Summary
Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Anwendung der Peptid-Microarray-Technologie auf die Spezifitätsprofilierung von Antikörpern, die Histone und ihre posttranslationalen Modifikationen erkennen.
Abstract
Posttranslationale Modifikationen (PTMs) auf Histonproteinen sind weitgehend untersucht für ihre Rollen bei der Regulierung der Chromatinstruktur und der Genexpression. Die Massenproduktion und -verteilung von Antikörpern, die spezifisch für Histon-PTMs sind, hat die Forschung auf diesen Markierungen stark erleichtert. Als Histon-PTM-Antikörper sind Schlüsselreagenzien für viele Chromatin-Biochemie-Anwendungen, eine rigorose Analyse der Antikörperspezifität ist notwendig für eine genaue Dateninterpretation und fortgesetzte Fortschritte auf dem Gebiet. Dieses Protokoll beschreibt eine integrierte Pipeline für die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Peptid-Mikroarrays zur Profilierung der Spezifität von Histon-Antikörpern. Die Design- und Analyseaspekte dieses Verfahrens werden durch ArrayNinja, ein Open-Source- und interaktives Softwarepaket, das wir vor kurzem entwickelt haben, um die Anpassung von Microarray-Druckformaten zu optimieren, erleichtert. Diese Pipeline wurde verwendet, um eine große Anzahl von kommerziell verfügbaren und weit verbreiteten Histon-PTM-Antibiotika zu screenenS und Daten aus diesen Experimenten sind frei verfügbar durch eine Online-und erweiterte Histone Antibody Specificity Database. Jenseits von Histonen kann die hier beschriebene allgemeine Methodik weitgehend auf die Analyse von PTM-spezifischen Antikörpern angewendet werden.
Introduction
Genomische DNA ist elegant im eukaryotischen Zellkern mit Histonproteinen verpackt, um Chromatin zu bilden. Die sich wiederholende Untereinheit von Chromatin ist das Nukleosom, das aus 147 Basenpaaren von DNA besteht, die um einen oktameren Kern von Histonproteinen - H2A, H2B, H3 und H4 1 gewickelt sind. Chromatin ist weitgehend in lose gepackten Euchromatin und fest verpackten Heterochromatin-Domänen organisiert. Der Grad der Chromatin-Verdichtung regelt das Ausmaß, in dem Protein-Maschineries auf die zugrunde liegende DNA zugreifen können, um fundamentale DNA-templated Prozesse wie Replikation, Transkription und Reparatur durchzuführen.
Schlüsselregulatoren der Genomzugänglichkeit im Rahmen von Chromatin sind PTMs auf dem unstrukturierten Schwanz und Kerndomänen der Histonproteine 2 , 3 . Histone-PTMs funktionieren direkt durch die Beeinflussung der Struktur von Chromatin 4 und indirekt durchH die Rekrutierung von Leserproteinen und deren assoziierten makromolekularen Komplexen, die Chromatin-Remodeling-, Enzym- und Gerüstaktivitäten haben 5 . Studien der Histon-PTM-Funktion in den vergangenen zwei Jahrzehnten überwiegend vorschlagen, dass diese Markierungen spielen Schlüsselrollen bei der Regulierung der Zelle Schicksal, organismen Entwicklung und Krankheit Einleitung / Progression. Angetrieben durch Fortschritte in der Massenspektrometrie-basierten Proteomtechnologie wurden mehr als 20 einzigartige Histon-PTMs auf mehr als 80 verschiedenen Histonresten entdeckt 6 . Bemerkenswert ist, dass diese Modifikationen häufig in Kombinationen auftreten und im Einklang mit der "Histon-Code" -Hypothese sind, zeigen zahlreiche Studien, dass Leserproteine auf diskrete Bereiche des Chromatins durch Erkennung spezifischer Kombinationen von Histon-PTMs 7 , 8 , 9 gerichtet sind . Eine zentrale Herausforderung, die vorwärts geht, wird es sein, dem grEine Liste von Histon-PTMs und zu bestimmen, wie spezifische Kombinationen von Histon-PTMs die mit Chromatin verbundenen dynamischen Funktionen orchestrieren.
Antikörper sind die Lynchpin-Reagenzien für den Nachweis von Histon-PTMs. Als solche wurden mehr als 1.000 Histon-PTM-spezifische Antikörper kommerziell für den Einsatz in der Chromatin-Biochemie-Forschung entwickelt. Mit der rasanten Entwicklung der DNA-Sequenzierungstechnologie mit hohem Durchsatz werden diese Reagenzien ausgiebig von einzelnen Forschern und großflächigen epigenomischen "Roadmap" -Initiativen ( zB ENCODE und BLUEPRINT) in ChIP-seq (Chromatin-Immunpräzipitation gepaart mit Sequenzierung der nächsten Generation) eingesetzt ) Pipelines zur Erzeugung hochauflösender räumlicher Karten der Histon-PTM-Verteilung genomweit 10 , 11 . Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass die Spezifität von Histon-PTM-Antikörpern sehr variabel sein kann und dass diese Reagenzien unf Austretende Eigenschaften wie z. B. Off-Target-Epitop-Erkennung, starker positiver und negativer Einfluss durch benachbarte PTMs und Schwierigkeiten, die Modifikationsreihenfolge an einem bestimmten Rest ( z. B. Mono-, Di- oder Tri-Methyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 zu unterscheiden , 16 , 17 , 18 Daher ist eine rigorose Qualitätskontrolle von Histon-PTM-spezifischen Antikörperreagenzien notwendig, um die mit diesen wertvollen Reagenzien erzeugten Daten genau zu interpretieren.
