Summary
伝統的なスラブゲル電気泳動（SGE）実験は、複雑な装置および高い化学消費を必要とする。この研究は、短い時間枠内でDNA断片を分離する低コストの方法を記載したプロトコールを提示する。
Abstract
スラブゲル電気泳動（SGE）は、DNAフラグメントの分離のための最も一般的な方法である;生物学などの分野に広く応用されている。しかし、従来のSGEプロトコルは非常に面倒であり、実験には長い時間がかかります。さらに、SGE実験における化学消費は非常に高い。この研究は、SGEチップに基づくDNA断片の分離のための簡単な方法を提案する。チップは彫刻機で作られています。 2つのプラスチックシートが、光信号の励起波長および発光波長に対して使用される。 DNAバンドの蛍光シグナルはスマートフォンで収集されます。この方法を検証するために、50,100および1,000bpのDNAラダーを分離した。この結果は、この方法を使用する場合、従来のSGE法の理想的な代替物であることを示しており、5,000bpより小さいDNAラダーが12分以内に高分解能で分離できることを示している。
Introduction
スラブゲル電気泳動（SGE）は、DNA断片分離1,2,3,4,5に最も有効な方法であり、生化学的および生物学的分析における多目的ツールであると考えられている6,7,8。しかし、多くの実験では、SGEが以下の4つの問題によって制限されていることが示されている。（1）分離に数時間および数日かかる。 （2）化学消費量が非常に高い。 （3）複雑な装置（ 例えば、 2D電気泳動セル、電気泳動電源、およびゲルイメージングシステム）を必要とする。 （4）ゲルイメージングシステムは、実験が終了したときにのみ、分離されたDNA断片を観察することができる。さらに、SGE9で一般的に使用されている臭化エチジウム（EtBr）は、突然変異原性であり、発癌性である11,12 。従って、EtBrを含むゲルを手渡すときは常に手袋を着用しなければならない。
キャピラリー電気泳動（CE）には、自動操作、短時間の分離、低消費など、SGEと比較して13,14,15,16,17の利点があります。しかし、CE機器は非常に高価です。従って、これらの制限を克服するために、DNAの分離のためのシステムが開発されている（ 図1 ）。このようなシステムは、化学物質の消費を大幅に削減し、SGE実験時間（8分未満）を節約するだけでなく、スマートフォンによるアガロースゲル中のDNA分離プロセスのリアルタイム追跡も行うことができる。このプロトコルに記載されている手順に従って、SGEチップの設計と製作、チップ内でのアガロースゲルの調製、スマートフォンによるシンプルなSGEシステムのセットアップ、アガロースゲルへのDNAマイグレーションプロセスの記録が可能です。
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Protocol
1. SGEチップの基本設計
- ポリメタクリル酸メチル（PMMA）やポリカーボネートなどの透明プラスチックを使用してください。
注：SGEチップは図1Bに示されています。 SGEチップは、TBEバッファー用の円筒状の穴と、DNA分離用のチャンネルと、電極用の穴に沿って埋め込まれた2つのレーンとからなる。 - レーザー彫刻機を使用して、PMMAブロック内のSGEチャネルのアレイを製作します。
注：チップの幾何学的パラメータは、分離されるべきDNAのサイズに依存する。例えば、DNAフラグメントが1,000bpよりも小さい場合、SGEチップの最適なチャネルパラメータは、2.5mm×4.0mm×90mm（幅×奥行き×長さ）である。 - SGEデザインに基づいて、DNAサンプルをロードするためのチップ内にウェルを作成するために櫛を作製する。
2.アガロースゲルの調製
- 10×TBE（1×TBE =89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA; pH 8.4）および蒸留水を1:19の比で含む。
- 100-bp DNAラダーを分離するために1.0％アガロースゲルを調製する。
注：0.5×TBE緩衝液中のアガロースの濃度は、分離すべきDNA断片のサイズに依存する。 - フラスコに0.1gのアガロースを入れ、0.5x TBE緩衝液10mLを加える。
備考：調製した溶液の容量は、フラスコの容量の1/3未満でなければならない。 - フラスコを保存用フィルムでシールし、次いで、アガロース/緩衝液混合物をマイクロ波（培地、1.0分）中で加熱する。フラスコをマイクロ波に入れる前に、爆発の場合には防腐膜に穴をあけてください。
- 融解したアガロース溶液2.7 mLをSGEチップの4チャンネルに注ぎます。櫛をアガロース溶液に入れてウェルを作成します。
注：融解したアガロース溶液は、室温で3分後にゲル状態に冷却される。 - gから櫛を取り除くゲルを覆うため0.9mLの0.5×TBE緩衝液を添加する。
3. SGEチップにおける電気泳動の実行
- LED光源を点灯させ、425〜505 nmのバンドパスフィルターを光源の上に置きます。
- ボルテックス装置を用いて14.4μLの100 bp DNAラダーと1.6μLのSYBR Greenを混合する。
- 4μLの混合液をSGEチップのアガロースゲルの各ウェルにロードします（ 図2 ）。
- 電極をSGEチップの2つのレーンに入れます。
- SGEチップの上に550〜700 nmのバンドパスフィルタを配置します。
- 電源を入れます。電圧は180V（20V / cm）に設定してください。スマートフォンをオンにしてDNA断片分離プロセスを記録します（ 図3 ）。
- 10分後に電気泳動が終了したら、電源とLEDライトをオフにします。
- SGEチップを清掃してください。
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Representative Results
図4 、 図5および図6は、 50,100および1,000bpのDNAラダーのゲル電気泳動後の典型的な結果を表す。実験後、DNA断片は十分に分離されていた。さらに、同じサンプルをSGEチップの4チャンネルで分離したところ、同じサイズのDNA断片が各実験において同じ距離を移動することが示された。
DNAラダーの分離性能は、移動距離とDNAサイズの対数の関係を分析することによって評価することができる。したがって、未知のDNA断片のサイズの計算にSGEを適用することができる。 図3において、DNAサイズが700bpより小さい場合、移動距離はDNAサイズの対数に直線的に関連することが見出された。
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図1 ：回路 図 と画像。 （ A ）リアルタイム追跡DNA分離システムの概略図。これは、光源、光学フィルタ、およびCGEチップとしてのLEDアレイを含む。スマートフォンはDNA移行プロセスを記録することができます。 （ B ）SGEチップ。 （ C ）電気泳動のために組み立てられた装置。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：ゲルを載せる学生。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図3 ：スマートフォンでの移行を記録している学生。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4 ：SGEチップ上の50-bp DNAラダーの分離。 SGEチップのチャネルの幾何学的パラメータは、2.5mm×4.0mm×90mm（幅×長さ×長さ）である。分離電圧は120Vです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5 ：SGEチップ上の100-bp DNAラダーの分離。 gSGEチップ内のチャネルのエロメトリックパラメータは、2.5mm×4.0mm×90mm（幅×長さ×長さ）である。分離電圧は120Vです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6 ：SGEチップ上の1000-bp DNAラダーの分離 SGEチップ内のチャネルの幾何学的パラメータは、3.6mm×4.0mm×90mm（幅×長さ×長さ）である。分離電圧は180Vです。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
アガロースゲル電気泳動は、DNA、RNAおよびタンパク質の分離に広く用いられている。この研究は、伝統的なゲル電気泳動プロトコルを置き換える新しい方法を提案している。結果は、50,100,1000bpのDNAラダーが、このように小型の組立装置で良好に分離できることを示している。この方法の大きな利点は、化学的消費の少ない核酸を分離できるだけでなく、分離プロセスも記録できることである。 図2ではDNA断片が広く見えますが、SGEチップのパラメータとアガロースゲルの濃度を最適化することで結果を改善できます。さらに、チップ内でプレキャストゲルを使用する場合、SGEプロセスの総量は10分を超えません。
チップ内のチャネル幅を変更すると、DNAラダーの分離性能が大きく異なる。例えば、1000 bpのDNAラダーを分離すると、DNAバンドはチャネルの幅は小さい。これはおそらく、アガロースゲル中のジュール加熱が非常に高く、分離性能に影響を及ぼすためである。
ここで提案されているSGE法は非常に簡単です。システムが最適化されている場合、ポータブルミニSGEデバイスを開発できます。このような装置は、ポイントオブケア実験室試験に適用することができる。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
中国国立自然科学財団（No 21205078）と中国高等教育博士号プログラム（No.20123120110002）の支援を感謝します。この研究は、中国の国家主要研究開発計画（2016YFB1102303）、中国の国家基礎研究計画（973プログラム2015CB352001）、および中国国立自然科学財団（61378060）によって部分的に支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
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