È dimostrato un immunodosaggio basato su capillare utilizzando una piattaforma commerciale per misurare proteine bersaglio dalle preparazioni di proteine totali. Inoltre, i parametri di analisi del tempo di esposizione, concentrazione nella proteina e diluizione dell’anticorpo sono ottimizzati per un sistema di modello di coltura cellulare.
Nuove tecnologie che utilizzano test immunologici basati su capillare promettono valutazione più veloce e più quantitativa della proteina rispetto ai tradizionali test immunologici. Tuttavia, simile ad altri dosaggi di proteina anticorpo-basato, ottimizzazione dei parametri di base capillare immunoassay, quali concentrazione proteica, diluizione dell’anticorpo e tempo di esposizione è un presupposto importante per la generazione di significativo e affidabile dati. Misure devono rientrare all’interno della gamma lineare del dosaggio dove sono direttamente proporzionali ai cambiamenti nella concentrazione di lisato cambiamenti nel segnale. Il processo di scelta di concentrazioni adeguate di lisato, diluizioni di anticorpo e tempi di esposizione in linea di cellule epiteliali bronchiali umane, BEAS-2B, è dimostrato qui. Linearità di dosaggio è indicato sopra una gamma di concentrazioni di proteina intera cellula Estratto con gli anticorpi p53 e α-tubulina. Un esempio del burnout segnale è visibile alle più alte concentrazioni con tempi di esposizione lunghi, e una curva di diluizione dell’anticorpo di α-tubulina è mostrata dimostrando la saturazione. Inoltre, risultati sperimentali di esempio sono riportati per cellule trattate con doxorubicina utilizzando parametri ottimizzati.
Test immunologici mediante elettroforesi capillari misurano l’espressione della proteina in lisati cellulari utilizzando sistemi di separazione di dimensione o carica e offrono numerosi vantaggi rispetto i tradizionali test immunologici. Ad esempio, rispetto alla macchia occidentale, la procedura automatizzata basata su capillare elimina la necessità di gel, dispositivi di trasferimento, e manuale di lava. Inoltre, la quantità assoluta di proteine necessaria è circa 10 volte meno, rendendo i sistemi basati su capillare ideale per l’utilizzo con i tipi di cellule rare o campione limitato1,2. Risultati sono ottenuti in meno di 3 h utilizzando sistemi automatizzati e precedentemente sono stati dimostrati più quantitativa e riproducibile di convenzionale western blot procedure3,4,5. Il processo per saggi basati su dimensioni consiste di caricamento campioni contenenti sodio dodecil solfato (SDS), ditiotreitolo (DTT) e fluorescente etichettati marcatori di peso molecolare in colonne capillari contenenti matrici di accatastamento e separazione. Tensione applicata ai capillari separa le proteine in campioni in base alla dimensione, e luce UV immobilizza le proteine separate per la parete capillare. Il capillare è quindi immuno-sondato con specifica della destinazione primario dell’anticorpo e rafano perossidasi (HRP)-anticorpo secondario coniugato. Luminol e perossido di catalizzare chemiluminescente generazione di luce che è misurata da una telecamera di charge coupled device (CCD) ed analizzati per quantificare le proteine.
Nonostante la relativa facilità e la velocità di una piattaforma di dosagggio immunologico automatizzato basato su capillare elettroforetica, ottimizzazione di metodiche quali concentrazione proteica, diluizione dell’anticorpo e tempo di esposizione è importante per ottenere accurate, riproducibili risultati. In generale, è necessario eseguire le procedure seguenti per ottimizzare un dosaggio per questi sistemi:
1) uno schermo deve essere eseguito per valutare e scegliere gli anticorpi per segnale e specificità per il proteina bersaglio. Se disponibile, la proteina purificata o epitopo target può essere utilizzato per valutare la specificità; Tuttavia, è ancora importante valutare potenziali segnale aspecifico in proteine totali proveniente dal sistema di modello.
2) successivamente, la gamma dinamica del dosaggio deve essere determinato. In una situazione ideale, segnale raddoppio (misurato utilizzando area di picco) è osservato come la concentrazione del campione è raddoppiata; Tuttavia, in pratica, un cambiamento proporzionale a segnale di input in modo prevedibile (ad es., lineare adatta) è sufficiente per la quantificazione della proteina. Inoltre, questa ottimizzazione definirà la concentrazione di proteine con segnale alto ma ancora all’interno della gamma lineare per il modello sperimentale.
3) determinare la concentrazione di anticorpi ottimale utilizzando la concentrazione nella proteina fisso selezionata in fase di ottimizzazione 2. Come la concentrazione di anticorpi, il segnale aumenta fino a quando esso altipiani a saturazione. Una concentrazione di anticorpi vicino a questo livello di saturazione è necessaria per la misura accurata di concentrazione nella proteina.
Il processo utilizzato per ottimizzare le concentrazioni della proteina, diluizioni di anticorpo e tempi di esposizione per un di dosaggio automatizzato basato su capillare dimensione6 è dimostrato usando gli estratti di cellule intere isolati da BEAS-2B, un essere umano SV-40 trasformato bronchiale linea cellulare epiteliale. Isolamento della proteina dagli estratti delle cellule o del tessuto può essere eseguita utilizzando un numero di protocolli pubblicati7,8,9 e non sarà coperti qui. Risultati di un esperimento di prova utilizzando le condizioni ottimizzate sono inoltre segnalati per totale e fosforilate (serina 15, Serina 20) p53 nelle culture esposte a doxorubicina (un agente chemioterapeutico comune che induce l’apoptosi di cellule10) a 1.2, 1.8, e 2,4 media µ g/mL per 4 h prima del raccolto. Le aree di picco di p53 sono normalizzate a ɑ-tubulina, che è usato come un controllo di carico.