Die Microarray-Technologie ermöglicht die gleichzeitige Abfrage von Tausenden von makromolekularen Wechselwirkungen in einem hochdurchsatz-, reproduzierbaren und miniaturisierten Format. Aus diesem Grund wurde eine Vielzahl von Microarray-Plattformen geschaffen, um die Protein-DNA 19 zu analysieren ,„> 20, Protein-Protein - 21 und Protein-Peptid - Wechselwirkungen 22. In der Tat, Histon - Peptidchips haben als informative Plattform zur Entdeckung für Chromatin - Biochemie Forschung entstanden, Hochdurchsatz - Profilierung der Autoren, Radiergummis ermöglicht, und die Leser von Histon PTM 15 , 23 , 24 und auch für die Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität 17 , 25. Über ihre Anwendung in der Chromatin- und Epigenetikforschung hinaus haben Histon-Peptid-Arrays potentielle Nutzen als diagnostischer / prognostischer Test für systemischen Lupus erythematodes und andere Autoimmunkrankheiten, bei denen Anti- Chromatin-Autoantikörper werden erzeugt 26 , 27 .
Hier beschreiben wir eine integrierte Pipeline, die wir für die Konstruktion, Fertigung und Ausführung entwickelt habenRindende Histon-Peptid-Mikroarrays zur Erzeugung von Spezifitätsprofilen für Antikörper, die Histone und ihre PTMs erkennen. Die Pipeline wird von ArrayNinja erleichtert, ein Open-Source, interaktive Software - Anwendung , die wir vor kurzem entwickelt, die die Design- und Analysestufen Microarray - Experimente 28 integriert. ArrayNinja funktioniert am besten in Google Chrome. Kurz gesagt wird ein Roboter-Kontakt-Mikroarray-Drucker verwendet, um eine Bibliothek von Biotin-konjugierten Histon-Peptiden an definierten Positionen auf Streptavidin-beschichteten Glasmikroskop-Objektträgern abzuscheiden. Arrays können dann in einem kompetitiven und parallelen Assayformat verwendet werden, um Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen abzufragen ( Abbildung 1 ). Die Peptidbibliothek besteht aus Hunderten von einzigartigen synthetischen Peptiden, die PTMs (Lysinacetylierung, Lysin / Arginin-Methylierung und Serin / Threonin-Phosphorylierung) allein und in relevanten Kombinationen, die weitgehend von Proteomik-Datensätzen abgeleitet sind, beherbergen. Methoden zur Peptidsynthese und Validierung Sind an anderer Stelle bekannt 23 . Daten, die aus unseren laufenden Histon-PTM-Antikörper-Screening-Bemühungen unter Verwendung dieser Array-Plattform generiert werden, werden auf einer öffentlichen Webressource, der Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com) archiviert. Bemerkenswerterweise wurden auch Histon-Peptid-Mikroarrays, die mit Variationen dieses Protokolls hergestellt wurden, ausgiebig verwendet, um die Aktivität der Histon-PTM-Leserdomänen 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 zu charakterisieren und in jüngerer Zeit Histon zu profilieren PTM-Schriftsteller und Radiergummi-Aktivitäten 24 .
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Abbildung 1: Karikatur Darstellung der schrittweisen Vorgehensweise zur Antikörper-Screening auf einem Histon-Peptid-Mikroarray. Biotinylierte Histon-Peptide, die definierte posttranslationale Modifikationen (rote und blaue Kreise) beherbergen, werden mit Biotin-Fluorescein auf Streptavidin-beschichtetem Glas co-gedruckt. Positive Wechselwirkungen werden als rote Fluoreszenz visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Protocol
1. Installieren und Ausführen von ArrayNinja
- Downloaden und installieren Sie Oracle Virtual Box von www.virtualbox.org.
- Laden und entpacken Sie die ArrayNinja virtuelle Maschine (VM) von http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
- Öffnen Sie die virtuelle Box und fügen Sie die ArrayNinja VM hinzu, indem Sie auf "Maschine", "Hinzufügen" klicken und arrayninja.vbox aus dem Ordner auswählen, in dem ArrayNinja VM gespeichert wurde.
- Starten Sie ArrayNinja, indem Sie es in der virtuellen Box auswählen und auf den grünen Pfeil "Start" klicken.
- Virtual Box öffnet ein neues Fenster und zeigt eine Meldung an, auf die die VM zugreifen kann, indem sie den Webbrowser zum localhost navigiert: 2080.60; HINWEIS: Eine Containerversion von ArrayNinja ist auch über hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/ verfügbar.
2. Entwerfen des Array Slide und Source Plate Layouts
- Klicken Sie unter dem "Plan ein Folienlayout" auf der ArrayNinja-Oberfläche auf den Link, der dem verwendeten Microarray-Drucker entspricht.
HINWEIS: ArrayNinja wurde programmiert, um die Roboterbewegung von zwei häufig verwendeten Microarray-Druckern nachzuahmen (siehe Tabelle1). Die Kompatibilität mit den anderen Arradern kann auf Anfrage konfiguriert werden. - Klicken Sie in das Dialogfeld 'Leertafel', geben Sie "leer" ein und klicken Sie auf "Enter". Siehe Abbildung 2 für einen Screenshot des ArrayNinja Designmoduls.
- Den Fleckdurchmesser auf 275 μm einstellen und den Abstand auf 375 μm stellen. Passen Sie die verbleibenden Einstellungen an (Plattenblöcke / Plattenreihe, Gesamtplatte Zeilen, Replikate, Funktionen in y, Super Arrays, SuperA Fudge, siehe Abbildung 2 ), um anzupassen, wie die Features auf der Microarray Folie erscheinen.
HINWEIS: Der Spotdurchmesser wird durch die Größe des Microarray-Pins bestimmt. Da diese Einstellungen angepasst sind, wird die Karikatur-Folie in Echtzeit aktualisiert. Verwenden Sie diese Karikatur, um zu sehen, wie jede Einstellung das endgültige Folienlayout modifiziert. - Nachdem das Layout der Features auf der Folie abgeschlossen ist, Maus über jede einzelne Funktion und geben Sie die Feature-ID in das Pop-up-Dialogfeld.
