En kapillær-baserte immunanalyse med en kommersiell plattform for å måle mål proteiner fra total protein forberedelser er demonstrert. I tillegg er analysen parametere eksponeringstid, protein konsentrasjon og antistoff fortynning optimalisert for en celle kultur modell-systemet.
Ny teknologi som utnytter kapillær-baserte immunanalyser lover raskere og mer kvantitativ protein vurdering sammenlignet med tradisjonelle immunanalyser. Imidlertid ligner andre antistoff-basert protein analyser, optimalisering av kapillær-baserte immunanalyse parametere, for eksempel protein konsentrasjon og antistoff fortynning eksponeringstid er en viktig forutsetning for generering av meningsfull og pålitelig data. Mål må falle innenfor den lineære analysen der endringer i signalet er direkte proporsjonal med endringer i lysate konsentrasjon. Prosessen med å velge riktig lysate konsentrasjoner og antistoff fortynninger eksponeringstider i human bronkial epithelial celle linjen BEAS-2B er vist her. Analysen linearitet vises over en rekke hele cellen ekstra protein konsentrasjoner med p53 og α-tubulin antistoffer. Et eksempel på signalet burnout er sett på de høyeste konsentrasjonene med lange eksponeringstider, og en α-tubulin antistoff fortynning kurve vises demonstrere metning. I tillegg rapporteres eksempel eksperimentelle resultatene for doksorubicin-behandlet celler med optimalisert parameterne.
Kapillær electrophoretic immunanalyser måle protein uttrykk i cellen lysates bruker størrelse eller belaste separasjonssystemer og gir flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle immunanalyser. For eksempel sammenlignet med western blot, automatisert kapillær-baserte prosedyren eliminerer behovet for geleer, overføring enheter, og manuell vasker. I tillegg, er den absolutte mengden protein kreves ca 10 ganger mindre, gjør kapillær-baserte ideell for bruk med sjeldne celletyper eller begrenset utvalg1,2. Resultater er oppnådd i så lite som 3 h bruker automatiserte systemer og har tidligere vist seg for å være mer kvantitative og reproduserbar enn konvensjonelle western blot prosedyrer3,4,5. Prosessen for størrelse-baserte analyser består av lasting prøver som inneholder natrium dodecyl sulfate (SDS), dithiothreitol (DTT), og fluorescently merket molekylvekt markører i kapillær kolonner som inneholder stabling og separasjon matriser. Spenning på kapillærene skiller proteinene i prøvene etter størrelse, og UV lys immobilizes atskilt proteiner til kapillær veggen. Av kapillær er da immuno-analysert med mål-spesifikke primære antistoff og pepperrot peroxidase (HRP)-konjugert sekundære antistoff. Luminol og peroxide katalysere chemiluminescent lys generasjon som er målt ved en kostnad kombinert enhet (CCD) kamera og analysert for å quantitate protein.
Til tross for den relative lette og hastigheten på en automatisert kapillær-baserte electrophoretic immunanalyse plattform er optimalisering av analysen forhold som protein konsentrasjon og antistoff fortynning eksponeringstid viktig for å oppnå nøyaktig, reproduserbare resultater. Generelt bør følgende fremgangsmåter utføres for å optimalisere en analyse for disse systemene:
1) en skjerm skal utføres for å evaluere og velge antistoffer for signal og spesifisitet protein målet. Hvis tilgjengelig, kan renset protein eller målet epitope brukes til å vurdere spesifisitet; Det er imidlertid fortsatt viktig å vurdere potensielle uspesifisert signal i totale protein fra modellen systemet.
2) deretter skal dynamikkområdet til analysen bestemmes. I en ideell situasjon, er signalet dobling (målt ved hjelp av peak området) observert som eksempel konsentrasjon er doblet; men i praksis er en proporsjonal endring i signal å input på en forutsigbar måte (f.ekslineær passer) tilstrekkelig for protein kvantifisering. I tillegg definerer optimeringen protein konsentrasjon med høy signal, men fortsatt innenfor lineær område for eksperimentell modell.
3) bestemme den optimale antistoff konsentrasjonen med fast protein konsentrasjonen valgt i optimalisering trinn 2. Som antistoff konsentrasjonen øker, øker signalet til det flyer på metning. Et antistoff konsentrasjon nær denne fargemetning kreves for nøyaktig måling av protein konsentrasjon.
Prosessen som brukes til å optimalisere protein konsentrasjoner og antistoff fortynninger eksponeringstider for en automatisert kapillær-baserte størrelse analysen6 demonstreres bruke hele cellen utdrag isolert fra BEAS-2B, et SV-40 forvandlet menneske bronkial tarmepitelet linje. Protein isolert fra cellen eller vev utdrag utføres med en rekke publiserte protokoller7,8,9 og vil ikke bli dekket her. Resultatene av en prøve eksperimentere med optimalisert forholdene også rapportert totalt og fosforylert (serine 15, serine 20) p53 i kulturer utsatt for doksorubicin (en felles chemotherapeutic agent som induserer celle apoptose10) i 1.2, 1.8, og 2.4 µg/mL medier for 4 h før innhøsting. P53 toppen områdene blir normalisert til ɑ-tubulin, som brukes som en lasting.
