Summary
ג 'ל מסורתי ג' ל אלקטרופורזה (SGE) ניסויים דורשים מנגנון מסובך וצריכה כימית גבוהה. עבודה זו מציגה פרוטוקול המתאר שיטה זולה להפריד שברי DNA בתוך פרק זמן קצר.
Abstract
ג'ל אלקטרופורזה (SGE) היא השיטה הנפוצה ביותר להפרדת שברי דנ"א; ולכן היא מיושמת באופן נרחב על תחום הביולוגיה ואחרים. עם זאת, פרוטוקול SGE המסורתי הוא די מייגע, ואת הניסוי לוקח זמן רב. יתר על כן, צריכת כימי בניסויים SGE הוא גבוה מאוד. עבודה זו מציעה שיטה פשוטה ההפרדה של שברי דנ"א מבוסס על שבב SGE. השבב נעשה על ידי מכונת חריטה. שני סדינים מפלסטיק משמשים את אור גירוי ואת פליטה של האות האופטי. אות הקרינה של להקות ה- DNA נאסף על ידי הטלפון החכם. כדי לאמת את השיטה, מופרדים 50, 100, ו- 1,000 bp DNA סולמות. התוצאות מראות כי סולם DNA קטן מ -5,000 BP ניתן לפתור תוך 12 דקות ועם רזולוציה גבוהה בעת שימוש בשיטה זו, המציין כי היא תחליף אידיאלי לשיטה המסורתית SGE.
Introduction
סלע ג'ל אלקטרופורזה (SGE) היא השיטה היעילה ביותר עבור הפרדת קטע DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ולכן הוא נחשב כלי רב תכליתי ב ביוכימי וביולוגי מנתח 6 , 7 , 8 . עם זאת, ניסויים רבים מצביעים כי SGE מוגבל על ידי ארבע הבעיות הבאות: (1) ההפרדות לוקח שעות רבות, ואפילו ימים; (2) הצריכה הכימית גבוהה מאוד; (3) זה דורש מנגנון מסובך ( למשל, תא אלקטרופורזה 2D, ספק כוח אלקטרופורזה, מערכת ג 'ל הדמיה); (4) מערכת הדמיה ג'ל יכול רק לראות את שברי ה- DNA מופרדים כאשר הניסוי הוא סיים. יתר על כן, ethidium bromide (EtBr), אשר נפוץ ב SGE 9 ,התחת = "xref"> 10, הוא mutagenic ו סרטן 11 , 12 . לכן, כפפות תמיד צריך להיות משוחק כאשר מסירת ג'לים המכילים EtBr.
נימי אלקטרופורזה (CE) יש יתרונות רבים 13 , 14 , 15 , 16 , 17 לעומת SGE, כגון פעולה אוטומטית, זמן ההפרדה קצר, וצריכה נמוכה יותר. עם זאת, מכשיר CE הוא די יקר. לכן, כדי להתגבר על המגבלות הללו, פותחה מערכת ( איור 1 ) להפרדת הדנ"א. מערכת כזו יכולה לא רק לצמצם באופן משמעותי את הצריכה הכימית ולשמור על זמן הניסוי SGE (<8 דקות), אבל זה יכול גם לבצע מעקב בזמן אמת של תהליך ההפרדה DNA ב agarose ג'ל על ידי הטלפון החכם. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, סטודנטים shouיהיה מסוגל לעצב לפברק את שבב SGE, להכין את הג'ל agarose שבב, להקים מערכת פשוטה SGE עם הטלפון החכם, ולתעד את תהליך הגירה דנ"א של agarose ג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב בסיסי של שבב SGE
- השתמש בכל פלסטיק שקוף, כגון polymethylmethacrylate (PMMA) או פוליקרבונט.
הערה: שבב SGE מודגם בתרשים 1B . שבב SGE מורכב חורים גלילי עבור חיץ TBE, ערוצי הפרדת DNA, ושני נתיבים מוטבע לאורך החורים של האלקטרודה. - מייצרים מערכים של ערוצי SGE בלוק PMMA באמצעות לייזר מכונת חריטה.
הערה: הפרמטרים הגיאומטריים של השבב תלויים בגודלו של הדנ"א שיופרדו. לדוגמה, הפרמטרים אופטימלי ערוץ עבור שבב SGE הם 2.5 מ"מ x 4.0 מ"מ x 90 מ"מ (רוחב x עומק x אורך) אם קטע ה- DNA הוא קטן מ 1000 bp. - בהתבסס על עיצוב SGE, לפברק מסרקים כדי ליצור את הבארות שבב לטעינת דגימת DNA.
2. הכנת ג'ל Agarose
- הכן 0.5 × TBE על ידי ערבוב 10 × TBE (1 × TBE =89 מ"מ טריס, 89 מ"מ חומצת בור, ו 2 מ"מ EDTA; PH 8.4) ומים מזוקקים ביחס 1:19.
- הכן ג'ל agarose 1.0% עבור ההפרדה של סולמות DNA 100-BP.
הערה: ריכוז agarose במאגר TBE 0.5x תלוי בגדלים של שברי ה- DNA להיות מופרדים. - מקום 0.1 גרם של agarose לתוך בקבוק להוסיף 10 מ"ל של חיץ TBE 0.5x.
הערה: נפח הפתרון מוכן צריך להיות פחות מ 1/3 קיבולת של הבקבוק. - חותם את הבקבוק עם סרט משמר ולאחר מכן לחמם את תערובת agarose / חיץ במיקרוגל (בינוני, 1.0 דקות). לפני לשים את הבקבוק לתוך המיקרוגל, לעשות כמה חורים בסרט המשמר במקרה של פיצוץ.
- יוצקים 2.7 מ"ל של תמיסת agarose מומס לתוך 4 ערוצים של שבב SGE. מניחים את המסרק לתוך פתרון agarose כדי ליצור את הבארות.
הערה: הפתרון agarose נמס יהיה להתקרר למצב ג'ל בטמפרטורת החדר 3 דקות מאוחר יותר. - הסר את המסרק מ gEls להוסיף 0.9 מ"ל של חיץ TBE 0.5x כדי לכסות את הג'ל.
3. הפעלת אלקטרופורזה ב SGE שבב
- הפעל את מקור האור LED ו במקום 425 ל 505 ננומטר bandpass מסנן מעל מקור האור.
- מערבבים 14.4 μL של סולם DNA 100 BP ו 1.6 μL של SYBR גרין באמצעות וורטקסר.
- טען 4 μL של תערובת לתוך כל טוב של ג'ל agarose שבב SGE ( איור 2 ).
- שים את האלקטרודה לתוך שני נתיבים של שבב SGE.
- מניחים 550 עד 700 ננומטר bandpass מסנן מעל שבב SGE.
- הפעל את מקור המתח. הגדר את המתח החשמלי ל - 180 וולט (20 V / cm). הפעל את הטלפון החכם כדי להקליט את תהליך הפרדת דנ"א קטע ( איור 3 ).
- כאשר אלקטרופורזה הוא סיים 10 דקות מאוחר יותר, לכבות את מקור החשמל ואת האור LED.
- נקה את שבב SGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 4 , איור 5 , ואת איור 6 מייצגים תוצאה אופיינית לאחר ג'ל אלקטרופורזה של 50, 100, ו 1000 bp DNA סולמות. לאחר הניסוי, שברי הדנ"א היו מופרדים היטב. יתר על כן, דגימות אותו הופרדו 4 ערוצים של שבב SGE, מראה כי שברי DNA של אותו גודל לנוע באותו מרחק בכל ניסוי.
