Summary
Traditionelle Plattengelelektrophorese (SGE) Experimente erfordern eine komplizierte Apparatur und einen hohen chemischen Verbrauch. Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, das eine kostengünstige Methode zur Trennung von DNA-Fragmenten innerhalb eines kurzen Zeitrahmens beschreibt.
Abstract
Die Plattengelelektrophorese (SGE) ist die häufigste Methode zur Trennung von DNA-Fragmenten; So wird es weitgehend auf das Gebiet der Biologie und andere angewendet. Allerdings ist das traditionelle SGE-Protokoll ziemlich langweilig, und das Experiment dauert lange. Darüber hinaus ist der Chemikalienverbrauch bei SGE-Experimenten sehr hoch. Diese Arbeit schlägt eine einfache Methode zur Trennung von DNA-Fragmenten auf Basis eines SGE-Chips vor. Der Chip wird von einer Graviermaschine hergestellt. Für die Anregungs- und Emissionswellenlängen des optischen Signals werden zwei Kunststoffplatten verwendet. Das Fluoreszenzsignal der DNA-Banden wird vom Smartphone gesammelt. Um diese Methode zu validieren, wurden 50, 100 und 1000 bp DNA-Leitern getrennt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine DNA-Leiter kleiner als 5.000 bp innerhalb von 12 min aufgelöst werden kann und mit hoher Auflösung bei der Verwendung dieser Methode, was darauf hinweist, dass es ein idealer Ersatz für die traditionelle SGE-Methode ist.
Introduction
Die Plattengelelektrophorese (SGE) ist die effektivste Methode für die DNA-Fragmenttrennung 1 , 2 , 3 , 4 , 5 und gilt somit als vielseitiges Werkzeug in biochemischen und biologischen Analysen 6 , 7 , 8 . Allerdings zeigen viele Experimente, dass SGE durch die folgenden vier Probleme eingeschränkt wird: (1) die Trennungen dauern viele Stunden und sogar Tage; (2) der chemische verbrauch ist sehr hoch; (3) es erfordert eine komplizierte Apparatur ( z. B. 2D-Elektrophoresezelle, Elektrophorese-Stromversorgung und Gelbildgebungssystem); (4) Das Gelbildgebungssystem kann nur die abgetrennten DNA-Fragmente beobachten, wenn das Experiment beendet ist. Weiterhin wird Ethidiumbromid (EtBr), das üblicherweise in SGE 9 verwendet wird ,Ass = "xref"> 10, ist mutagen und krebserregend 11 , 12 . So sollten Handschuhe bei der Übergabe von Gele mit EtBr getragen werden.
Die Kapillarelektrophorese (CE) hat zahlreiche Vorteile 13 , 14 , 15 , 16 , 17 im Vergleich zu SGE, wie z. B. automatischer Betrieb, kurze Trennzeit und geringeren Verbrauch. Allerdings ist das CE-Instrument ziemlich teuer. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde daher ein System entwickelt (Abbildung 1 ) für die Trennung von DNA. Ein solches System kann den Chemikalienverbrauch nicht nur stark reduzieren und die SGE-Experimentierzeit (<8 min) speichern, sondern auch eine Echtzeit-Verfolgung des DNA-Trennprozesses im Agarosegel durch Smartphone durchführen. Durch die folgenden Verfahren in diesem Protokoll, Studenten schreienLd in der Lage sein, den SGE-Chip zu entwerfen und zu fertigen, das Agarosegel im Chip vorzubereiten, ein einfaches SGE-System mit einem Smartphone aufzustellen und den DNA-Migrationsprozess im Agarosegel aufzuzeichnen.
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Protocol
1. Grunddesign des SGE-Chips
- Verwenden Sie jeden transparenten Kunststoff, wie Polymethylmethacrylat (PMMA) oder Polycarbonat.
Hinweis: Der SGE-Chip ist in Abbildung 1B dargestellt. Der SGE-Chip besteht aus zylindrischen Löchern für den TBE-Puffer, Kanäle für die DNA-Trennung und zwei Bahnen, die entlang der Löcher für die Elektrode eingebettet sind. - Fertigungsarrays von SGE-Kanälen im PMMA-Block mit einer Lasergravurmaschine.
Anmerkung: Die geometrischen Parameter des Chips hängen von der Größe der zu trennenden DNA ab. Zum Beispiel sind die optimalen Kanalparameter für den SGE-Chip 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (Breite x Tiefe x Länge), wenn das DNA-Fragment kleiner als 1000 bp ist. - Basierend auf dem SGE-Design, fertigen Kämme, um die Brunnen im Chip zum Laden der DNA-Probe zu erstellen.
2. Vorbereitung des Agarosegels
- Vorbereiten von 0,5 × TBE durch Mischen von 10 × TBE (1 × TBE =89 mM Tris, 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA; PH 8,4) und destilliertem Wasser im Verhältnis 1:19
- Vorbereitung 1,0% Agarose Gel für die Trennung von 100-bp DNA-Leitern.
Anmerkung: Die Konzentration der Agarose in 0,5x TBE-Puffer hängt von den Größen der zu trennenden DNA-Fragmente ab. - Setzen Sie 0,1 g Agarose in einen Kolben und fügen Sie 10 ml 0,5x TBE-Puffer hinzu.
Hinweis: Das Volumen der vorbereiteten Lösung sollte weniger als 1/3 der Kapazität des Kolbens betragen. - Den Kolben mit Konservierungsfilm abdichten und dann die Agarose / Puffermischung in einer Mikrowelle (Medium, 1,0 min) erhitzen. Vor dem Einsetzen der Flasche in die Mikrowelle, machen einige Löcher in der Konservierungsfolie im Falle einer Explosion.
- Gießen Sie 2,7 ml geschmolzene Agarose-Lösung in 4 Kanäle des SGE-Chips. Legen Sie den Kamm in die Agarose-Lösung, um die Brunnen zu schaffen.
Hinweis: Die geschmolzene Agarose-Lösung wird bei Raumtemperatur 3 min später auf den Gelzustand abkühlen gelassen. - Den Kamm aus der G entfernenEls und füge 0,9 ml 0,5x TBE-Puffer hinzu, um das Gel zu bedecken.
3. Die Elektrophorese im SGE-Chip durchführen
- Schalten Sie die LED-Lichtquelle ein und legen Sie einen 425 bis 505 nm Bandpassfilter über die Lichtquelle.
- Mischen Sie 14,4 μl einer 100 bp DNA-Leiter und 1,6 μl SYBR Green mit einem Vortexer.
- 4 μl Mischung in jede Vertiefung des Agarosegels im SGE-Chip geben ( Abbildung 2 ).
- Setzen Sie die Elektrode in die beiden Bahnen des SGE-Chips.
- Legen Sie einen 550 bis 700 nm Bandpassfilter über den SGE-Chip.
- Schalten Sie die Stromquelle ein. Stellen Sie die elektrische Spannung auf 180 V (20 V / cm) ein. Schalte das Smartphone ein, um den DNA-Fragment-Trennprozess aufzuzeichnen (Abbildung 3 ).
- Wenn die Elektrophorese 10 min später beendet ist, schalten Sie die Stromquelle und das LED-Licht aus.
- Reinigen Sie den SGE-Chip.
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Representative Results
Fig. 4 , Fig. 5 und Fig. 6 stellen ein typisches Ergebnis nach der Gelelektrophorese von 50, 100 und 1000 bp DNA-Leitern dar. Nach dem Experiment waren die DNA-Fragmente gut getrennt. Weiterhin wurden die gleichen Proben in den 4 Kanälen des SGE-Chips getrennt, was zeigt, dass DNA-Fragmente gleicher Größe in jedem Experiment den gleichen Abstand bewegen.
