利用商用平台检测总蛋白制剂中靶蛋白的 capillary-based 免疫分析方法。另外, 对细胞培养模型系统进行了暴露时间、蛋白质浓度和抗体稀释度的测定参数的优化。
与传统的免疫相比, 利用 capillary-based 免疫的新技术有望更快、更定量地评估蛋白质。然而, 类似于其他抗体蛋白的检测, 优化 capillary-based 免疫分析参数, 如蛋白质浓度, 抗体稀释, 和曝光时间是一个重要的先决条件, 产生有意义和可靠的数据.测量必须在测定的线性范围内, 信号的变化与裂解液浓度的变化成正比。在人类支气管上皮细胞系中, BEAS-2B 了选择适当的裂解浓度、抗体稀释和暴露时间的过程。通过 p53 和α-蛋白抗体, 在整个细胞提取蛋白浓度范围内显示出线性测定。一个信号耗尽的例子是在最高浓度的长曝光时间, 和α-蛋白抗体稀释曲线显示饱和。此外, 示例实验结果报告了阿霉素治疗细胞使用优化参数。
毛细管电泳免疫测定细胞裂解中的蛋白表达, 采用大小或电荷分离系统, 并优于传统的免疫。例如, 与西方的印迹相比, 自动 capillary-based 程序消除了对凝胶、转移装置和手动洗涤的需要。此外, 所需的蛋白质的绝对数量是大约10倍少, 使 capillary-based 系统的理想使用与稀有细胞类型或有限的样本1,2。结果是获得在3小时使用自动化系统, 并已证明是比传统的西方印迹程序更定量和可复制性3,4,5。基于测定的过程包括载有十二烷基硫酸钠 (SDS)、糖 (荧光) 和标记分子量标记的含有堆积和分离矩阵的毛细管柱的样品。施加在毛细管上的电压根据大小将样品中的蛋白质分离, 紫外光针刺分离的蛋白质到毛细血管壁。然后用靶向特异性抗体和辣根过氧化物酶 (HRP)-共轭二级抗体对毛细血管进行免疫探查。通过电荷耦合器件 (CCD) 相机测量发光鲁米诺和过氧化物, 并对定量蛋白进行了分析。
尽管自动化的 capillary-based 电泳免疫分析平台的相对容易和速度, 优化的化验条件, 如蛋白质浓度, 抗体稀释, 和曝光时间是重要的获得准确, 重现性结果.一般而言, 应执行下列程序以优化这些系统的化验:
1) 对蛋白质靶的信号和特异性抗体进行评价和选择。如果可用, 纯化蛋白或靶表位可用于评估特异性;然而, 对来自模型系统的总蛋白中潜在的非特异性信号进行评估仍然很重要。
2) 下一步, 需要确定测定的动态范围。在一个理想的情况下, 信号加倍 (测量使用峰值面积) 是观察样品浓度加倍;然而, 在实际操作中, 以可预知的方式 (例如, 线性拟合) 对输入信号的比例变化足以使蛋白质定量化。此外, 这种优化将定义高信号的蛋白质浓度, 但仍然在线性范围内的实验模型。
3) 使用优化步骤2中选择的固定蛋白浓度确定最佳抗体浓度。随着抗体浓度的增加, 信号会增加直到饱和。在这种饱和水平附近的抗体浓度是需要精确测量蛋白质浓度。
该过程用于优化蛋白质浓度, 抗体稀释, 和曝光时间的自动 capillary-based 大小检测6显示使用全细胞提取物分离 BEAS-2B, SV-40 转化人支气管上皮细胞系。可以使用多个已发布的协议7,8,9来执行从单元格或组织提取物中分离出的蛋白质, 此处不包括。还报告了使用优化条件的试验结果的总和磷酸化 (丝氨酸 15, 丝氨酸 20) p53 的文化暴露于阿霉素 (一种常见的化疗药物诱导细胞凋亡10) 在 1.2, 1.8, 和2.4 µg/毫升培养基4小时前收获。将 p53 峰值区域归一化为ɑ-蛋白, 用作加载控制。