ביצועי ההפרדה של סולם הדנ"א ניתנים להערכה על ידי ניתוח הקשר בין מרחק ההגירה לבין הלוגריתם של גודל הדנ"א; ולכן, SGE ניתן להחיל על חישוב בגודל של שברי DNA ידוע. באיור 3 , נמצא כי מרחק ההגירה קשור באופן ליניארי לוגריתם של גודל הדנ"א כאשר גודל ה- DNA קטן מ -700 bp.
Jpg "/>
איור 1 : סכמטי ותמונות. ( א ) דיאגרמה סכמטית של מעקב בזמן אמת מערכת ה- DNA ההפרדה. הוא כולל את מערך LED כמקור האור, את המסנן האופטי, ואת שבב CGE. הטלפון החכם יכול להקליט את תהליך הגירה דנ"א. ( ב ) שבב SGE. ( ג ) המכשיר התרכב עבור אלקטרופורזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : סטודנט טוען את הג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
5926fig3.jpg "/>
איור 3 : תלמיד הקליט את ההעברה בטלפון חכם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : הפרדת סולמות DNA 50-BP על שבב SGE. הפרמטרים הגיאומטריים עבור הערוץ שבב SGE הם 2.5 מ"מ x 4.0 מ"מ x 90 מ"מ (רוחב x עומק x אורך). מתח ההפרדה הוא 120 V. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 : הפרדת סולמות 100-BP DNA על שבב SGE. Gפרמטרים eometric עבור הערוץ שבב SGE הם 2.5 מ"מ x 4.0 מ"מ x 90 מ"מ (רוחב x עומק x אורך). מתח ההפרדה הוא 120 V. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6 : הפרדה של 1000-BP סולמות DNA על שבב SGE. הפרמטרים הגיאומטריים עבור הערוץ שבב SGE הם 3.6 מ"מ x 4.0 מ"מ x 90 מ"מ (רוחב x עומק x אורך). מתח ההפרדה הוא 180 V. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Agarose ג'ל אלקטרופורזה מועסק נרחב עבור הפרדת DNA, RNA, וחלבון. עבודה זו מציעה שיטה חדשה להחליף את פרוטוקול אלקטרופורזה ג'ל המסורתית. תוצאות מדגימות כי 50, 100, ו 1000 bp סולמות DNA ניתן להפריד היטב כזה מכשיר קטן התאספו. היתרון הגדול של שיטה זו הוא כי לא רק זה יכול להפריד בין חומצות גרעין עם צריכת כימי קטן, אבל זה יכול גם להקליט את תהליך ההפרדה. למרות שברי דנ"א נראה רחב באיור 2 , התוצאות ניתן לשפר על ידי אופטימיזציה של הפרמטרים של שבב SGE ואת הריכוז של agarose ג'ל. יתר על כן, תהליך SGE סך לוקח לא יותר מ 10 דקות אם ג'ל precast משמשים שבב.
הפרדת הביצועים של סולם ה- DNA שונה למדי אם רוחב הערוץ שבב משתנה. לדוגמה, כאשר מופרד סולם DNA של 1,000-bp, רצועת ה- DNA נראית רחבה יותר אםרוחב הערוץ קטן. זה אולי בגלל חימום ג 'אול ב agarose ג'ל הוא גבוה מאוד 18 , אשר משפיע על הביצועים ההפרדה.
שיטת SGE המוצעת כאן היא פשוטה מאוד. מכשיר נייד מיני SGE ניתן לפתח אם המערכת היא אופטימיזציה. מכשיר כזה יכול להיות מיושם על בדיקות מעבדה של נקודת טיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
שום ניגוד אינטרסים לא הוכרז.
Acknowledgments
אנו מודים בהכרת תודה לתמיכה של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '21205078) וקרן המחקר לתכנית הדוקטורט להשכלה גבוהה של סין (No.20123120110002). עבודה זו נתמכה חלקית על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח של סין (2016YFB1102303), התוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (973Program, 2015CB352001), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (61378060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