I flere tiår, det har vært vedvarende interesse for utvikling av kapillær electrophoretic-baserte immunanalyse metoder på grunn av lav prøven og reagens utgifter, redusert behandling tid sammenlignet med tradisjonelle metoder, og høy kompatibilitet for automatisere prosedyre4,15. Det finnes en rekke forskjellige protokoller for separasjon av proteiner som har benyttet kapillærene, inkludert electrophoretic, electrokinetic, polymer sikting og isoelectric metoder, som isolerer proteiner av forskjellige egenskaper (henholdsvis, elektrostatisk belastning, partisjon likevekt, sikting egenskaper skiller matrise og pH)16. Her beskriver vi et antistoff-basert (eller immunanalyse) kapillært elektroforesemetode, ved hjelp av en polymer sikting separasjon, som er blitt automatisert og kommersielt vedtatt3. Fordelene med dette systemet inkluderer brukervennlighet og drift, standardisert og kommersielt tilgjengelig reagenser, og pålitelig, følsom målinger som krever mindre reagens og prøver i forhold til tradisjonelle protein analyser som western blot, enzym knyttet immunanalyse og andre formater3,4,5. Det har vært nevnt i forrige vurderinger av denne teknologien at størrelsen dataområdet protein som kan vurderes har vært begrenset av tilgjengelig separasjon matrix4, men siste offer har utvidet den målbare varierer fra 2 til 440 kDa17 . Dessuten, må noen lysate buffere er kjent for å være kompatibel med analysen18, derfor utvalg av eksperimentelle reagensene brukes vurderes på forhånd.
En stor fordel med en automatisert prosedyre med kommersielt tilgjengelige komponentene er konsistensen av resultater gjennom standardiserte metoder og reagenser. Dette minimerer sjansen for analysen feil ved å automatisere kritiske trinn i prosedyren. Det er imidlertid viktig å merke seg at enkelte praksis må følges under protokollen for å minimere problemer med kapillær electrophoretic-baserte immunanalyse. Først er det avgjørende at luminol-S/peroxide blandingen er forberedt friskt og umiddelbart før platen lasting. Konsekvent timing fører konsistent luminescence når den oksiderende agenten er lagt til, som vil resultere i konsekvent mål for en bestemt antistoff analysen etter analysen. Videre er det viktig at ikke utløpt reagenser blir brukt, som hovedsakelig påvirker styrken av oksiderende agent. I tillegg er det viktig at lasting rekkefølgen av prøver, antistoffer og andre følges strengt (se figur 1). Eventuelle reagens pipetted malplassert vil føre analysen feil og bortkastet kjøre.
Foruten fremgangsmåten kritiske kan primære problemer med teknikken generelt bli overvunnet gjennom optimalisering. Faktisk disse betingelsene gjelder for hver modell system/antistoff kombinasjon, og derfor bør fastsettes empirisk for hver nye analysen. I denne artikkelen vi fokusere på tre vanlige optimering prosedyrer: eksponeringstid, lysate titrering og primære antistoff fortynning. Muligheten til å generere målbare resultater, avhengig av analyse av en eksponeringstid når luminol underlaget ikke raskt tømmes, som substrat uttømming resulterer i tap av signal. Lysate titrering bestemmer lineær dynamiske område hver analysen, som kan variere med ulike modellsystemer, samt ulike antistoffer, selv for samme protein målet. Antistoff fortynninger valgt på eller nær mette konsentrasjoner Kontroller endringer i signal ikke påvirkes av mangel på gratis antistoff, men bare av ulik mengde tilgjengelig protein målet epitope. Andre hensyn under optimaliseringsprosessen kan være antistoff inkubasjon tid og stabling/sample lastetiden. I de fleste tilfeller tilbyr standardinnstillingene for instrumentet den beste balansen mellom oppløsning og følsomhet. Men i noen tilfeller kan dårlig oppløsning eller følsomhet forbedres ved å justere disse parameterne.
Kapillær electrophoretic-baserte immunanalyse metoder gir rask, effektiv og reproduserbar protein målinger. Mens disse metodene har hovedsakelig blitt benyttet i forskning og utvikling, har konsistensen av disse teknologiene potensielle verktøy i regulatoriske og kliniske applikasjoner. Identifikasjonen av utsatt subpopulasjoner miljømessige giftstoffer eller pasienter med progresjon av sykdommen kan for eksempel være basert på protein biomarkers målt i tilgjengelig matriser, som blod, urin og spytt. Reagens og operasjonen kostnader slippe og antall prøver og mål som kan samtidig vurdert øker, vil vi trolig se kapillær electrophoretic-baserte immunanalyse metodene som brukes for disse typer programmer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Keith Tarpley av US EPA Office for forskning og utvikling-Research Triangle Park (ORD-RTP) grafikk og medier team for utvikling, taping og redigering av instruksjons-video. Vi vil også takke Deborah Pritchett fra ProteinSimple for nyttig samtaler om optimalisering av våre data. JM Guynn ble støttet av Oak Ridge Institutt for vitenskap og forskning/deltagelse utdanningsprogram på det oss Environmental Protection Agency.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |