Summary
Un protocole pour la quantification de la protéine dans les liquides biologiques complexes à l’aide de la technologie automatisée immuno-MALDI (iMALDI) est présenté.
Abstract
Spectrométrie de masse (MS) est une des technologies plus couramment utilisées pour quantifier les protéines dans des échantillons complexes, avec dosage excellente spécificité à la suite de la détection directe du ratio masse à charge de chaque molécule cible. Cependant, protéomique axée sur les MS, comme la plupart des autres techniques analytiques, a un biais de mesure haute-abondance analytes, donc il est difficile d’atteindre les seuils de détection de basse ng/mL ou pg/mL chez des échantillons complexes et c’est la plage de concentration pour beaucoup maladie-les protéines liquides comme le plasma humain. Pour aider à la détection d’analytes de faible abondance, immuno-enrichissement a été intégré dans l’essai de se concentrer et de purifier l’analyte avant MS mesure, améliorer significativement la sensibilité. Dans ce travail, la technologie immuno - Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation (iMALDI) est présentée pour la quantification des protéines et des peptides dans les liquides, issue des immuno-enrichissement sur perles, suivie par MALDI-MS mesure sans préalable d’élution. Les anticorps anti-peptides sont fonctionnalisés sur billes magnétiques et incubées avec les échantillons. Après le lavage, les perles sont directement transférées sur une plaque de mire MALDI, et les signaux sont mesurés par un MALDI-temps des instruments de vol (MALDI-TOF) après que la solution de la matrice a été appliquée aux talons. La procédure de préparation d’échantillon est simplifiée par rapport aux autres tests immuno-MS, et la mesure de la MALDI est rapide. La préparation de l’ensemble de l’échantillon est automatisée avec un liquide de système, de la manutention avec la reproductibilité du dosage améliorée et un débit plus élevé. Dans cet article, le test d’iMALDI est utilisé pour déterminer l’angiotensine peptide j’ai (Ang I) concentration dans le plasma, qui est utilisé cliniquement comme indicateur de l’activité rénine plasmatique pour la projection d’hyperaldostéronisme primaire (PA).
Introduction
Spectrométrie de masse est devenu un outil indispensable en protéomique quantitative. Spectrométrie de masse permet de déterminer les masses des peptides ou des protéines cibles, donc les signaux analyte obtenus peuvent être très spécifiques par rapport aux tests immunologiques. Deux méthodes d’ionisation electrospray et MALDI, sont plus couramment utilisés pour la détection des protéines et des peptides1,2,3,4. Un défi majeur dans la quantification des protéines basée sur MS réside dans la détection des protéines de faible abondance dans des échantillons complexes à des concentrations ng/mL ou pg/mL en présence de protéines de haute-abondance, et nombreux biomarqueurs protéiques de candidat dans le plasma humain sont au sein de cette gamme5. Ce problème est dû en grande partie par l’intrinsèquement une plage dynamique étendue et la complexité du protéome humain6.
Pour surmonter ces difficultés de détection, les méthodes immuno-SM ont été développés afin d’enrichir les protéines cibles ou des peptides dans les solutions d’échantillon sur une surface solide, suivie d’élution de l’analyser et MS mesure7,8 , 9 , 10. par immuno-enrichissement sans cause, les analytes sont purifiées à partir des échantillons complexes et donc les effets de la suppression des ions d’autres molécules sont réduites au minimum. Parmi les différents supports solides, billes magnétiques sont actuellement plus largement utilisés car ils ont les avantages de la capacité de liaison anticorps élevés et facilité de manipulation. Billes magnétiques avec différentes fonctionnalisation et tailles ont été développés et commercialisés pour des expériences d’immunoprécipitation. A ce jour, immuno-enrichissement sur perles a été interfacé avec ionisation par électrospray (ESI) et MALDI-MS pour la mesure de protéines et de peptides. Dans les normes des isotopes stables et la capture par la technologie anticorps anti-peptide (SISCAPA), les protéines dans les échantillons sont digérées, suivie d’une incubation avec perles revêtus d’anticorps pour immuno-enrichissement. Dans SISCAPA « classique », les peptides proteotypic capturés sont éluées de talons et mesurées par Liquid Chromatography-ESI-MS (LC-MS), ou par perfusion directe ESI-Multiple réaction Monitoring-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Immuno-enrichissement amélioré la sensibilité de l’éssai MRM de 3-4 ordres de grandeur, atteignant le rang faible ng/mL13.
Par rapport à electrospray-MS, MALDI-MS est plus rapide et n’implique pas le nettoyage et la rééquilibration des colonnes LC donc il n’y a aucun problème de report et contamination, plus adapté aux études haut débit14. Immuno-MALDI technologie a été développée dans notre laboratoire à combiner immuno-enrichissement avec MALDI-MS pour la quantification sensible et spécifique des peptides et des protéines (basés sur le dosage des peptides proteotypic)15,16 ,,17. Après enrichissement immuno, les perles sont déposés sur une plaque de mire MALDI, la solution de matrice est ajoutée aux billes et la plaque est prête pour l’analyse par un MALDI-TOF-MS après séchage. L’élution des peptides de la perle n’est pas exécutée comme une étape distincte, mais affinité lié aux analytes sont éluées par la solution de matrice MALDI lorsqu’il est ajouté aux spots perle, ce qui simplifie la préparation de l’échantillon et réduisant au minimum la perte de l’échantillon. La technologie iMALDI a été appliquée dans une variété d’applications18,19et récemment a été automatisée et utilisée pour la mesure de l’angiotensine I (Ang je) pour la détermination de l’activité (PRA) rénine plasmatique20. Ce protocole fera la démonstration de la procédure utilisée pour effectuer un test automatique iMALDI. Prendre le dosage de la PRA à titre d’exemple, la inter-journée CVs de moins de 10 % ont été obtenus grâce à l’automatisation, la capacité de mesurer 744 échantillons par jour20.
Le test PRA iMALDI démontré dans ce manuscrit ne nécessite pas de digestion des protéines, comme la molécule cible (Ang I) est un peptide avec un poids moléculaire de 1295.7 Da. Lors d’autres essais où la digestion de protéines est nécessaire et un peptide est utilisé comme substitut pour la protéine intacte, le peptide sélectionné pour iMALDI doit être unique et spécifique à la protéine cible, avec une masse plus de 800 Da alors qu’elle peut être aisément distinguée de la c bruit chimique de la solution de matrice MALDI. Anticorps anti-peptides sont requis pour l’immuno-enrichissement des peptides. Le protocole de test iMALDI PRA de mesure se compose de quatre étapes : 1) génération de Ang j’ai dans le plasma humain ; 2) immuno-enrichissement d’Ang I à l’aide de petites perles revêtus d’anticorps ; 3) transfert de perles à une plaque de mire MALDI et ajout solution de matrice ; et 4) acquisition de signal par une analyse de MALDI-TOF-MS et données20.
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Protocol
les montants des réactifs décrits ci-dessous sont basés sur la mesure des 20 échantillons de plasma patient. Le protocole présenté ci-dessous suit les directives de l’Université de Victoria ' Comité de déontologie de la recherche humaine s.
1. génération de Ang j’ai dans le Plasma humain
- décongeler les échantillons de plasma (≥ 200 µL) dans une salle l’eau à température de bain pendant 5 min et puis mettre les échantillons sur la glace jusqu'à ce que complètement décongelée.
- Transférer 200 µL de chaque échantillon de plasma manuellement pour séparer les puits d’une plaque de fond de puits de 1,1 mL (plaque d’échantillon) et centrifuger la plaque dans une centrifugeuse pendant 10 min à 2 ° C et 1278 x g.
- Utiliser un liquide automatique, système de manutention en série diluer une solution titrée 500 fmol/µL Ang I NAT pour préparer six calibrateurs avec albumine de blanc d’oeuf de poulet (0.1, 0.2, 0.6, 1,9, 5,7, 17,2 fmol/µL).
- Pipette 200 µL de chaque étalon à un puits et 125 µL de génération tampon plaque échantillon.
Remarque : Le chaieb en phosphate tampon tampon salin (PBS) doit être fraîchement préparées le jour de l’expérience. - à l’aide d’un liquide automatique, système de manutention, dans une nouvelle assiette Mélanger 125 µL du plasma surnageant ou 125 µL de chaieb dans du PBS avec 25 µL d’Ang j’ai tampon de génération, qui contient les Tris, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,2 mM et 1 mM 1 M le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF).
NOTE : Préparer l’Ang j’ai tampon génération en mélangeant un tampon aqueux 1 M Tris/0,2 mM EDTA (ajusté à pH 5.5 à l’aide d’acide acétique) et une solution PMSF (100 mM dans le méthanol). Les deux solutions peuvent être conservées jusqu'à 1 mois à 4 solutions de ° C. Mélangez les deux le jour de l’expérience. - Transférer automatiquement les solutions dans une plaque à 96 puits, 3 répétitions par solution, 34 µL / puits. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 h
2. Immuno-enrichissement de Ang je revêtus d’anticorps à l’aide de perles
- conjugaison d’anticorps sur des billes magnétiques de protéines G
Remarque : conjugaison de l’anticorps avec les perles est effectuée manuellement pendant les 3 h Ang j’ai des période de génération sur le jour de l’expérience. D’autres analytes, les perles conjugués pourraient être en mesure d’être stocké dans le tampon PBS contenant 0,015 % CHAPS (PBSC) à 4 ° C pendant trois mois ou plus, selon les propriétés et la stabilité de l’anticorps.- Transfert 110 µL de lisier de perle (assez pour 20 échantillons de mesure et de faire une courbe standard de 6 points) dans un tube de 1,5 mL. Laver les perles sept fois avec 1 mL d’acétonitrile/PBSC de 25 % et trois fois avec 1 mL de PBSC. Utiliser un support magnétique pour granuler les perles entre chaque étape de lavage. Retirer le tampon de lavage après le dernier lavage à.
Remarque : Laver 7 fois avec 25 % acétonitrile/PBSC est essentiel pour éliminer les additifs MS incompatible avec du lisier de perle, comme le Tween-20. S’il n’y a pas d’additifs dans les perles sélectionnées, cette étape un lavage n’est peut-être pas nécessaire. - Remettre en suspension les perles dans 110 µL de PBSC et ajoutez 110 µL d’anti-Ang I anticorps (concentration finale d’anticorps : 100 µg/mL). Mélanger la solution et perles en pipettant également et puis les incuber à température ambiante pendant 1 h, tournant à 8 tr/min.
- Laver les billes 3 fois avec 1 mL de PBSC et resuspendre dans 1100 µL de PBSC.
Remarque : Si aucune solution de perle a coulé dans le capuchon du tube pendant l’incubation, tourner vers le bas de la solution à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à 2680 x g. - Transférer la solution de perle manuellement dans une plaque à 96 puits (plaque standard perle). Utiliser le liquide automatisé système partie aliquote de manutention des perles sur la même plaque 96 puits, 120 µL par puits.
- Transfert 110 µL de lisier de perle (assez pour 20 échantillons de mesure et de faire une courbe standard de 6 points) dans un tube de 1,5 mL. Laver les perles sept fois avec 1 mL d’acétonitrile/PBSC de 25 % et trois fois avec 1 mL de PBSC. Utiliser un support magnétique pour granuler les perles entre chaque étape de lavage. Retirer le tampon de lavage après le dernier lavage à.
- Immuno-enrichissement sur les perles
- après les 3 h Ang période de génération, placer la plaque d’incubation sur glace pendant 10 min mettre fin à la génération d’Ang I.