HINWEIS: Funktionskennungen können aus Zahlen, Buchstaben oder Kombinationen bestehen. Dies ist nur für eindeutige Funktionen erforderlich, und ein Dialogfeld wird nicht angezeigt, wenn Replikate ausgewählt sind. - Nachdem alle eindeutigen Funktionen eine Kennung zugewiesen wurden, klicken Sie auf 'befüllen'. Geben Sie einen Namen für das Folienlayout ein und klicken Sie auf "Drucken Sie Ihren Teller", um zu speichern. Es wird eine neue Seite geöffnet, in der die Anzahl der 384-Well-Quellplatten angezeigt wird, die für die Herstellung des gewählten Diaplaydesigns erforderlich sind, und eine Tabelle, die die physikalische Position jedes Merkmals, das in die Quellplatte (n) geladen werden soll, abbildet.
HINWEIS: Denken Sie daran, diesen Namen zu verwenden, da er bei der Analyse von Microarray-Daten verwendet wird (siehe Abschnitt 6.2). Klicken Sie auf "print your plate" speichert das Layout in ArrayNinja.
Abbildung 2: ArrayNinja Design Modul. Ein Screenshot von der Das ArrayNinja Designmodul ist in der gepunkteten Linie dargestellt. Das Bedienfeld (oben) zeigt alle Parameter an, die auf dem Microarray-Drucker verändert werden können. Da diese Parameter eingestellt sind, aktualisiert sich das Karikaturbild des Folienlayouts (unten links) in Echtzeit. Nachdem das Layout eingestellt ist, kann der Benutzer die Maus über einzelne Punkte bewegen, um eindeutige Merkmalskennungen einzugeben. ArrayNinja konstruiert von diesem Benutzer eine Karte der Position jedes Merkmals in der Quellplatte (n) (unten rechts), die benötigt wird, um ein bestimmtes Mikroarray-Folienlayout herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Herstellung von Microarrays
- Vorbereiten der Quellplatte
- Verwenden Sie die mit ArrayNinja erstellte Karte in Abschnitt 2.5, um die 384-Well-Quellplatte (n) zu erstellen.
HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen von Peptiden, die auf dieser Plattform abgefragt werden, können an anderer Stelle gefunden werdenS = "xref"> 17 - Ablagerung von 1 - 2 & mgr; l von jedem Merkmal ( z. B. biotinyliertes Histonpeptid) in die korrekte Vertiefung der 384-Well-Quellenplatte (n).
HINWEIS: Biotinylierte Histonpeptide werden typischerweise aus 200 - 400 μM Stammlösungen abgeschieden, was einem 10 bis 25fachen molaren Überschuss an Peptid zu Streptavidinbindungsstellen in einem einzigen Arraypunkt entspricht. Dies wird nach folgender Gleichung berechnet:
Wobei V das Volumen ist, das von einem Stift geliefert wird, [ P ] ist die Konzentration des zu druckenden Merkmals, N A ist die Nummer von Avogadro und S ist die Fläche eines Flecks. C ist die Abdeckung der Folie, ausgedrückt als Anzahl der Streptavidin-Moleküle pro Flächeneinheit multipliziert mit drei (die durchschnittliche Anzahl der verfügbaren Streptavidin-Bindungsstellen). V und C werden von den jeweiligen Herstellern erhalten. Andere Eigenschaften könnenErfordern unterschiedliche Konzentrationen in Abhängigkeit von der Größe des Biomoleküls, wo die Verdrängung ein Anliegen sein kann. Eine Reihe von Druckkonzentrationen für jede neue Art von Merkmal sollte empirisch getestet werden, um die optimale Druckkonzentration zu bestimmen. - Verdünnen Sie jedes Merkmal 10-fach mit 1x Druckpuffer, ergänzt mit 1% Rinderserumalbumin (BSA). Die Quellplatte (n) bei 500 xg für 2 min bei Raumtemperatur drehen.
HINWEIS: Die Einbeziehung von Fluorescein-markiertem Biotin (5 μg / μL) im Druckpuffer wird als Spotting-Kontrolle und als visuelle Hilfe empfohlen, um eine korrekte Array-Ausrichtung während der Analyse zu ermöglichen (siehe Abbildung 4 ).
- Verwenden Sie die mit ArrayNinja erstellte Karte in Abschnitt 2.5, um die 384-Well-Quellplatte (n) zu erstellen.
- Druckprotokoll ( Abbildung 3A - B ).
- Bereiten Sie den Arrayer vor, indem Sie den Müllsammelbehälter entleeren und den Waschlösungsbehälter und den Befeuchterbehälter mit sterilem destilliertem Wasser füllen.
- Geben Sie die Parameter u einUm die Folie in ArrayNinja (Abschnitt 2 und Abbildung 2 ) in das Mikroarray-Druckersteuerprogramm zu entwerfen.
- Verwenden Sie das Mikroarray-Druckersteuerprogramm, stellen Sie den Waschvorgang für eine 1-s-Waschung mit einem Eintauchen ein. Setzen Sie die Nachwäsche-Einstellungen, um die Stifte 5 mal nach jeder Wäsche wieder zu tauchen. Stellen Sie die Feuchtigkeit auf 60% ein.
HINWEIS: Die optimale Waschkonfiguration kann je nach verwendetem Microarray-Drucker variieren. Die optimale Nachwasch-Pin-Dip-Konfiguration kann je nach verwendetem Microarray-Drucker variieren. - Setzen Sie funktionalisierte Objektträger ( z. B. Streptavidin-beschichtetes Glas) in die Substratplatten ein und legen Sie alle Platten in den Plattenaufzug. Setzen Sie die Quellplatte (n) in den Plattenhalter (s) ein und legen Sie sie in den Quellplattenheber.