Per decenni, c’è stato interesse costante nello sviluppo di metodi di immunoassay basati su elettroforetico capillare a causa basso dispendio campioni e reagenti, è diminuito di elaborazione tempo rispetto ai metodi tradizionali e ad alta compatibilità per automatizzare la procedura4,15. Ci sono un certo numero di diversi protocolli per la separazione delle proteine che hanno utilizzato i capillari, tra cui polimero elettroforetico, elettrocinetico, setacciatura e metodi isoelettrici, che isolare proteine dalle proprietà differenti (rispettivamente, carica elettrostatica, equilibrio di partizione, setacciatura proprietà della matrice separazione e pH)16. Qui, descriviamo un anticorpo-basato (o immunologico) metodo di elettroforesi capillare, utilizzando un polimero vagliatura separazione, che è stato automatizzato e commercialmente adottati3. Vantaggi di questo sistema sono la facilità di utilizzo e funzionamento, standardizzati e commercialmente disponibili reagenti e misurazioni affidabili, sensibili che richiedono meno reagenti e campioni rispetto all’analisi tradizionale proteina come macchia occidentale, immunoassay enzima-collegato e altri formati3,4,5. È stato osservato nelle precedenti valutazioni di questa tecnologia che l’intervallo di grandezza di proteina che può essere valutata è stato limitato dalla separazione disponibili matrice4, tuttavia recenti offerte hanno ampliato la gamma misurabile da 2 a 440 kDa17 . Inoltre, alcuni buffer di lisato sono noti per essere incompatibile con il saggio18, quindi selezione dei reagenti sperimentali utilizzato deve essere considerata in anticipo.
Un vantaggio principale di una procedura automatizzata con componenti disponibili in commercio è la coerenza dei risultati attraverso metodi standardizzati e reagenti. Questo riduce al minimo le probabilità di errore di dosaggio automatizzando i passaggi critici all’interno della routine. Tuttavia, è importante notare che certe pratiche devono essere rispettati durante il protocollo per ridurre al minimo i problemi con l’immunodosaggio basato su elettroforetica capillare. In primo luogo, è fondamentale che la miscela di luminol-S/perossido è preparata fresco e immediatamente prima di carico su piastra. Temporizzazione coerente si tradurrà in luminescenza coerenza dopo aver aggiunto l’agente ossidante, che si tradurrà in misure coerenti per un dosaggio anticorpo particolare termine dosaggio. Inoltre, è importante che vengano utilizzati i reagenti non scaduto, che colpisce principalmente la potenza dell’agente ossidante. Inoltre, è importante che l’ordine di caricamento dei campioni, anticorpi e altri reagenti essere rigorosamente rispettata (Vedi Figura 1). Qualsiasi reagente pipettato fuori luogo si tradurrà in errore di dosaggio e una corsa sprecata.
Oltre a questi passaggi critici, principali problemi sperimentati con la tecnica generalmente possono essere superati attraverso l’ottimizzazione. Infatti, queste condizioni sono specifiche per ogni combinazione di sistema/anticorpo modello e pertanto dovrebbero essere determinate empiricamente per ogni nuovo dosaggio. In questo articolo, ci concentriamo su tre comuni procedure di ottimizzazione: tempo di esposizione, la titolazione lisato e la diluizione di anticorpo primario. La capacità di generare risultati misurabili dipende dalle analisi di un tempo di esposizione quando il substrato di luminol non è stanno rapidamente esaurendo, come risultati di svuotamento di substrato in perdita di segnale. Lisato titolazione determina l’intervallo dinamico lineare di ogni dosaggio, che può differire da con sistemi di modello diverso, così come gli anticorpi differenti, anche per lo stessa proteina bersaglio. Diluizioni di anticorpo scelti a o vicino a saturare le concentrazioni garantiscono cambiamenti nel segnale non ne risentiranno di una carenza di anticorpi liberi, ma solo da diverse quantità di proteina disponibile destinazione epitopo. Altre considerazioni durante il processo di ottimizzazione possono includere il tempo di incubazione dell’anticorpo e accatastamento/campione tempo di caricamento. Nella maggior parte dei casi le impostazioni predefinite per lo strumento offrono il miglior equilibrio tra risoluzione e sensibilità. Tuttavia, in alcuni casi, scarsa risoluzione o sensibilità può essere migliorata mediante la regolazione di questi parametri.
Metodi di immunoassay basati su elettroforetico capillare forniscono misurazioni proteina veloce, efficace e riproducibile. Mentre questi metodi sono stati utilizzati principalmente nelle impostazioni di ricerca e sviluppo, la coerenza di queste tecnologie ha potenziale utilità nelle applicazioni cliniche e regolamentazione. Ad esempio, l’identificazione di sottopopolazioni suscettibili di tossici ambientali o pazienti con progressione della malattia può essere basato su proteine biomarcatori misurati in matrici accessibile come sangue, urine e saliva. Come reagente e goccia di costi di operazione e il numero di campioni e gli obiettivi che possono essere valutati contemporaneamente aumenta, probabilmente vedremo metodi di immunoassay di basati su elettroforetico capillare utilizzati per questi tipi di applicazioni.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrei ringraziare Keith Tarpley di l’US EPA Office del team ricerca e sviluppo-Research Triangle Park (RTP-ORD) grafica e Media per lo sviluppo, taping e di editing del video didattico. Vorremmo anche ringraziare Deborah Pritchett da ProteinSimple per le conversazioni utili per quanto riguarda l’ottimizzazione dei nostri dati. JM Guynn è stata sostenuta dall’Istituto Oak Ridge per scienza e formazione ricerca/Participation Program presso la US Environmental Protection Agency.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |