Summary
Traditionelle slabelelektroforese (SGE) eksperimenter kræver et kompliceret apparat og et højt kemisk forbrug. Dette arbejde præsenterer en protokol, der beskriver en billig metode til at adskille DNA-fragmenter inden for en kort tidsramme.
Abstract
Slabelelektroforese (SGE) er den mest almindelige metode til separering af DNA-fragmenter; Det er således bredt anvendt til biologi og andre. Den traditionelle SGE-protokol er dog ret kedelig, og eksperimentet tager lang tid. Desuden er det kemiske forbrug i SGE-forsøg meget højt. Dette arbejde foreslår en simpel metode til adskillelse af DNA-fragmenter baseret på en SGE-chip. Chippen er lavet af en gravemaskine. To plastikplader anvendes til excitations- og emissionsbølgelængderne af det optiske signal. Fluorescenssignalet fra DNA-båndene opsamles af smartphone. For at validere denne metode blev 50, 100 og 1000 bp DNA-stiger adskilt. Resultaterne viser, at en DNA-stige mindre end 5.000 bp kan løses inden for 12 minutter og med høj opløsning ved brug af denne metode, hvilket indikerer, at det er en ideel erstatning for den traditionelle SGE-metode.
Introduction
Slabelelektroforese (SGE) er den mest effektive metode til separation af DNA fra 1 , 2 , 3 , 4 , 5 og anses således for et alsidigt redskab i biokemiske og biologiske analyser 6 , 7 , 8 . Mange eksperimenter indikerer imidlertid, at SGE er begrænset af følgende fire problemer: (1) separationerne tager mange timer og lige dage; (2) det kemiske forbrug er meget højt; (3) det kræver et kompliceret apparat ( f.eks. 2D elektroforese celle, elektroforese strømforsyning og gel billeddannelse system); (4) gel-billeddannelsessystemet kan kun observere de adskilte DNA-fragmenter, når eksperimentet er afsluttet. Desuden er ethidiumbromid (EtBr), som almindeligvis anvendes i SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, er mutagent og cancerogen 11 , 12 . Handsker bør således altid bæres, når der afsættes geler, der indeholder EtBr.
Kapillærelektroforese (CE) har mange fordele 13 , 14 , 15 , 16 , 17 i forhold til SGE, såsom automatisk drift, kort adskillelsestid og lavere forbrug. CE-instrumentet er dog ret dyrt. For at overvinde disse begrænsninger er der derfor udviklet et system ( figur 1 ) til separation af DNA. Et sådant system kan ikke kun kraftigt reducere det kemiske forbrug og spare på SGE-eksperimentet (<8 min), men det kan også udføre realtidssporing af DNA-separationsprocessen i agarosegelen ved hjælp af smartphone. Ved at følge de procedurer, der er beskrevet i denne protokol, skal eleverne shouJeg kan designe og fremstille SGE-chip, forberede agarosegelen i chippen, oprette et simpelt SGE-system med en smartphone og registrere DNA-migrationsprocessen i agarosegelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grundlæggende design af SGE Chip
- Brug enhver gennemsigtig plastik, såsom polymethylmethacrylat (PMMA) eller polycarbonat.
Bemærk: SGE-chip'en er vist i figur 1B . SGE-chip består af cylindriske huller til TBE-bufferen, kanaler til DNA-adskillelse, og to baner indlejret langs hullerne for elektroden. - Fremstil arrays af SGE-kanaler i PMMA-blokken ved hjælp af en lasergraveringsmaskin.
Bemærk: Chipens geometriske parametre afhænger af størrelsen af det DNA, der skal separeres. For eksempel er de optimale kanalparametre for SGE-chipet 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredde x dybde x længde), hvis DNA-fragmentet er mindre end 1.000 bp. - På baggrund af SGE-designet fremstilles kamme for at skabe brøndene i chippen for at indlæse DNA-prøven.
2. Fremstilling af agarosegelen
- Forbered 0,5 × TBE ved at blande 10 × TBE (1 × TBE =89 mM Tris, 89 mM borsyre og 2 mM EDTA; PH 8,4) og destilleret vand i et 1:19 forhold.
- Fremstil 1,0% agarosegel til adskillelsen af 100 bp DNA stiger.
Bemærk: Koncentrationen af agarose i 0,5x TBE-buffer er afhængig af størrelserne af de DNA-fragmenter der skal separeres. - Anbring 0,1 g agarose i en kolbe og tilsæt 10 ml 0,5x TBE-buffer.
Bemærk: Volumenet af den tilberedte opløsning skal være mindre end 1/3 af kapaciteten i kolben. - Afsegl kolben med konserveringsfilm og opvarm derefter agarosebufferblandingen i en mikrobølgeovn (medium, 1,0 min). Før du sætter kolben i mikrobølgeovnen, lav nogle huller i konserveringsfilmen i tilfælde af en eksplosion.