- Klicken Sie auf 'drucken'. Überwachen Sie den Druckvorgang für ein paar Runden von Feature Deposition, um sicherzustellen, dass alle Wasch- und Dip-Einstellungen korrekt sind. Wenn die Druckauflage abgeschlossen ist, entfernen SieDie Substratplatten aus dem Arrayer.
HINWEIS: Wenn große Druckaufträge die Beendigung der Sperrschritte innerhalb eines Tages beenden, können die bedruckten Folien in einer befeuchteten Kammer bei 4 ° C über Nacht inkubiert werden. Inkubieren Sie die Folien neben einem kleinen Becher Wasser in einem Karton mit Plastikfolie versiegelt. - Blockieren Sie die Objektträger mit Blockierpuffer für 30 min bei Raumtemperatur unter Mischen.
- Waschen der Objektträger 2 x 10 min bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,6 unter Mischen. Trocknen Sie die Objektträger durch Spinnen in einer Microarray-Objektträgerzentrifuge für 30 s bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Für die Bearbeitung einer großen Anzahl von Folien auf einmal kann eine Hochdurchsatz-Mikroskop-Objektträgerwaschkammer verwendet werden, so dass 50 Folien parallel gewaschen werden können. - Für Objektträger, die mit Wachs partitioniert werden sollen, fahren Sie mit Abschnitt 4.1 fort. Für alle anderen Designs, lassen Sie Dias bei 4 ° C geschützt vor Licht und Feuchtigkeit.
HINWEIS: Gedruckte biotinylierte HistonpeptideSind mindestens 6 Monate stabil, wenn sie auf diese Weise gelagert werden.
4. Partitionieren von Microarray-Folien
- Hydrophobes Wachsstift ( Abbildung 3C )
- Wenden Sie Wachs um die Bereiche, die Merkmale mit einem Wachsstift enthalten. Lassen Sie das Wachs 5 Minuten lang an der Luft trocknen, bevor Sie mit Abschnitt 5 fortfahren.
HINWEIS: Nach dem Blockieren können die Array-Spots sehr schwer durch das Auge sichtbar werden. Die Dia-Design von ArrayNinja kann gedruckt und als Anleitung für die Anwendung von Wachs verwendet werden.
- Wenden Sie Wachs um die Bereiche, die Merkmale mit einem Wachsstift enthalten. Lassen Sie das Wachs 5 Minuten lang an der Luft trocknen, bevor Sie mit Abschnitt 5 fortfahren.
- Siliziumdichtung ( Abbildung 3D )
- Ziehen Sie den klaren Film von der Rückseite der Array-Dichtung und legen Sie die Klebstoffseite nach unten auf die Microarray-Folie.
- Halten Sie die Dichtung für 5 s vor dem Fortfahren auf Abschnitt 5.
- Wachs Impressum ( Abbildung 3E )
- Für Objektträger, die durch Wachs partitioniert werden sollen, drucken Sie einen Testschieber auf Normalglas mit 10% BSA. Verwenden Sie diese Testfolie, um die Wachs-Imprinter-Guides oder Array-Einstellungen zu optimieren, um sicherzustellen, dass alle Funktionen innerhalb der Wachsformkammern liegen.
- Den Mikroarray-Wachs-Imprinter auf 85 ° C erhitzen, bis das gesamte Wachs vollständig geschmolzen ist, ca. 30 min.
- Setzen Sie die Folie mit der bedruckten Seite nach unten und schieben Sie die Folie bis hin zur richtigen Führung auf dem Microarray-Imprinter. Ziehen Sie den Hebel hoch, um die Form mit der Oberfläche des Objektträgers in Berührung zu bringen. Halten Sie für 2 s.
HINWEIS: Die Haltezeit kann geändert werden, um eine optimale Wachsgrenzdicke zu erreichen. - Entfernen Sie schnell die Folie und visuell überprüfen Sie die Wachsgrenzen, um sicherzustellen, dass alle Brunnen eingeschlossen sind und dass die Ränder nicht so dick sind, dass sie auf den Flecken greifen. Schaufeln bei 4 ° C vor Feuchtigkeit und Licht schützen.
HINWEIS: Die Haltezeit kann erhöht oder verringert werden, um dickere oder dünnere Ränder zu erhalten.
Abbildung 3: Microarray-Fertigung. (A) Histon-Peptid-Mikroarray-Herstellung auf Streptavidin-beschichteten Mikroskop-Objektträgern unter Verwendung eines Kontakt-Mikroarray-Druckers. (B) Mikroarrays, die mit 3 Subarrays eines 48 x 48 Gitter von Peptidmerkmalen hergestellt wurden. Trennung von (C) 3 Subarrays mit einem hydrophoben Wachsstift, (D) 2 Subarrays mit Siliziumkleber und (E) 48 Subarrays mit Wachsabdruck. Alle dargestellten Mikroarrays werden mit 25 x 75 mm Objektträgern hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Hybridisierung eines Histon-PTM-Antikörpers mit einem Peptid-Microarray
- Hybridisierungspuffer (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20) vorbereiten.
- Äquilibrieren Sie die Folie in HybridisierungspufferMit einem Hybridisierungsgefäß. Die gesamte Folie im Hybridisierungspuffer vollständig abdecken und für 30 min bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit inkubieren.
- Vorbereitung einer Lösung, die verdünnten Histon-PTM-Antikörper in Hybridisierungspuffer enthält.
HINWEIS: In den Beispieldaten wurden sowohl Histon-Antikörper # 1 als auch Antikörper # 2 1: 1000 in Hybridisierungspuffer verdünnt Als Ausgangspunkt empfiehlt sich ein Verdünnungsbereich ähnlich dem, der für das Immunoblotting verwendet wird. - Inkubieren Sie das Array mit der Antikörperlösung für 1 h bei 4 ° C. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie das Array 3 mal für 5 min bei 4 ° C mit kaltem PBS, pH 7,6.
- Vorbereitung einer 1: 5.000 - 1: 10.000 Verdünnung des fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörpers in Hybridisierungspuffer.
- Inkubieren Sie das Array mit sekundärer Antikörperlösung für 30 min bei 4 ° C vor Licht geschützt. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Mikroarray-Folie 3 mal für 5 min bei 4 ° C mit PBS, pH 7,6. TauchenDas Mikroarray in einem 50-ml-konischen Röhrchen mit 0,1x PBS, pH 7,6, um überschüssiges Salz bei Raumtemperatur zu entfernen. Trocknen Sie den Objektträger in einer Mikroarray-Gleitzentrifuge bei Raumtemperatur.
- Scannen Sie die Folie mit einem Microarray-Scanner mit einer Auflösung von 25 μm oder höher nach dem empfohlenen Scan-Protokoll des Microarray-Scanners.
HINWEIS: Wenn Fluorescein-markierter Biotin-Tracer vorhanden ist, scannen Sie sowohl den grünen Kanal (zB: 488 nm, em: 509 nm) als auch den Kanal, der dem fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörper entspricht, typischerweise Rot (ex: 635 nm, em : 677 nm). Das Ziel des Scannens ist es, Einzelkanal-TIF-Dateien zu erhalten, die zu einer einzigen .png-Datei zusammengeführt werden können (wie in Abschnitt 6.1 beschrieben).
6. Analyse von Microarray-Daten mit ArrayNinja
- Vorbereiten eines zusammengesetzten Mikroarraybildes
HINWEIS: Das Ziel dieses Abschnitts ist es, eine .png-Bilddatei zu erstellen, die die beiden einkanaligen .tif-Dateien zusammenführt (erhalten in Abschnitt 5). DiesIst das einzige Bildformat, das mit dem ArrayNinja Analysemodul kompatibel ist. Die folgenden Anweisungen stellen eine Möglichkeit dar, eine zusammengeführte Bilddatei zu erhalten. Es stehen jedoch auch andere Lösungen zur Verfügung ( zB die Freeware ImageJ).- Von der Kommandozeile in einem bash-Terminal eines Computers mit der Freeware ImageMagick installiert, navigieren Sie zu dem Ordner, der die einzelnen Kanal-TIF-Dateien enthält, und kopieren / fügen Sie die folgenden Schritte ein, indem Sie zwischen jedem Schritt "eingegeben" (6.1.4 - 6.1) .7).
HINWEIS: Dateinamen in Großbuchstaben ( zB RED_CHANNEL) sollten durch den Dateinamen der Microarray-Folienbilder ersetzt werden. - Bei Bedarf zuerst die Bilder mit dem Befehl 'convert INPUT.tif -negate OUTPUT.tif' invertieren. Dies ist erforderlich, wenn der Scanner die .tif-Dateien mit dem Signal in Weiß und Hintergrund in Schwarz aufnimmt.
- Konvertieren -tiefe 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0-kanal GB -evaluate set 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
- ConvErt - Tiefe 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -Kanal RB -Evaluate set 0 -delete 0 outa.png 2> error.file.
- Konvertieren -tiefe 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0-kanal RG -evaluate set 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
- Konvertieren out.png outa.png outB.png -set Farbraum RGV-combine merged.png.
HINWEIS: Eine Datei mit dem Namen 'merged.png' wird im selben Ordner wie die Original-TIF-Dateien gespeichert.
- Von der Kommandozeile in einem bash-Terminal eines Computers mit der Freeware ImageMagick installiert, navigieren Sie zu dem Ordner, der die einzelnen Kanal-TIF-Dateien enthält, und kopieren / fügen Sie die folgenden Schritte ein, indem Sie zwischen jedem Schritt "eingegeben" (6.1.4 - 6.1) .7).
- Quantifizierung von Daten mit ArrayNinja
- Öffnen Sie ArrayNinja und klicken Sie auf den entsprechenden Microarray-Drucker-Link unter "Um Bilder zu quantifizieren, die eine bekannte Quellplatte haben". Geben Sie den Namen des gespeicherten Dia-Designs (Schritt 2.5) im Dialogfeld "Lastplatte" ein und klicken Sie auf "Enter". Siehe Abbildung 4 für einen Screenshot des ArrayNinja-Analysemoduls.
- Klicken Sie auf "Datei auswählen" und navigieren Sie zu der in Abschnitt 6.1 erstellten Datei 'merged.png'. Das fusionierte sich vorE wird geladen sowie ein Raster für die Folie Layout.
- Verwenden Sie die Schieberegler am unteren Rand des ArrayNinja Bedienfeldes, um den Kontrast, die Helligkeit und den Mittelpunkt einzustellen.
HINWEIS: Diese Anpassungen dienen nur der Visualisierung und haben keinen Einfluss auf die Quantifizierung. - Wählen Sie "Auflösung" und geben Sie den Wert ein, der mit der Auflösung des gescannten Bildes übereinstimmt. Benutze die "Margin Side" und "Margin Top", um das Raster in die Ausrichtung mit den Spots auf dem Array zu verschieben. Passen Sie nach Bedarf an, um das Raster so genau wie möglich über jede Stelle zu bringen.
- Klicken Sie auf 'Spot Seek' und warten Sie, bis die Schaltfläche auf die ursprüngliche graue Farbe zurückkehrt.
HINWEIS: Dies kann mehrmals wiederholt werden, um die Gitterkreise auf einzelnen Stellen zu zentrieren. Die Seek-Funktion entspannt das Gitter auf jeden Punkt, um die Ausrichtung fein abzustimmen. - Ändern Sie den Wert "Super Arrays" auf "1", um jedes Sub-Array-Panel einzeln zu bearbeiten (falls gewünscht). Bei Verwendung eines 4X 12 Wachsabdruck-Folienlayout ( Abbildung 3E ), verwenden Sie die Bedienelemente "iPin" "jPin" und "subA", um die Funktionen auszuschalten, um eine beliebige Kombination von 4 x 12 Vertiefungen zu analysieren. Um zum Beispiel die obersten linken und oberen rechten Brunnen als Replikate voneinander zu analysieren, geben Sie "1 4" in iPin, "1 1" in jPin und "1 4" in subA ein. Drücken Sie Enter'.
- Bewege die Maus über einzelne Punkte, um die Identität dieser Funktion zu sehen.
- Klicken Sie auf "Toggle Zoom", um die Funktionen sorgfältiger zu überprüfen. Wählen Sie Hintergrundreferenzpunkte, indem Sie die Taste 'R' drücken, während sich die Maus über einem Punkt befindet. Referenzpunkte werden in orange hervorgehoben.
HINWEIS: Im "toggle zoom" -Modus wird in der oberen rechten Ecke ein vergrößertes Bild der Funktion angezeigt, die die Maus überschreitet. Eine detaillierte Diskussion über zusätzliche Hintergrundkorrekturmerkmale in ArrayNinja werden an anderer Stelle diskutiert 28 . - Umschalten von Flecken (mit vielfältiger Fleckmorphologie oder Trümmer, die eine genaue Quantifizierung beeinträchtigen), indem man die Taste "A" drückt, während man die Maus über die betroffenen Stellen schwebt. Inaktivierte Flecken werden weiß.
- Klicken Sie auf 'befüllen', gefolgt von 'Submit', um die Spots zu quantifizieren.
HINWEIS: Eine neue Registerkarte öffnet und zeigt ein Balkendiagramm von Daten an, die auf den hellsten Punktdurchschnitt normalisiert sind. Eine Tabelle unterhalb des Balkendiagramms enthält sowohl die normierten als auch die Rohdatenwerte. Diese Tabelle kann in eine Tabellenkalkulation für die Archivierung und weitere Analyse kopiert werden.
Abbildung 4: ArrayNinja Analysemodul. Ein Screenshot des ArrayNinja Analysemoduls wird gezeigt. Das Bedienfeld (oben links) zeigt alle Parameter an, die angepasst werden können, um das Array zu visualisieren, Spots zu finden und ein Raster über das Raster auszurichtenArray-Bild. Wenn Sie die Maus über eine Funktion schweben, erscheint eine vergrößerte Ansicht (oben rechts) und zeigt ein Popup an, das die mit dieser Funktion verknüpften Identifikationsinformationen enthält (unten). Referenzpunkte, die für die Hintergrundkorrektur ausgewählt wurden, sind orange. Merkmale, die von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen werden sollen, sind weiß. ArrayNinja enthält eine textbasierte Suchfunktion, die übereinstimmende Funktionen in gelb hervorhebt, wie im Beispiel für H4K16 gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine Peptid-Mikroarray-Plattform für die Analyse der Histon-PTM-Antikörperspezifität zu entwerfen und herzustellen. Das Array fragt eine Bibliothek von mehr als 300 einzigartigen Peptidmerkmalen (20 - 40 Reste in der Länge) ab, die viele der bekannten Kombinationen von PTMs darstellen, die auf Kern- und Variantenhistonproteinen gefunden wurden 38 . Diese Pipeline war ein Arbeitspferd für das Screening von vielen weit verbreiteten und kommerziell erhältlichen Histon-PTM-Antikörpern, und vollständige Datensätze sind auf der Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com) verfügbar. 17
Das Rückgrat unserer Pipeline ist ArrayNinja, eine Open-Source - Software - Anwendung , die wir vor kurzem entwickelt, die die Planung und Analyse Phasen der Microarray - Arbeit 28 integriert. Das ArrayNinja-Analysemodul ermöglicht es Benutzern, in informa zu interagierenMit ihrer rohen Array-Bilddatei. Die gedruckten Merkmalsidentitäten werden automatisch mit dem Bild integriert, und diese Identitäten können durch das Hover des Mauszeigers über einen Punkt aufgedeckt werden. Diese Integration ermöglicht auch eine schnelle Suche nach interessanten Merkmalen nach Namen und Ausschluss von Merkmalen aus der Downstream-Analyse. ArrayNinja bietet auch Optionen für lokale und nichtlokale Hintergrundgeräuschkorrektur sowie ein Korrekturschema, das sich an die Morphologie anpasst. Vollständige Details von ArrayNinja und seine Fähigkeiten können an anderer Stelle gefunden werden 28 .
ArrayNinja berechnet Signalintensitäten für jedes Peptidmerkmal und aggregiert diese Intensitäten in Mittelwerte mit Fehler basierend auf Merkmalsidentität. Raw- und normalisierte Signaldurchschnitte werden zurückgegeben, wobei die Normalisierungskonstante durch den hellsten Merkmalsmittelwert bestimmt wird. Die Signalintensitäten für jedes Peptid können verwendet werden, um die relative Affinität zu vergleichen Des Antikörpers unter den Merkmalen des Mikroarrays. Hier zeigen wir repräsentative Datensätze für zwei mit dieser Pipeline profilierte Antikörper, die die Epitop-Erkennungseigenschaften hervorheben, die bei der Interpretation der mit diesen Reagenzien erzielten Ergebnisse berücksichtigt werden sollten ( Abbildung 5 ).