几十年来, 由于样品和试剂用量低, 与传统方法相比, 处理时间缩短, 且与自动执行过程4,15。有许多不同的协议为分离蛋白质使用了血丝, 包括电泳, 电动, 聚合物筛分和等电方法, 分离蛋白质由不同的物产 (分别,静电电荷, 隔板平衡, 筛分性能的分离矩阵, 和 pH 值)16。在这里, 我们描述一个抗体 (或免疫分析) 毛细管电泳方法, 使用聚合物筛分分离, 已自动化和商业采用的3。该系统的优点包括易于使用和操作, 标准化和商业化的试剂, 和可靠的, 敏感的测量, 需要较少的试剂和样品相比, 传统的蛋白质化验, 如西方印迹,酶联免疫分析和其他格式3,4,5。在以前对这项技术的评估中已经注意到, 可以评估的蛋白质的大小范围被可用的分离矩阵4所限制, 但是最近的产品已将可测量范围从2扩展到 440 kDa17.此外, 一些裂解物的缓冲器已知是不相容的化验18, 因此选择所使用的实验试剂必须事先考虑。
自动化程序的一个主要优点是通过标准化的方法和试剂实现结果的一致性。通过在过程中自动执行关键步骤, 从而最大限度地减少了检测失败的几率。然而, 重要的是要注意, 在议定书中必须坚持某些做法, 以尽量减少问题的毛细管 electrophoretic-based 免疫分析。首先, 至关重要的是, 在板料加载之前, 应立即制备鲁米诺/过氧化物混合物。一致的定时将导致在氧化剂添加后, 一致的发光, 这将导致对特定的抗体化验后的一致性测量。此外, 重要的是使用 non-expired 试剂, 这主要影响氧化剂的效力。此外, 必须严格遵守样品、抗体和其他试剂的装载顺序 (参见图 1)。任何试剂 pipetted 不到位将导致化验失败和浪费运行。
除了这些关键步骤外, 通过优化还可以克服与技术相关的主要问题。事实上, 这些条件是特定的每个模型系统/抗体组合, 因此应根据经验确定每一个新的化验。在本文中, 我们集中于三常见的优化程序: 曝光时间, 裂解滴定, 和初级抗体稀释。产生可测量结果的能力取决于对鲁米诺基质未迅速耗尽时的曝光时间的分析, 因为基体损耗会导致信号丢失。裂解滴定法测定每种方法的线性动态范围, 不同的模型系统, 以及不同的抗体, 即使是相同的蛋白质靶。抗体稀释选择或接近饱和浓度, 确保信号的变化不会受到缺乏的自由抗体, 但只有不同数量的可用蛋白靶位。在优化过程中的其他考虑因素可能包括抗体孵育时间和堆积/样品加载时间。在大多数情况下, 仪器的默认设置提供最佳的分辨率和灵敏度平衡。但是, 在某些情况下, 通过调整这些参数可以改善分辨率或灵敏度的低下。
毛细管 electrophoretic-based 免疫分析方法提供快速、高效和可重现的蛋白质测量。虽然这些方法主要用于研究和开发环境, 但这些技术的一致性在管理和临床应用中具有潜在的效用。例如, 对环境毒物或疾病进展患者的易感性亚群的识别可以基于可访问的矩阵 (如血液、尿液和唾液) 中所测量的蛋白质生物标记物。随着试剂和操作成本的下降以及可以同时评估的样品和靶数的增加, 我们很可能会看到用于这类应用的毛细管 electrophoretic-based 免疫分析方法。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢美国环保局的研究和开发办公室-研究三角公园 (Tarpley) 图形和媒体团队的发展, 录音和编辑的教学视频的基思。我们还要感谢 ProteinSimple 的黛博拉普里切特关于优化我们的数据的有益对话.JM Guynn 得到了美国环境保护署橡树岭科学与教育研究/参与计划的支持。
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |