واستنساخه النتائج. وبصفة عامة، ينبغي إجراء الإجراءات التالية لتحسين فحص لهذه الأنظمة:
1) على شاشة ينبغي أن يجري تقييم واختيار الأجسام المضادة للإشارات وخصوصية للبروتين الهدف. إذا كانت متوفرة، يمكن استخدام البروتين المنقي أو حانمه المستهدفة لتقييم النوعية؛ بيد أنها لا تزال هامة لتقييم الإشارات غير محددة محتملة في مجموع البروتين من مصادر من النظام النموذجي.
2) القادم، النطاق الديناميكي للمقايسة يحتاج إلى تحديد. في وضع مثالي، إشارة مضاعفة (تقاس باستخدام منطقة الذروة) يلاحظ كما تضاعف تركيز العينة؛ في الممارسة العملية، تغيير النسبي في إشارة إلى الإدخال بطريقة يمكن التنبؤ بها (مثلاً، خطي صالح) غير كافية لتقدير البروتين. بالإضافة إلى ذلك، سوف تحدد هذا التحسين تركيز البروتين مع إشارة عالية ولكن لا يزال ضمن النطاق الخطي لنموذج تجريبي.
3) تحديد تركيز الضد الأمثل استخدام تركيز بروتين ثابت اختياره في الخطوة 2 من التحسين. كما يزيد من تركيز الأجسام المضادة، الإشارة يزيد حتى من هضاب في التشبع. بتركيز الضد قرب مستوى تشبع هذا مطلوب من أجل القياس الدقيق لتركيز البروتين.
ويتجلى العملية المستخدمة لتحسين تركيزات البروتين وتخفيف جسم وأوقات التعرض مقايسة حجم الآلي القائم على شعري6 استخدام مقتطفات الخلية كلها معزولة عن بياس-2B، الإنسان SV-40 تتحول الشعب الهوائية خط الخلايا الظهارية. عزل البروتينات من مقتطفات الخلية أو النسيج يمكن أن يؤديها باستخدام عدد من البروتوكولات نشرت7،،من89 ولن تكون مشمولة هنا. نتائج تجربة المحاكمة باستخدام الشروط الأمثل أيضا الإبلاغ عن إجمالي وفوسفوريلاتيد p53 (سيرين 15، سيرين 20) في الثقافات المعرضين ميتوتريكسات (شيوعاً العلاج الكيميائي عامل أن يستحث الخلايا المبرمج10) في 1.2، 1.8، و 2.4 ميكروغرام/ملليلتر وسائل الإعلام 4 ح قبل موسم الحصاد. يتم تطبيع مجالات ذروة p53 إلى ɑ-tubulin، التي تستخدم كعنصر تحكم تحميل.
لعقود من الزمان، كان هناك الاهتمام المستمر في تطوير أساليب الشعرية المناعة الغرواني الكهربي على أساس بسبب المنخفض عينة وكاشف الإنفاق، انخفض تجهيز الوقت عند مقارنتها بالطرق التقليدية، وارتفاع التوافق إلى أتمتة الإجراءات4،15. وهناك عدد من البروتوكولات المختلفة لفصل البروتينات التي استخدمت الشعيرات الدموية، بما في ذلك النخل البوليمر الغرواني الكهربي، اليكتروكينيتيك، وأساليب إيسويليكتريك، الذي عزل البروتينات بخصائص مختلفة (على التوالي، رسوم الكهرباء، توازن القسم، النخل خصائص المصفوفة الفاصل، ودرجة الحموضة)16. هنا، نحن تصف طريقة التفريد الشعرية المستندة إلى جسم (أو المناعة)، استخدام بوليمر النخل الانفصال، والتي قد تم الآلي و المعتمدة تجارياً3. وتشمل مزايا هذا النظام سهولة الاستخدام والعملية، والكواشف موحدة والمتاحة تجارياً، وقياسات موثوقة، والحساسة التي تتطلب أقل الكاشف وفحوصات البروتين التقليدية مثل لطخة غربية، بالمقارنة مع عينات المناعة المرتبطة بالانزيم، وسائر أشكال3،،من45. وقد لوحظ في التقييمات السابقة لهذه التكنولوجيا أن كانت محدودة نطاق حجم البروتين التي يمكن تقييم الفصل متاح مصفوفة4، العروض الأخيرة ولكن اتسع النطاق قابلة للقياس من 2 إلى 440 كاتشين17 . وبالإضافة إلى ذلك، بعض المخازن المؤقتة ليساتي معروفة لتكون متوافقة مع المقايسة18، ولذلك تحديد الكواشف التجريبية المستخدمة يجب النظر مسبقاً.
وميزة رئيسية لإجراء الآلي مع المكونات المتوفرة تجارياً اتساق النتائج من خلال أساليب موحدة والكاشفات. وهذا يقلل من احتمالات الفشل المقايسة بأتمتة الخطوات الحاسمة ضمن الإجراء. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن ممارسات معينة يجب الالتزام بها خلال البروتوكول للتقليل من القضايا مع المناعة الغرواني الكهربي على أساس الشعرية. أولاً، من المهم أن الخليط لومينول-S/بيروكسيد مستعدة طازجة وعلى الفور قبل تحميل لوحة. سيؤدي إلى توقيت متسقة التﻷلؤ يتفق بعد إضافة عامل مؤكسد، مما سيؤدي إلى قياسات متسقة مقايسة جسم معين بعد الفحص. وعلاوة على ذلك، فمن المهم أن تستخدم الكواشف غير منتهية الصلاحية، التي تؤثر أساسا على فاعلية عامل مؤكسد. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم تماما اتباع النظام تحميل عينات، والأجسام المضادة، والكواشف الأخرى (انظر الشكل 1). أي كاشف بيبيتيد الخروج من المكان سيؤدي إلى عدم المقايسة وتشغيل ضائع.
وإلى جانب هذه الخطوات الحاسمة، القضايا الرئيسية التي شهدت مع التقنية يمكن عموما التغلب عليها من خلال التحسين. في الواقع، هذه الشروط المحددة لكل تركيبة نموذج النظام/جسم ولذلك ينبغي أن تحدد تجريبيا لكل فحص جديد. في هذه المقالة، نحن نركز على ثلاثة إجراءات مشتركة للتحسين: زمن التعرض للضوء ومعايرة ليساتي وتمييع جسم الأولية. القدرة على توليد نتائج قابلة للقياس يعتمد على تحليل لوقت التعرض عندما الركيزة لومينول هو عدم سرعة النضوب، كنتائج استنفاد الركيزة في فقدان الإشارات. معايرة ليساتي يحدد النطاق الديناميكي الخطي لكل فحص، التي يمكن أن تختلف مع نظم نموذجية مختلفة، فضلا عن أجسام مختلفة، حتى بالنسبة لنفس الهدف البروتين. ضمان تخفيف جسم المختار في أو بالقرب من تشبع تركيزات التغييرات في إشارة لن تتأثر بنقص في جسم مجاناً، ولكن فقط باختلاف كمية البروتين المتاحة الهدف حانمه. قد تتضمن الاعتبارات الأخرى أثناء عملية التحسين جسم وقت الحضانة والتراص/عينة وقت التحميل. في معظم الحالات عرض الإعدادات الافتراضية للأداة توازن أفضل للقرار وحساسية. ومع ذلك، في بعض الحالات، دقة ضعيفة أو حساسية يمكن تحسين عن طريق ضبط هذه المعلمات.
توفير أساليب الشعرية المناعة الغرواني الكهربي على أساس قياسات البروتين سريعة وفعالة، واستنساخه. بينما أساسا استخدمت هذه الأساليب في إعدادات البحث والتطوير، باتساق هذه التكنولوجيات الفائدة المحتملة في التطبيقات السريرية والتنظيمية. على سبيل المثال، تحديد الفئات السكانية الفرعية عرضه للسموم البيئية أو المرضى مع تقدم المرض يمكن أن تستند إلى المؤشرات الحيوية البروتين يقاس في مصفوفات موجوداً، مثل الدم والبول واللعاب. ككاشف وانخفاض تكاليف التشغيل وعدد العينات والأهداف التي يمكن أن تكون الزيادات المقررة في نفس الوقت، سوف نرى يرجح أن المناعة الشعرية الغرواني الكهربي على أساس الأساليب المستخدمة لهذه الأنواع من التطبيقات.
The authors have nothing to disclose.
المؤلف يود أن يشكر Tarpley كيث لنا وكالة حماية البيئة مكتب فريق البحوث ووسائل الإعلام والتنمية-البحوث research Triangle Park (ORD-RTP) الرسم للتنمية، وأشرطة، وتحرير الفيديو التعليمية. كما نود أن نشكر ديبورا بريتشيت من بروتينسيمبلي بالنسبة للمحادثات مفيدة فيما يتعلق بالاستغلال الأمثل للبيانات المتوفرة لدينا. وأيد جوينن JM المعهد أوك ريدج للعلم والتعليم البحوث/مشاركة البرنامج في “وكالة حماية البيئة الأمريكية”.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |