Summary
Traditionella slabgelelektrofores (SGE) -experiment kräver en komplicerad apparat och hög kemisk förbrukning. Detta arbete presenterar ett protokoll som beskriver en billig metod för att separera DNA-fragment inom en kort tidsram.
Abstract
Slabelelektrofores (SGE) är den vanligaste metoden för separation av DNA-fragment; Därför tillämpas den i stor utsträckning på biologins och andra områden. Det traditionella SGE-protokollet är dock ganska tråkigt, och experimentet tar lång tid. Dessutom är den kemiska förbrukningen i SGEU-experiment mycket hög. Detta arbete föreslår en enkel metod för separation av DNA-fragment baserat på en SGE-chip. Chipet är tillverkat av en gravyrmaskin. Två plastplåtar används för excitations- och utsläppsvåglängderna hos den optiska signalen. Fluorescenssignalen hos DNA-banden samlas in av smartphone. För att validera denna metod separerades 50, 100 och 1000 bp DNA-stegar. Resultaten visar att en DNA-stege mindre än 5000 bp kan lösas inom 12 minuter och med hög upplösning vid användning av denna metod, vilket indikerar att det är en idealisk ersättning för den traditionella SGE-metoden.
Introduction
Slabelelektrofores (SGE) är den mest effektiva metoden för DNA-fragment separation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 och anses därför vara ett mångsidigt verktyg i biokemiska och biologiska analyser 6 , 7 , 8 . Många experiment tyder emellertid på att SGE begränsas av följande fyra problem: (1) separationerna tar många timmar och jämn dagar; (2) den kemiska förbrukningen är mycket hög; (3) det kräver en komplicerad apparat ( t.ex. 2D elektroforescell, elektrofores strömförsörjning och gelbilds-system); (4) gelbilds-systemet kan endast observera de separerade DNA-fragmenten när experimentet är avslutat. Vidare används etidiumbromid (EtBr), som vanligen används i SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, är mutagen och cancerogen 11 , 12 . Därför bör handskar alltid bäras när man levererar geler som innehåller EtBr.
Kapillärelektrofores (CE) har många fördelar 13 , 14 , 15 , 16 , 17 jämfört med SGE, såsom automatisk drift, kort separationstid och lägre förbrukning. Emellertid är CE-instrumentet ganska dyrt. För att övervinna dessa begränsningar har därför ett system utvecklats ( Figur 1 ) för separation av DNA. Ett sådant system kan inte bara kraftigt minska den kemiska konsumtionen och spara på SGE-experimentstid (<8 min), men det kan också utföra realtidsspårning av DNA-separationsprocessen i agarosgelen via smartphone. Genom att följa de procedurer som beskrivs i detta protokoll ska studenternaLd kunna designa och tillverka SGE-chipet, förbereda agarosgelen i chipet, skapa ett enkelt SGE-system med en smartphone och registrera DNA-migreringsprocessen i agarosgelén.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grundläggande utformning av SGE-chipet
- Använd någon transparent plast, såsom polymetylmetakrylat (PMMA) eller polykarbonat.
Obs! SGE-chipet visas i Figur 1B . SGE-chipet består av cylindriska hål för TBE-bufferten, kanaler för DNA-separation, och två banor inbäddade längs hålen för elektroden. - Sätta upp arrays av SGE-kanaler i PMMA-blocket med hjälp av en lasergraveringsmaskin.
Obs! Chipens geometriska parametrar är beroende av storleken på det DNA som ska separeras. De optimala kanalparametrarna för SGE-chipet är till exempel 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredd x djup x längd) om DNA-fragmentet är mindre än 1000 bp. - Baserat på SGE-designen, tillverkar kammar för att skapa brunnarna i chipet för att ladda DNA-provet.
2. Framställning av agarosgelén
- Förbered 0,5 × TBE genom att blanda 10 × TBE (1 × TBE =89 mM Tris, 89 mM borsyra och 2 mM EDTA; PH 8,4) och destillerat vatten i ett 1:19 förhållande.
- Förbered 1,0% agarosgel för separation av 100-bp DNA-stegrar.
Anm .: Koncentrationen av agaros i 0,5x TBE-buffert är beroende av storleken på DNA-fragmenten som skall separeras. - Placera 0,1 g agaros i en flaska och tillsätt 10 ml 0,5x TBE-buffert.
Anm .: Volymen av den beredda lösningen ska vara mindre än 1/3 av kolvens kapacitet. - Täta kolven med konserveringsfilm och värm sedan agaros / buffertblandningen i en mikrovågsugn (medium, 1,0 min). Innan kolven sätts in i mikrovågsugnen, gör några hål i konserveringsfilmen vid explosion.
- Häll 2,7 mL smält agaroslösning i 4 kanaler i SGE-chipet. Placera kammen i agaroslösningen för att skapa brunnarna.
Anm .: Den smälta agaroslösningen kyles ner till geläget vid rumstemperatur 3 minuter senare. - Ta bort kammen från gEls och tillsätt 0,9 ml 0,5x TBE-buffert för att täcka gelén.
3. Körning av elektroforesen i SGE-chipet
- Slå på LED-ljuskällan och placera ett bandpassfilter på 425 till 505 nm över ljuskällan.
- Blanda 14,4 μL av en 100 bp DNA-stege och 1,6 μL SYBR Green med hjälp av en virvel.
- Ladda 4 μl blandning i varje brunn i agarosgelen i SGE-chipet ( Figur 2 ).
- Sätt elektroden in i de två körfälten i SGE-chipet.
- Placera ett bandpassfilter på 550 till 700 nm över SGE-chipet.
- Slå på strömkällan. Ställ in elspänningen till 180 V (20 V / cm). Slå på smarttelefonen för att registrera DNA-fragmentets separationsprocess ( Figur 3 ).
- När elektroforesen är klar 10 minuter senare, stäng av strömkällan och LED-lampan.
- Rengör SGE-chipet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 , Figur 5 , och Figur 6 representerar ett typiskt resultat efter gelelektrofores av DNA-stegrar på 50, 100 och 1000 bp. Efter experimentet separerades DNA-fragmenten väl. Vidare separerades samma prover i SGE-chipets 4 kanaler, vilket visar att DNA-fragment av samma storlek rör samma avstånd i varje experiment.
Separationsprestandan för DNA-stegen kan utvärderas genom att analysera förhållandet mellan migrationsavståndet och logaritmen för DNA-storlek; SGE kan således appliceras för att beräkna storleken av okända DNA-fragment. I figur 3 visade man att migrationsavståndet är linjärt relaterat till logaritmen för DNA-storlek när DNA-storleken är mindre än 700 bp.
Jpg "/>
Figur 1 : Schematisk och bilder. ( A ) Ett schematiskt diagram över DNA-separationssystemet i realtid. Den innehåller LED-matrisen som ljuskälla, det optiska filtret och CGE-chipet. Smartphone kan registrera DNA-migrationsprocessen. ( B ) SGE-chipet. ( C ) Anordningen monterad för elektrofores. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : En elev laddar gelén. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
5926fig3.jpg "/>
Figur 3 : En student spelar in migreringen på en smartphone. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Separering av 50-bp DNA-stegar på SGE-chipet. De geometriska parametrarna för kanalen i SGE-chipet är 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredd x djup x längd). Separationsspänningen är 120 V. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5 : Separering av 100-bp DNA-stegar på SGE-chipet. GEmetriska parametrar för kanalen i SGE-chipet är 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredd x djup x längd). Separationsspänningen är 120 V. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6 : Separation av 1000-bp DNA-stegar på SGE-chipet. De geometriska parametrarna för kanalen i SGE-chipet är 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredd x djup x längd). Separationsspänningen är 180 V. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Agarosgelelektrofores används i stor utsträckning för separation av DNA, RNA och protein. Detta arbete föreslår en ny metod för att ersätta det traditionella gelelektroforesprotokollet. Resultat visar att 50, 100 och 1000 bp DNA-stegar kan separeras väl i en sådan liten monterad enhet. Den stora fördelen med denna metod är att den inte bara kan separera nukleinsyrorna med liten kemisk konsumtion, men det kan också registrera separationsprocessen. Även om DNA-fragmenten ser brett ut i figur 2 kan resultaten förbättras genom att optimera parametrarna för SGE-chipet och koncentrationen av agarosgelén. Vidare tar den totala SGE-processen inte mer än 10 minuter om förspända geler används i chipet.
DNA-stegens separationsprestanda är helt annorlunda om kanalbredden i chipet ändras. När en DNA-stege med en 1000 bps separeras, ser DNA-bandet vidare ut omKanalens bredd är liten. Detta beror kanske på att jouleuppvärmningen i agarosgelén är mycket hög 18 , vilket påverkar separationsprestanda.
Den SGE-metod som föreslås här är väldigt enkel. En bärbar mini-SGE-enhet kan utvecklas om systemet är optimerat. En sådan anordning kan appliceras på laboratorieundersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklaras.
Acknowledgments
Vi bekräftar tacksamt stöd från National Natural Science Foundation of China (nr 21205078) och forskningsfonden för doktorandprogrammet för högre utbildning i Kina (No.20123120110002). Detta arbete stöddes delvis av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2016YFB1102303), Kinas nationella grundforskningsprogram (973Program, 2015CB352001) och National Natural Science Foundation of China (61378060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
