Summary
פרוטוקול עבור כימות חלבון בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית חיסונית אוטומטית-MALDI (iMALDI) מוצג.
Abstract
ספקטרומטר מסה (MS) היא אחת הטכנולוגיות הנפוצות ביותר לכימות תנועת החלבונים בדגימות מורכבים, עם ירידה לפרטים assay מעולה בעקבות זיהוי ישיר היחס בנפח גדול לתשלום של כל מולקולה היעד. עם זאת, פרוטאומיקס מבוססי MS, כמו רוב טכניקות אנליטיות אחרות, יש דעה קדומה כלפי מדידה גבוהה-שפע analytes, אז זה מאתגר כדי להשיג זיהוי גבולות של נמוך ng/mL או pg/mL דוגמאות מורכבות, וזאת הוא הטווח ריכוז עבור רבים חלבונים מחלות רלוונטיות ב biofluids כגון לפלסמה אנושית. כדי לסייע זיהוי analytes נמוך-שפע, חיסונית-העשרה שולב וזמינותו כדי להתרכז ולטהר את analyte לפני המדידה MS, באופן משמעותי לשיפור הרגישות וזמינותו. בעבודה זאת, חיסונית - הטכנולוגיה Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון (iMALDI) הוא הציג כימות של חלבונים ופפטידים biofluids, בהתבסס על חיסונית-העשרה על חרוזים, ואחריו MALDI-MS מדידות ללא • תנאי מוקדמת. נוגדנים אנטי-פפטיד functionalized על beads מגנטי, מודגרות עם דוגמאות. לאחר הרחצה, החרוזים מועברים ישירות לצלחת היעד MALDI, האותות נמדדת על ידי זמן-MALDI של כלי הטיסה (MALDI-TOF) לאחר הפתרון מטריקס הוחלה על החרוזים. הליך הכנת המדגם היא פשוטה יותר לעומת שאר מבחני חיסונית-MS, המדידה MALDI הוא מהיר. הכנת המדגם כולו היא אוטומטית עם נוזל טיפול במערכת, ועם הפארמצבטית assay שיפור תפוקה גבוהה יותר. במאמר זה, וזמינותו iMALDI משמש לקביעת אנגיוטנסין פפטיד של אני (אנג אני) ריכוז בפלסמה, אשר משמש קלינית readout פעילות רנין פלזמה להקרנה של ראשי aldosteronism (פי אי).
Introduction
ספקטרומטר מסה הפך להיות כלי חיוני ב פרוטאומיקס כמותית. ספקטרומטר מסה יכול לקבוע את ההמונים של חלבונים היעד או פפטידים, לכן אותות analyte שהושג יכול להיות ספציפי מאוד בהשוואה ל- immunoassays. שתי שיטות יינון, ספקטרומטריית electrospray ו- MALDI, משמשים בדרך-כלל זיהוי חלבונים ו פפטידים1,2,3,-4. האתגר העיקרי של חלבון מבוססי MS כימות טמון זיהוי חלבונים נמוכה-שפע בדגימות מורכבים בריכוזים ng/mL או pg/mL בנוכחות גבוהה-שפע חלבונים, והם רבים המועמד חלבון סמנים ביולוגיים נמצאו לפלסמה אנושית במסגרת זו בטווח5. בעיה זו נגרמת בעיקר על ידי טווח דינמי רחב מטבעו והמורכבות של האדם פרוטאום6.
כדי להתגבר על האתגרים הללו זיהוי, פותחו שיטות חיסונית-MS כדי להעשיר את היעד חלבונים או פפטידים מן הפתרונות מדגם על גבי משטח יציב, ואחריו • תנאי של analytes ו- MS מידה7,8 , 9 , 10. דרך חיסונית-העשרה, analytes וגופם מטוהר מדגימות מורכבות, ולכן ההשפעות יון-דיכוי של מולקולות אחרות הן מזעריות. בין תומך מוצקים שונים, beads מגנטי הם כיום בשימוש נרחב ביותר כפי שהם את היתרונות של נוגדנים גבוהים מחייב יכולת וקלות הטיפול. יש beads מגנטי עם functionalizations שונים וגדלים פותחה, ממוסחר לניסויים immunoprecipitation. עד כה, חיסונית-העשרה על חרוזים יש כבר לממשק עם ספקטרומטריית electrospray יינון (ESI) וגם MALDI-MS למדידה חלבון ופפטיד. איזוטופ יציב סטנדרטים, לכידת על-ידי טכנולוגיית נוגדנים אנטי-פפטיד (SISCAPA), חלבונים הדגימות מתעכלים, ואחריו הדגירה עם חרוזים מצופים נוגדן חיסונית-העשרה. ב- SISCAPA "הקלאסי", פפטידים שנתפסו proteotypic eluted של החרוזים, נמדד על ידי נוזלי כרומטוגרפיה-ESI-MS (LC-MS), או על ידי אינפוזיה ישירה ניטור התגובה ESI-מרובה-MS (ESI-MRM-MS)11,12. חיסונית-העשרה שיפור הרגישות assay MRM מאת 3-4 סדרי גודל, להגיע לטווח נמוך ng/mL13.
בהשוואה לספקטרומטריית electrospray-MS, MALDI-MS מהר יותר, אינו כרוך equilibration מחדש של עמודות LC או ניקיון אז אין בעיות דחויים וזיהום, שהופך אותו מתאים יותר תפוקה גבוהה לימודי14. חיסונית-MALDI הטכנולוגיה פותחה במעבדה שלנו לשלב חיסונית-העשרה עם MALDI-MS על כימות רגיש וספציפי של פפטידים וחלבונים (מבוסס על כימות של פפטידים proteotypic)15,16 ,17. לאחר חיסונית-העשרה, החרוזים מופקדים על צלחת היעד MALDI, הפתרון מטריקס מתווסף חרוזים, הצלחת הוא מוכן לניתוח על ידי MALDI-תוף-MS לאחר הייבוש. • תנאי של פפטידים של החרוזים אינה מבוצעת כשלב נפרד, אך זיקה מכורך analytes הם eluted לפי הפתרון מטריקס MALDI כאשר היא מתווספת לנקודות חרוז, ובכך לפשט את הכנת הדוגמא וצמצום מדגם הפסד. IMALDI טכנולוגיה הוחל במגוון יישומים18,19, לאחרונה יש כבר אוטומטי, המשמש למדידת אנגיוטנסין אני (אנג אני) לקביעת פלזמה רנין פעילות (PRA)20. פרוטוקול זה תדגים ההליך המשמש לביצוע וזמינותו של iMALDI אוטומטית. לוקח וזמינותו PRA כדוגמה, הבין-היום CVs של פחות מ-10% הושגו באמצעות אוטומציה, עם יכולת המדידה 744 דוגמאות לכל יום20.
וזמינותו PRA iMALDI הפגינו כתב יד זה אינה דורשת עיכול חלבון, כמו המולקולה היעד (אנג אני) הוא פפטיד עם משקל מולקולרי של 1295.7 Da. מבחני אחרים לעיכול חלבון נחוץ ואיפה פפטיד משמש הפונדקאית חלבון שלם, פפטיד שנבחר עבור iMALDI צריכה להיות ייחודיות וספציפיות כדי החלבון היעד, עם גוש מעל 800 Da אז זה ניתן להבדיל בקלות בין c רעש hemical מהפתרון מטריקס MALDI. נוגדנים אנטי-פפטיד נדרשים עבור חיסונית-ההעשרה של פפטידים. הפרוטוקול עבור assay iMALDI מדידת PRA כוללת ארבעה שלבים: 1) דור של אנג לי בפלסמה אנושית; 2) חיסונית-העשרה של אנג לי באמצעות חרוזים מצופים נוגדן; 3) העברה של חרוזים MALDI המטרה צלחת, הוספת מטריקס פתרון; . ו-4) אות רכישה על-ידי MALDI-תוף-MS ונתונים ניתוח20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כמויות ריאגנטים המתוארים להלן מבוססות על המידה של 20 דגימות פלסמה החולה. הפרוטוקול שיובאו להלן להלן ההנחיות של האוניברסיטה של ויקטוריה ' ועדת האתיקה האנושית מחקר s.
1. דור של אנג לי בפלסמה אנושית
- להפשיר דגימות פלסמה (≥ 200 µL) בחדר טמפרטורת מים אמבטיה במשך 5 דקות, ולאחר מכן הצב את הדגימות על הקרח עד לחלוטין הקרת.
- µL 200 העברה של כל מדגם פלזמה באופן ידני כדי להפריד בארות של צלחת באר 1.1 mL (לדוגמה צלחת), ו centrifuge את הצלחת ומפרידה 10 דקות-2 ° C ו- g x 1278
- השתמש של נוזל אוטומטיות טיפול מערכת לדלל באופן סדרתי 500 fmol/µL אנג I NAT פתרון רגיל להכין שישה פתרונות כיל עם תרנגולת חלבון אלבומין (0.1 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, fmol 17.2/µL). מאגר
- פיפטה 200 µL של כל כיל µL טוב, 125 של הדור מדגם לצלחת.
הערה: CEWA ב פוספט תמיסת מלח במאגר (PBS) המאגר צריך להיות מוכן טרי ביום של הניסוי- - באמצעות נוזל אוטומטיות של טיפול המערכת, בתוך צלחת חדשה מערבבים 125 µL של פלסמה supernatant או µL 125 של CEWA ב- PBS עם 25 µL של אנג לי מאגר הדור, אשר מכיל 1 מ' טריס, חומצה ethylenediaminetetraacetic 0.2 מ מ (EDTA), ו 1 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF).
הערה: להכין את אנג אני דור מאגר על ידי ערבוב 1 מ' טריס/0.2 מ מ EDTA מימית מאגר (להתאים את ה-pH 5.5 באמצעות חומצה אצטית) ופתרון PMSF (100 מ מ ב מתנול). שני פתרונות ניתן לאחסן חודש-4 מעלות צלזיוס. לערבב השני פתרונות ביום של הניסוי- - להעביר באופן אוטומטי את הפתרונות לתוך צלחת 96-ובכן, משכפל 3 לכל פתרון, µL 34 לכל טוב. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ח'
2. חיסונית-העשרה של אנג לי חרוזים מצופים נוגדן באמצעות
- ההטיה של נוגדנים על גבי beads מגנטי חלבון G
הערה: ההטיה של הנוגדן עם החרוזים מבוצעת באופן ידני במהלך ה 3 אנג לי תקופת הדור- יום של הניסוי. עבור אחרים analytes, החרוזים מצומדת יוכל לאחסן במאגר PBS המכיל 0.015% בחורים (PBSC) ב 4 מעלות צלזיוס למשך שלושה חודשים או יותר, בהתאם המאפיינים ואת היציבות של הנוגדן.- µL 110 העברה של slurry חרוז (מספיק מדידה 20 דגימות וביצוע עיקול רגיל 6 נקודות) לתוך צינור 1.5 מ ל. לשטוף את החרוזים שבע פעמים עם 1 מ"ל של 25% acetonitrile/PBSC ועם שלוש פעמים 1 מ"ל של PBSC. השתמש עמדה מגנטי כדי הצניפה החרוזים בין שלב לשלב הכביסה. להסיר את המאגר לשטוף לאחר לשטיפה האחרונה
הערה: כביסה 7 פעמים עם 25% acetonitrile/PBSC הוא קריטי עבור הסרת התוסף MS-לא תואם slurry חרוז, כגון Tween-20. אם ישנם תוספים כאלה לא חרוזים שנבחר, שלב כביסה נרחב זה לא יהיה הכרחי. - Resuspend את החרוזים ב 110 µL של PBSC, ולהוסיף µL 110 של אנטי-אנג לי נוגדנים (ריכוז נוגדן הסופי: µg 100/mL). לערבב את החרוזים ואת הפתרון על ידי pipetting ולאחר מכן דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 1 h, מסתובב ב 8 סל ד.
- לרחוץ את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBSC ולאחר resuspend ב 1100 µL של PBSC.
הערה: אם כל פתרון חרוז יש זרמו לתוך הכיפה של הצינור במהלך הדגירה, ספין למטה הפתרון בעזרת צנטריפוגה benchtop 2680 ג x - העברת הפתרון חרוז באופן ידני צלחת 96-ובכן (צלחת רגילה חרוז). השתמש הנוזל אוטומטיות טיפול למערכת aliquot את החרוזים לצלחת 96-ובכן אותו, µL 120 לכל טוב.
- µL 110 העברה של slurry חרוז (מספיק מדידה 20 דגימות וביצוע עיקול רגיל 6 נקודות) לתוך צינור 1.5 מ ל. לשטוף את החרוזים שבע פעמים עם 1 מ"ל של 25% acetonitrile/PBSC ועם שלוש פעמים 1 מ"ל של PBSC. השתמש עמדה מגנטי כדי הצניפה החרוזים בין שלב לשלב הכביסה. להסיר את המאגר לשטוף לאחר לשטיפה האחרונה
- חיסונית-העשרה על החרוזים
- אחרי ה 3 אנג תקופת הדור, אתה מבין את הצלחת דגירה קרח למשך 10 דקות לסיים את הדור של אנג. אני
- אוטומטי לדלל את אחותי פפטיד הפתרון מניות (10 pmol/μL) 100-fold עם PBS מאגר ולאחר נוספת באופן אוטומטי aliquot דילול פפטיד סטנדרטי isoptope יציב על צלחת PCR 96-ובכן. העברת µL 1.5 של פתרון פפטיד סטנדרטים (SIS) איזוטופ יציב (מכיל 100 fmol) לבאר כל צלחת דגירה, ולערבב עם הדגימות פלזמה או את CEWA במאגרי PBS.
- באופן אוטומטי להעביר את התוכן של צלחת הדגירה הפתרון חרוז, 10 מ לכל טוב, לערבב.
- דגירה את הצלחת ב 4 ° C עבור 1 h תוך כדי סיבוב על סל ד 8.
- לשטוף את החרוזים שלוש פעמים באופן אוטומטי עם 5 מ מ פתרון אמוניום ביקרבונט (AmBic), µL 100 לכל טוב לכל לשטוף. לאחר השטיפה האחרונה resuspend את החרוזים ב 7 µL של 5 מ מ פתרון AmBic כל טוב. השתמש מגנט למשוך את החרוזים לתחתית לאחר לשטיפה האחרונה
3. העברה של חרוזים על גבי MALDI המטרה צלחת עם הוספת מטריקס פתרון
- µL 7 העברה של slurry חרוז באופן אוטומטי על גבי צלחת היעד MALDI עם גודל נקודה של 2,600 מיקרומטר. תן החרוזים להתייבש.
הערה: מאוורר מאפיק USB קטן יכול לשמש כדי להאיץ את החרוז ייבוש תהליך. - להוסיף באופן אוטומטי µL 2 α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (HCCA)-פתרון מטריקס (מכיל 3 מ"ג/מ"ל HCCA, ציטראט אמוניום 1.8 מ"ג/מ"ל, acetonitrile 70% ו- 0.1% חומצה trifluoroacetic) מתוך מטריצת טוב על גבי כל מדגם ספוט בצלחת היעד .
4. אות רכישה על-ידי MALDI-תוף-MS ניתוח נתונים
- ניתוח המדגם כתמים עם מכשיר MALDI-TOF באמצעות מצב חיובי רפלקטור. לבצע כיול פנימי נתונים החלקה, חיסור בסיסית באופן אוטומטי עם תוכנה ספציפית לספק.
הערה: למצב (לינארי חיובי/שלילי, / רפלקטור) הנבחר עבור MALDI-TOF המדידה תלויה פפטידים היעד או חלבונים. - לחשב את היחס תגובה יחסית (Nat/אחות בעוצמה יחס) ולהשוות אותם, עיקול רגיל כדי לקבוע של אנג ריכוז בכל מדגם. לחשב PRA באמצעות משוואה (1), שבה Δt אנג אני דור מייצג את הזמן המשמש את הדור של אנג. אני
PRA = [אנג אני] / Δt אנג אני דור (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שגרת iMALDI אוטומטיים למדידת אנג אני מוצג באיור1. פפטידים היעד (פפטידים אנדוגני או פפטידים של חלבונים מתעכל) מועשרים בפפטיד אנטי beads מגנטי ולאחר מכן החרוזים מועברים צלחת היעד למדידה MALDI. כל התהליך היא פשוטה יותר לעומת טכנולוגיות אחרות חיסונית-MS דורשים צעדים • תנאי פפטיד נוספים. אוטומציה של וזמינותו iMALDI מאפשר תפוקה גבוהה ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם מקדם הבין-היום וריאציה (CV) להלן 10% 20. נציג ספקטרה התקבלו ע י מדידת אנג אני בדגימות הפלסמה האנושית מוצגים באיור2. הפונקציה פפטידים אחות כמו תקן פנימי עבור כימות פפטיד. המתאם של ערכים PRA מדגימות החולה 188, שהושג עם וזמינותו iMALDI אוטומטית עם ערכים PRA שהושג באמצעות הליך LC-MS/MS קלינית17 מוצג באיור3. שתי השיטות יש מקדם המתאם של 0.98; ההבדל בין המדרונות עלולות להיגרם על ידי שימוש סטנדרטים פנימיים שונים בשתי השיטות, או על ידי השימוש של נוגדנים שונים iMALDI הליך20. טווח ליניארי וזמינותו ודיוק assay מוצגים באיור 4 , איור 5.
איור 1: תהליך זרימת סכמטית assay PRA iMALDI אוטומטית. חיבור מקורי הפניה20, בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ספקטרה נציג של נאט ו אנג אחותי אני פפטידים נמדד מאמצע דוגמית לפלסמה אנושית.
איור 3: מתאם של PRA ערכים נמדד לפי iMALDI ולפי LC-MS/MS מדגימות החולה 188. חיבור מקורי הפניה20, בעלי הרשאה.
איור 4: טווחים ליניארי של וזמינותו PRA iMALDI (א) רפלקטור והן במצב לינארי (B). מ הפניה20, עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: דיוק יומי (A) ודיוק interday (B) של iMALDI מבחני PRA על פלזמה בריכות עם ערכים PRA נמוך, בינוני וגבוה. חיבור מקורי הפניה20, בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לעומת חלבון מבוססי MS קונבנציונאלי כמת, iMALDI משתמש נוגדנים כדי לטהר אותם מדגימות מורכבות, ולכן כך שניתן לכמת חלבונים או פפטידים בריכוזים נמוכים ולהעשיר את analytes. שלב קריטי בפרוטוקול iMALDI הוא חיסונית-ההעשרה של פפטידים היעד. למטרה זו, יש לבחור נוגדנים עם ירידה לפרטים גבוה ואהדה. ב- SISCAPA, דווח כי הזיקות נוגדן-10-9 מ' או יותר יהיה צורך להשיג רגישות גבוהה נמוך ng/mL21. בנוסף, חרוזים עם נוגדנים גבוהים מחייב קיבולת עדיפים העשרה אופטימלית.
חשוב גם ליצור ספקטרום "נקי" יחסית של מולקולות יעד עם רקע מינימלי רמות. יחס אות לרעש גבוה יכולה להיות מושגת באמצעות חרוז נרחב שטיפה לאחר השלב חיסונית-העשרה. כמו כן, מצאנו כי רוחץ המקומות חרוז על הצלחת היעד לאחר הוספת וייבוש הפתרון מטריקס יכול להפחית באופן משמעותי את האותות רעש, ובכך לשפר את יחס אות לרעש.
וזמינותו PRA iMALDI הפגינו בעבודה זו אינה דורשת את השלבים proteolysis, כמו המולקולה היעד אנג הוא פפטיד. כדי לכמת מולקולות חלבון במדגם, החלבון מתעכלת בדרך כלל לתוך פפטידים לפני חיסונית-העשרה, למרות עבור פפטידים המכילים epitope, העיכול יכול להתבצע על חלבון שנתפסו22,23. במקרה זה, פרוטוקול עיכול חלבון קיים שניתן בקלות להוסיף את זרימת העבודה iMALDI. בהתאם מאגר עיכול, צעד desalting ייתכן שיש צורך לפני הלכידה של פפטידים על חרוזים, כדי למנוע הפרעה עם האיגוד נוגדן-פפטיד.