Off-Target-Erkennung ist ein Anliegen für alle Antikörper und Gemeinsamkeiten in Epitopen um modifizierbare Histonreste machen dies eine besondere Herausforderung für Histon-PTM-Antikörper. Tatsächlich bindet ein Antikörper, der zur Erkennung von tri-methyliertem Lysin 9 auf Histon H3 (H3K9me3) angehoben wird, bei H3K18, H3K27 und Lysin 20 an Histon H4 (H4K20me3) oder besser als H3K9me3 ( Abbildung 5A ) trifulierte Peptide. Die Sequenz, die H3K9 (ARKS) umgibt, wird mit H3K27 konserviert, und die Kreuzreaktivität von Histon-PTM-Antikörpern und Chromatinreglern, die diese Stellen binden und modifizieren, wurde an anderer Stelle festgestelltSs = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 . Eine andere beobachtete Off-Target-Erkennungseigenschaft, die Methyl-Lysin-Antikörpern gemeinsam ist, ist eine Unfähigkeit, die Methyl-Ordnung zu unterscheiden. Dies wird durch Ergebnisse mit einem H3K4me3-Antikörper veranschaulicht, der mit H3K4me2- und H3K4me1-Peptiden kreuzreagiert ( Abbildung 5B ). Die Unterscheidung zwischen der Methylreihenfolge ist wichtig, da Studien gezeigt haben, dass H3K4me3, H3K4me2 und H3K4me1 unterschiedlich über das Genom verteilt sind und wahrscheinlich auf unterschiedliche Weise funktionieren 42 , 43 . Zum Beispiel befindet sich H3K4me3 an den Transkriptionsstartstellen der aktivsten transkribierten Gene, während aktive Enhancer häufig durch H3K4me1 44 markiert sind.
Zusätzlich zur Off-Target-Erkennung, positiv und negativ beeinflussenE durch benachbarte PTMs ist eine allgemein beobachtete Eigenschaft von Histon-Antikörpern. Der in Abbildung 5A dargestellte H3K9me3-Antikörper wird durch Acetylgruppen an benachbarten Lysinresten positiv beeinflusst. Tatsächlich zeigt die jüngste Massenspektrometrieanalyse, dass Acetylgruppen, insbesondere H3K14ac, häufig mit H3K9me3 38 auftreten . Der in 5B gezeigte H3K4me3-Antikörper wird durch die benachbarte Phosphorylierung bei Threonin 6 (H3T6p) negativ beeinflusst. Es ist bekannt, dass H3T6p sowohl positive als auch negative Auswirkungen auf die Erkennung von H3K4me3 durch Leserproteine hat und dies als dynamischer Mechanismus zur Regulierung der Rekrutierung spezifischer Chromatinfaktoren 15 , 45 dienen kann .
Abbildung 5: Analyse von Antikörpern auf Peptid-Mikroarrays. Analyse von (A) H3K9me3 (Antikörper # 1) und (B) H3K4me3 (Antikörper # 2) Antikörpern auf Peptidmikroarrays. Grüne Linien / Balken zeigen das Peptid an, das nur das beabsichtigte Ziel-PTM beherbergt. Graue Linien / Balken zeigen Peptide an, deren Signalintensität nicht signifikant unterschiedlich ist (p> 0,05) von der grünen Linie / bar, berechnet unter Verwendung einer Einweg-ANOVA, die die mittlere relative Intensität aller Peptide mit dem Zielpeptid vergleicht. Rote und blaue Linien / Balken zeigen das Signal an, das signifikant verringert oder erhöht ist (p <0,05) von der grünen Linie / bar. Orange Linien / Balken zeigen Off-Ziel-Peptide an. Die Daten werden als (links) eine visuelle Darstellung der PTM-Komplexität auf Peptiden angezeigt, die N-terminale Bereiche der H3- und H4-Schwänze überspannen, wobei die Breite jeder Zeile der relativen Intensität entspricht, die für dieses Peptidmerkmal gemessen wird, und (rechte) Balkendiagramme Anzeige der relativen Signalintensitätsmittelwerte ± SEM von 6 EinzelpunktmaßAuf Mikroarrays. Alle in dieser Analyse enthaltenen Peptide sind 20 Aminosäuren in der Länge, die entweder Histon H3 Aminosäuren 1 - 20 oder 15 - 34 entsprechen. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Zuverlässigkeit der Antikörper in biomedizinischen Forschungsanwendungen liegt im Mittelpunkt 46 , 47 . Dies trifft besonders für die Chromatin-Biochemie zu, da die Position von Antikörpern als Schlüsselinstrumente für die Mehrheit der Techniken zur Charakterisierung der Häufigkeit und Verteilung von Histon-PTMs entwickelt wurde. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine optimierte Pipeline für die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Peptid-Mikroarrays zur Analyse der Histon-PTM-Antikörperspezifität. Diese Pipeline wurde verwendet, um eine große Anzahl von kommerziell erhältlichen und weit verbreiteten Histon-PTM-Antikörpern zu screenen, und Daten, die aus diesen Experimenten erzeugt wurden, sind frei verfügbar durch eine Online- und expandierende Histone-Antikörper-Spezifitätsdatenbank (www.histoneantibodies.com) 17 .
Scheinbar aus unserer und anderen Arbeit sind häufige Fälle von ungünstigen Histon-PTM-Antikörper-Verhalten, die die interpretat komplizieren könnenIonen von Daten, die mit diesen Reagenzien 12 , 15 , 17 erzeugt wurden . Strengere und umfassendere Qualitätskontrollmaßnahmen von Antikörperfirmen sind daher gerechtfertigt. Experimente und epigenome Konsortialführer ( zB ENCODE, BLUEPRINT) müssen auch bei der Auswahl eines Reagenzes für ihre Studie Strenge in ihrer eigenen Auswertung von Histon-PTM-Antikörpern zeigen. Darüber hinaus vereinheitlichen die Bemühungen, die Charge-to-Batch-Variabilität zu minimieren, die Verwendung von hoch validierten Affinitätsreagenzien über epigenome Mapping-Plattformen zu standardisieren und alternative Affinitäts-Tools zu entwickeln, sind alle umsetzbaren Elemente, um dieses Forschungsproblem zu lösen.