- Hæld 2,7 ml smeltet agaroseopløsning i 4 kanaler af SGE-chip. Placer kammen i agaroseopløsningen for at skabe brøndene.
Bemærk: Den smeltede agaroseopløsning afkøles til gelstanden ved stuetemperatur 3 minutter senere. - Fjern kammen fra gEls og tilsæt 0,9 ml 0,5x TBE buffer til at dække gelen.
3. Kørsel af elektroforese i SGE Chip
- Tænd for LED-lyskilden, og læg et båndpasfilter på 425 til 505 nm over lyskilden.
- Bland 14,4 μL af en 100 bp DNA-stige og 1,6 μL SYBR Green ved hjælp af en hvirvelstrøm.
- Indsæt 4 μl blanding i hver brønd i agarosegelen i SGE-chipet ( figur 2 ).
- Sæt elektroden ind i SGE-chipets to baner.
- Placer et båndpasfilter på 550 til 700 nm over SGE-brikken.
- Tænd for strømkilden. Indstil den elektriske spænding til 180 V (20 V / cm). Tænd for smartphone for at registrere DNA-fragmenteparationsprocessen ( Figur 3 ).
- Når elektroforese er færdig 10 minutter senere, skal du slukke for strømkilden og LED-lampen.
- Rens SGE chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 , Figur 5 , og Figur 6 repræsenterer et typisk resultat efter gelelektroforese på 50, 100 og 1.000 bp DNA-stiger. Efter eksperimentet blev DNA-fragmenterne fraskilt. Desuden blev de samme prøver adskilt i SGE-chipets 4 kanaler, hvilket viser, at DNA-fragmenter af samme størrelse bevæger sig i samme afstand i hvert forsøg.
Separationspræstationen af DNA-stigen kan evalueres ved at analysere forholdet mellem migrationsafstanden og logaritmen for DNA-størrelse; SGE kan således anvendes til beregning af størrelsen af ukendte DNA-fragmenter. I figur 3 blev det konstateret, at migrationsafstanden er lineært relateret til logaritmen af DNA-størrelse, når DNA-størrelsen er mindre end 700 bp.
Jpg "/>
Figur 1 : Skematisk og billeder. ( A ) Et skematisk diagram af det real-time tracking DNA separationssystem. Det omfatter LED-arrayet som lyskilde, det optiske filter og CGE-chip. Smartphone'en kan registrere DNA-migrationsprocessen. ( B ) SGE-chip. ( C ) Enheden monteret til elektroforese. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : En elev indlæser gelen. Klik her for at se en større version af denne figur.
5926fig3.jpg "/>
Figur 3 : En studerende optager migreringen på en smartphone. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Separation af 50-bp DNA stiger på SGE chip. De geometriske parametre for kanalen i SGE-chip er 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredde x dybde x længde). Separationsspændingen er 120 V. Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 5 : Separation af 100 bp DNA stiger på SGE chip. GEmetriske parametre for kanalen i SGE-chip er 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredde x dybde x længde). Separationsspændingen er 120 V. Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 6 : Separation af 1000-bp DNA stiger på SGE chip. De geometriske parametre for kanalen i SGE-chip er 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredde x dybde x længde). Separationsspændingen er 180 V. Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Agarosegelelektroforese anvendes i vid udstrækning til separationen af DNA, RNA og protein. Dette arbejde foreslår en ny metode til at erstatte den traditionelle gelelektroforese protokol. Resultater viser, at 50, 100 og 1000 bp DNA stiger kan adskilles godt i en sådan lille samlet enhed. Den store fordel ved denne metode er, at den ikke alene kan adskille nucleinsyrerne med lidt kemisk forbrug, men det kan også registrere separationsprocessen. Selvom DNA-fragmenterne ser bredt ud i figur 2 , kan resultaterne forbedres ved at optimere parametrene for SGE-chip og koncentrationen af agarosegelen. Desuden tager den samlede SGE-proces ikke mere end 10 minutter, hvis der anvendes præ-gelerede geler i chippen.
Separationspræstationen af DNA-stigen er helt anderledes, hvis kanalbredden i chippen ændres. For eksempel, når en 1000-bp DNA-stige adskilles, ser DNA-båndet større ud, hvisBredden af kanalen er lille. Dette skyldes muligvis, at jouleopvarmning i agarosegelen er meget høj 18 , hvilket påvirker separationsydelsen.
Den SGE-metode, der foreslås her, er meget enkel. En bærbar mini-SGE-enhed kan udvikles, hvis systemet er optimeret. En sådan anordning kan anvendes til laboratorieforsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæres.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt støtte fra National Natural Science Foundation of China (nr. 21205078) og forskningsfonden for Ph.d.-uddannelsen i Kina (No.20123120110002). Dette arbejde blev delvist støttet af Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2016YFB1102303), Kinas nationale grundforskningsprogram (973Program; 2015CB352001) og National Natural Science Foundation of China (61378060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