בדומה לשיטות אחרות חיסונית-MS, בייצור נוגדנים אנטי-פפטיד הוא אתגר גדול בפיתוח של מבחני iMALDI. לאחרונה, טריפל X פרוטאומיקס הטכנולוגיה פותחה כדי לייצר קלסרים זיקה שיכולות היעד פפטידים מרובים לכל בינדר24. זה עשוי להפחית את העלות של נוגדנים אנטי-פפטיד, להקל על הפיתוח של מבחני מרובבת בו זמנית באמצעות דגירה של יחיד. בנוסף, נוגדן קטעים25 או aptamers סינתטי26 יכול להיות חלופות לשימוש של נוגדנים שלמים ו יש את היתרון של ייצור קל יותר. Aptamers סינתטי דווחו כמו מציג רקע רמות נמוכות יותר מאשר נוגדנים שלמים כאשר המשמש להעשרת זיקה-26.
טכנולוגיית iMALDI משלב את היתרונות של immunoassays עם ספקטרומטר מסה MALDI, המאפשרים ניתוח מהיר, תפוקה גבוהה חלבון/פפטיד במספר רב של דוגמאות מורכבות, עם רגישות גבוהה. בניגוד לשיטות אחרות חיסונית-MS, לאחר לכידת חיסונית, המטרה פפטידים הם לא eluted בצינור, אבל את החרוזים analytes נשיאה מועברים על MALDI המטרה צלחת עבור MS-ניתוח, וכך למנוע האובדן של פפטידים עקב שלהם ספיחה לפלסטיק צינורות. נוגדן אחד בלבד לעומת פרוטיאומיה מבנית שימוש נרחב בכלים כגון תספיג או אליסה, נדרש iMALDI, מפחיתה משמעותית את זמן פיתוח assay והעלות. הגבול התחתון של זיהוי שיש בידינו ב וזמינותו PRA משולה אליסה קונבנציונאלי, בתוך הטווח פיזיולוגיים. הנוגדן היחס בנפח גדול לתשלום לספק תהליך הבחירה כפול, אשר מבטיח יחודיות גבוהה של וזמינותו. יישומים של iMALDI אינה מוגבלת PRA מבחני, אבל יכול להיות מיושם עבור כימות של כל ביטוי חלבון ואפילו כימות של שינוי חלבון בדגימות מורכבים. ראוי לציין, iMALDI אוטומטית תפוקה גבוהה יכול להיות כלי קליני רב עוצמה עבור גילוי של אימות של סמנים ביולוגיים חלבון במגוון רחב של מחלות, בשל נוכחותם של benchtop MALDI מכשירים בשימוש כיום במרפאות עבור בקטריאלי זיהוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.H.B מחזיק את הפטנט על טכנולוגיית iMALDI.
Acknowledgments
אנו מודים סיוע כספי מן הגנום קנדה של הגנום קולומביה הבריטית עבור פעולות (204PRO), פיתוח טכנולוגיות (214PRO) דרך רשת חידושים הגנום (ג'ין). אנו מודים פלטפורמת גילוי סמים במכון המחקר של מרכז הבריאות באוניברסיטת מקגיל לשימוש של המכשיר MALDI-TOF לצלם. מרגשת היא אסירת תודה על התמיכה של מלגת פוסט-דוקטורט מן המדע הלאומית להנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC). C.H.B הוא אסיר תודה על התמיכה של הקרן הקרן החדשנית (ליף). C.H.B. הוא אסיר תודה על התמיכה היו ר סגל אוניברסיטת מקגיל אונקולוגיה מולקולרית באוניברסיטת מקגיל (מונטריאול, קוויבק, קנדה). M.X.C., C.H.B. אסירי תודה על תמיכה מ את וורן י' סופר (מתורגם) צדקה אמון, הקרן המשפחתית על סגל אלווין לבית החולים הכללי היהודי (מונטריאול, קוויבק, קנדה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D. Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al.
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