Die Trennleistung der DNA-Leiter kann durch Analysieren der Beziehung der Migrationsdistanz und des Logarithmus der DNA-Größe ausgewertet werden; Somit kann SGE auf die Berechnung der Grße unbekannter DNA-Fragmente angewendet werden. In Fig. 3 wurde festgestellt, daß der Migrationsabstand linear mit dem Logarithmus der DNA-Grße zusammenhängt, wenn die DNA-Grße kleiner als 700 bp ist.
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Abbildung 1 : Schematische und Bilder. ( A ) Ein schematisches Diagramm des Echtzeit-Tracking-DNA-Trennsystems. Es enthält das LED-Array als Lichtquelle, das optische Filter und den CGE-Chip. Das Smartphone kann den DNA-Migrationsprozess aufzeichnen. ( B ) Der SGE-Chip ( C ) Das Gerät für die Elektrophorese zusammengebaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Ein Schüler lädt das Gel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3 : Ein Schüler, der die Migration auf einem Smartphone aufzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : Trennung von 50-bp-DNA-Leitern auf den SGE-Chip. Die geometrischen Parameter für den Kanal im SGE-Chip sind 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (Breite x Tiefe x Länge). Die Trennspannung beträgt 120 V. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5 : Trennung von 100-bp-DNA-Leitern auf den SGE-Chip. Die gEometrische Parameter für den Kanal im SGE-Chip sind 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (Breite x Tiefe x Länge). Die Trennspannung beträgt 120 V. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6 : Trennung von 1000-bp-DNA-Leitern auf den SGE-Chip Die geometrischen Parameter für den Kanal im SGE-Chip sind 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (Breite x Tiefe x Länge). Die Trennspannung beträgt 180 V. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Agarose-Gelelektrophorese wird weithin für die Trennung von DNA, RNA und Protein eingesetzt. Diese Arbeit schlägt eine neue Methode vor, um das traditionelle Gelelektrophoreseprotokoll zu ersetzen. Die Ergebnisse zeigen, dass 50, 100 und 1000 bp DNA-Leitern in einer so kleinen zusammengebauten Vorrichtung gut getrennt werden können. Der große Vorteil dieser Methode ist, dass man nicht nur die Nukleinsäuren mit wenig chemischem Verbrauch trennen kann, sondern auch den Trennprozess aufzeichnen kann. Obwohl die DNA-Fragmente in Fig. 2 breit aussehen, können die Ergebnisse verbessert werden, indem die Parameter des SGE-Chips und die Konzentration des Agarosegels optimiert werden. Weiterhin dauert der gesamte SGE-Prozess nicht mehr als 10 min, wenn im Chip vorgefertigte Gele verwendet werden.
Die Trennleistung der DNA-Leiter ist ganz anders, wenn die Kanalbreite im Chip geändert wird. Zum Beispiel, wenn eine 1000-bp-DNA-Leiter getrennt ist, sieht die DNA-Band breiter aus, wennDie Breite des Kanals ist klein. Dies liegt möglicherweise daran, dass die Joule-Erwärmung im Agarosegel sehr hoch ist, was die Trennleistung beeinflusst.
Die hier vorgeschlagene SGE-Methode ist sehr einfach. Ein portables Mini-SGE-Gerät kann entwickelt werden, wenn das System optimiert ist. Ein solches Gerät kann auf Point-of-Care Laboruntersuchungen angewendet werden.
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Disclosures
Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.
Acknowledgments
Wir bedanken uns herzlich bei der Unterstützung der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr. 21205078) und des Forschungsfonds für das Doktoratsstudium für Hochschulbildung in China (No.20123120110002). Diese Arbeit wurde teilweise durch das nationale Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm von China (2016YFB1102303), das nationale grundlegende Forschungsprogramm von China (973Programm 2015CB352001) und die nationale natürliche Wissenschafts-Grundlage von China (61378060) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
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