Summary
传统的平板凝胶电泳（SGE）实验需要复杂的装置和高的化学消耗。这项工作提出了一个协议，描述了一种在短时间内分离DNA片段的低成本方法。
Abstract
板状凝胶电泳（SGE）是分离DNA片段的最常用方法;因此，它广泛应用于生物学等领域。然而，传统的SGE协议相当乏味，实验需要很长时间。此外，SGE实验中的化学消耗量非常高。这项工作提出了一种基于SGE芯片分离DNA片段的简单方法。该芯片由雕刻机制成。两个塑料片用于光信号的激发和发射波长。通过智能手机收集DNA条带的荧光信号。为了验证该方法，分离出50,100和1,000bp DNA梯。结果表明，使用该方法可以在12分钟内解析出小于5,000bp的DNA梯度，分辨率高，表明它是传统SGE方法的理想替代品。
Introduction
板状凝胶电泳（SGE）是DNA片段分离最有效的方法1,2,3,4,5 ，因此被认为是生物化学和生物学分析中的通用工具6,7,8。然而，许多实验表明，SGE受到以下四个问题的限制：（1）分离需要很多小时甚至几天; （2）化学品消耗量非常高; （3）需要复杂的装置（ 例如， 2D电泳池，电泳电源和凝胶成像系统）; （4）实验完成后，凝胶成像系统只能观察分离的DNA片段。此外，SGE 9中通常使用的溴化乙锭（EtBr）ass =“xref”> 10，是致突变性和致癌性11,12 。因此，在装载含有EtBr的凝胶时，应始终佩戴手套。
与SGE相比，毛细管电泳（CE）具有许多优点，如自动操作，分离时间短，消耗量少等优点，13，14，15，16，17。然而，CE仪器相当昂贵。因此，为了克服这些限制，已经开发了一种用于分离DNA的系统（ 图1 ）。这样的系统不仅可以大大降低化学消耗，还可以节省SGE实验时间（<8分钟），而且可以通过智能手机对琼脂糖凝胶中的DNA分离过程进行实时跟踪。按照本协议中描述的程序，学生们可以可以设计和制造SGE芯片，在芯片中制备琼脂糖凝胶，用智能手机设置简单的SGE系统，并将DNA迁移过程记录在琼脂糖凝胶中。
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Protocol
SGE芯片的基本设计
- 使用任何透明塑料，如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）或聚碳酸酯。
注：SGE芯片如图1B所示 。 SGE芯片由用于TBE缓冲器的圆柱形孔，用于DNA分离的通道和沿着电极孔嵌入的两条通道组成。 - 使用激光雕刻机在PMMA块中制造SGE通道阵列。
注意：芯片的几何参数取决于要分离的DNA的大小。例如，如果DNA片段小于1,000bp，则SGE芯片的最佳信道参数为2.5mm×4.0mm×90mm（宽×深×长）。 - 基于SGE设计，制造梳子以在芯片中创建用于加载DNA样品的孔。
2.琼脂糖凝胶的制备
- 通过混合10×TBE（1×TBE =89mM Tris，89mM硼酸和2mM EDTA; pH 8.4）和蒸馏水以1:19的比例。
- 制备1.0％琼脂糖凝胶，分离100-bp DNA梯。
注意：0.5x TBE缓冲液中琼脂糖的浓度取决于要分离的DNA片段的大小。 - 将0.1 g琼脂糖放入烧瓶中，加入10 mL 0.5x TBE缓冲液。
注意：制备溶液的体积应小于烧瓶容量的1/3。 - 用防腐膜密封烧瓶，然后在微波（培养基，1.0分钟）中加热琼脂糖/缓冲液混合物。在将烧瓶放入微波炉之前，在爆炸的情况下，在防腐膜中形成一些孔。
- 将2.7mL熔融的琼脂糖溶液倒入SGE芯片的4个通道。将梳子放入琼脂糖溶液中以形成孔。
注意：3分钟后，熔化的琼脂糖溶液将在室温下冷却至凝胶状态。 - 从g去除梳子并加入0.9mL 0.5x TBE缓冲液以覆盖凝胶。
3.在SGE芯片中运行电泳
- 打开LED光源，并在光源上方放置一条425至505 nm的带通滤光片。
- 使用涡旋器混合14.4μL的100bp DNA梯和1.6μL的SYBR Green。
- 在SGE芯片的琼脂糖凝胶的每个孔中加入4μL混合物（ 图2 ）。
- 将电极放入SGE芯片的两条通道。
- 在SGE芯片上方放置550至700 nm带通滤波器。
- 打开电源。将电压设置为180 V（20 V / cm）。打开智能手机记录DNA片段分离过程（ 图3 ）。
- 电泳10分钟后，关掉电源和LED灯。
- 清洁SGE芯片。
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Representative Results
图4 ， 图5和图6代表了在50,100和1,000bp DNA梯级的凝胶电泳之后的典型结果。实验后，DNA片段分离良好。此外，在SGE芯片的4个通道中分离相同的样品，显示出相同尺寸的DNA片段在每个实验中移动相同的距离。
DNA梯度的分离性能可以通过分析迁移距离与DNA大小对数的关系进行评估;因此，SGE可用于计算未知DNA片段的大小。在图3中 ，发现当DNA大小小于700bp时，迁移距离与DNA大小的对数线性相关。
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图1 ：原理 图 和图像。 （ A ）实时跟踪DNA分离系统的示意图。它包括作为光源的LED阵列，光学滤波器和CGE芯片。智能手机可以记录DNA迁移过程。 （ B ）SGE芯片。 （ C ）组装电泳装置。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2 ：加载凝胶的学生。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图3 ：在智能手机上记录迁移的学生。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 ：在SGE芯片上分离50-bp DNA梯。 SGE芯片中的通道的几何参数为2.5 mm x 4.0 mm x 90 mm（宽x深x长）。分离电压为120 V. 请点击此处查看此图的较大版本。
图5 ：在SGE芯片上分离100-bp DNA梯。 gSGE芯片中的通道的测量参数为2.5 mm x 4.0 mm x 90 mm（宽x深x长）。分离电压为120 V. 请点击此处查看此图的较大版本。
图6 ：SGE芯片上1,000-bp DNA梯度的分离。 SGE芯片中通道的几何参数为3.6 mm x 4.0 mm x 90 mm（宽x深x长）。分离电压为180 V. 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
琼脂糖凝胶电泳广泛用于分离DNA，RNA和蛋白质。这项工作提出了一种替代传统凝胶电泳方法的新方法。结果表明，在这样一个小的组装装置中，50,100和1,000bp的DNA梯子可以很好地分离。该方法的优点在于不仅可以将化学消耗少的核酸分开，还可以记录分离过程。尽管DNA片段在图2中看起来很宽，但可以通过优化SGE芯片的参数和琼脂糖凝胶的浓度来改善结果。此外，如果在芯片中使用预制凝胶，则SGE工艺的总时间不超过10分钟。
如果芯片中的通道宽度发生变化，则DNA梯形图的分离性能会有很大差异。例如，当1,000bp的DNA梯子被分离时，DNA带看起来更宽通道的宽度很小。这可能是因为琼脂糖凝胶中的焦耳加热非常高18 ，这影响分离性能。
这里提出的SGE方法非常简单。如果系统被优化，则可以开发便携式迷你SGE设备。这样的设备可以应用于护理实验室测试。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
我们非常感谢中国国家自然科学基金（21205078）和中国高等教育博士研究基金（No.20123120110002）的支持。这项工作得到了中国国家重点研究发展计划（2016YFB1102303），中国国家基础研究计划（973计划，2015CB352001）和国家自然科学基金（61378060）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
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