Mikroarrays haben eine Reihe von Vorteilen gegenüber Mikroplatten-basierten Assays ( zB ELISA), die sie besonders zur Charakterisierung der Histon-PTM-Antikörperspezifität veranlassen. Microarrays ermöglichen eine parallele und konkurrierende Analyse von Tausenden von einzelnen Peptid-Antikörper-Wechselwirkungen mit minimalem Materialverbrauch. In dem hier beschriebenen Protokoll sind 700 Picomolen jedes Peptidmerkmals ausreichend, um 100 Mikroarray-Objektträger zu erzeugen. Zusätzlich kann die Antikörperanalyse unter Verwendung von weniger als 1 & mgr; g des Antikörpers abgeschlossen werden, und es können benutzerdefinierte Arrayformate mehrere Antikörper und verschiedene Antikörperverdünnungen parallel untersuchen.
Das Entwerfen von benutzerdefinierten Layouts auf Microarrays kann eine aufwändige Aufgabe sein. Darüber hinaus erfordert jedes neue Microarray-Design den Aufbau einer neuen Analysevorlage. Wir haben festgestellt, dass dies für die Realisierung der vollen Nützlichkeit der Microarray-Technologie unerschwinglich ist. Das motiviert unsere Entwicklung ArrayNinja, eine interaktive, Open-Source - Software - Anwendung, die die Design- und Analyseaspekte von Microarray - Experimenten 28 nahtlos integriert. Das Designmodul von ArrayNinja ermöglicht es dem Benutzer, eine Folie interaktiv zu gestalten, um das für ein Experiment erforderliche Layout anzupassen. ArrayNinja virtOrdnet die Roboterbewegung des Druckers ordnungsgemäß ab und übersetzt diese auf das Quellplattenlayout für eine gegebene Gleitgestaltung ( Abbildung 2 ). Das Erstellen von benutzerdefinierten Array-Formaten ist jetzt eine schnelle und routinemäßige Praxis. Ein weiteres wichtiges Merkmal von ArrayNinja ist die Verbindung zwischen den Design- und Analyseschritten der Microarray-Arbeit. Mit benutzerdefinierten Einstellungen aus dem Design-Modul überlagert ArrayNinja ein interaktives Raster auf einem gescannten Mikroarray-Bild, so dass der Benutzer über eine beliebige Funktion hinausschauen kann, um seine Identität zu identifizieren oder nach interessanten Merkmalen zu suchen ( Abbildung 4 ).
Mehrere kritische Schritte dieser Pipeline sind bemerkenswert. Zuerst sollte bei der Gestaltung des Drucklayouts berücksichtigt werden, dass genügend replizierte Punkte enthalten sind, um bei der Datenerfassung eine Signifikanz zu erlangen. Zusätzlich zur Berücksichtigung der Pin-to-Pin-Variabilität sollte jedes Merkmal durch mindestens zwei verschiedene Pins abgelegt werden. Schließlich ist vielleicht der kritischste Schritt der physische GeneratIon der Quellplatte. Die erfolgreiche Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen hochdichten Mikroarrays beruht auf der Fähigkeit, die Identität jedes Merkmals an ihren physischen Standort auf der letzten Folie abzubilden. Diese Mapping-Aufgabe ist nicht trivial, aber ArrayNinja erleichtert diesen Schritt durch die Bereitstellung einer Plattenkarte. Abweichungen zu dieser Karte bei der Erstellung der Quellplatten führen zu falschen Schlussfolgerungen während der Analyse.
Es ist wichtig, die Einschränkungen der Verwendung von Mikroarrays für die Analyse der Antikörperspezifität zu berücksichtigen. Während auf der Array-Off-Ziel-Histon-PTM-Antikörper-Eigenschaften gezeigt wurden, dass sie mit ähnlichen Hybridisierungsbedingungen ( z. B. Immunoblot) 17 , 18 in experimentelle Ansätze umgesetzt werden, ist das Ausmaß, in dem die Array-basierte Profilierung der Antikörperspezifität auf ChIP-Protokolle übersetzt wird, suggestiv 14 , 17 aber waRrants mehr kritische auswertung
Variationen zu dieser Pipeline wurden bisher für die Analyse von Histon-Lesern, Schriftstellern und Radierern 23 , 24 beschrieben . Das Ändern dieser Plattform für den Nutzen über die Epigenetikforschung hinaus könnte leicht für jede bedruckbare Bibliothek von Interesse angepasst werden. Es ist auch möglich, dass Material komplexer als Peptide verwendet werden kann, um Mikroarrays für die chromatinbiochemische Forschung zu konstruieren. Zum Beispiel werden rekombinante Nukleosomen, die verschiedene PTMs zeigen, nun routinemäßig in der Laborumgebung 48 erzeugt und die Spezifität der Histon-PTM-Antikörper im Rahmen dieser physiologisch relevanten Chromatin-Untereinheit wird ein spannender Bereich der zukünftigen Studie sein.
Ein weit verbreiteter alternativer Ansatz für das hier beschriebene Protokoll nutzt die SPOT-Array-Technologie, bei der Hunderte von Peptiden direkt auf einer Cellu synthetisiert werdenDen Membranträger 49 verlieren. Die Membran selbst kann dann für Mikroarrayanwendungen 50 verwendet werden . Die SPOT-Technologie ist vom Standpunkt der Bibliothekskomplexität und der Synthesekosten aus vorteilhaft. Es wurde jedoch berichtet, dass die Reinheit der nach dem SPOT-Verfahren synthetisierten Peptide variiert und die Qualitätskontroll- und Reinigungsmaßnahmen, die der Festphasen-Peptidsynthese gemeinsam sind ( z. B. HPLC und Massenspektrometrie), werden nicht routinemäßig durchgeführt 50 , 51 . Zusätzlich ist die Peptidpräsentation auf Nitrocellulose nicht gleichmäßig und kann Epitope abschirmen. Bemerkenswerterweise sind beide Arten von Histon-Peptid-Array-Plattformen kommerziell für Benutzer verfügbar, die keinen Zugriff auf die spezialisierte Ausrüstung haben, die zur Synthese von Peptiden und Herstellung von Arrays benötigt wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil vom Van Andel Research Institute und einem Forschungsstipendium der National Institutes of Health (CA181343) an SBR unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
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