- Automatiquement diluer la solution mère de SIS peptide (10 pmol/μL) 100 fois avec du PBS de mémoire tampon et en outre automatiquement partie aliquote de la dilution de peptide standard stable isoptope à une plaque PCR 96 puits. Transférer 1,5 µL d’une solution de peptide de normes (SIS) isotopes stables (contenant 100 fmol) dans chaque puits de la plaque d’incubation et mélangez-le avec les échantillons de plasma ou la chaieb dans des tampons de PBS.
- Automatiquement transférer le contenu de la plaque d’incubation dans la solution de perle, 10 mL par puits, mélanger.
- Incuber la plaque à 4 ° C pendant 1 h tout en tournant à 8 tr/min.
- Laver les perles trois fois automatiquement avec la solution de bicarbonate d’ammonium (AmBic) de 5 mM, 100 µL / puits / cycle de lavage. Après le dernier lavage, remettre en suspension les perles dans 7 µL de 5 mM AmBic solution dans chaque puits. Utiliser un aimant pour tirer les billes vers le bas après le dernier lavage à.
3. Transfert de perles sur une plaque de mire MALDI et ajout de la Solution de matrice
- Transfer 7 µL du lisier perle automatiquement sur une plaque de mire MALDI avec une taille de spot de 2 600 µm. Laissez sécher les perles.
Remarque : Un petit ventilateur alimenté par USB peut être utilisé pour accélérer le talon du processus de séchage. - Ajouter automatiquement 2 µL de α-cyano-4-hydroxycinnamique (LCSS)-solution de matrice (contenant 3 mg/mL LCSS, citrate d’ammonium et 1,8 mg/mL, 70 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide trifluoroacétique) de la matrice bien sur chaque échantillon spot sur la plaque cible .
4. Acquisition par un MALDI-TOF-MS et l’analyse des données de signaux
taches- analyser l’échantillon avec un instrument de MALDI-TOF à l’aide de mode réflecteur positive. Effectuer l’étalonnage interne, lissage de données et de la soustraction de référence automatiquement avec le logiciel spécifique au fournisseur.
Remarque : Le mode (positif/négatif, linéaire/réflecteur) sélectionné pour mesure de MALDI-TOF dépend de la cible peptides ou des protéines. - Calculer le taux de réponse relative (ratio d’intensité de Nat/SIS) et la comparer à la courbe d’étalonnage pour déterminer de l’Ang I concentration dans chaque échantillon. Calculer PRA où à l’aide de l’équation (1), Δt Ang je génération représente le temps utilisé pour la génération d’Ang I.
PRA = [Ang I] / Δt Ang je génération (1)
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Representative Results
Une procédure automatisée d’iMALDI pour mesurer les Ang I est montré dans la Figure 1. Peptides de la cible (peptides endogènes ou peptides de protéines digérées) sont enrichies sur le anti-peptides billes magnétiques, et ensuite les perles sont transférés à une plaque de mire pour la mesure de MALDI. L’ensemble de la procédure est simplifiée par rapport aux autres technologies d’immuno-MS qui nécessitent des mesures supplémentaires de peptide élution. Automatisation du dosage iMALDI permet d’analyse haut débit d’un grand nombre d’échantillons avec un coefficient entre jour de variation (CV) en dessous de 10 %, 20. Spectres représentatifs obtenues en mesurant Ang I dans les échantillons de plasma humain est illustré Figure 2. La fonction de peptides SIS comme étalon interne pour le dosage du peptide. Corrélation entre les valeurs PRA de 188 patients échantillons obtenus avec le test automatisé iMALDI avec PRA valeurs obtenues à l’aide d’une clinique de procédure LC-MS/MS17 est illustrée à la Figure 3. Les deux méthodes ont un coefficient de corrélation de 0,98 ; la différence entre les pentes pouvant résulter de l’utilisation des différentes normes internes dans les deux méthodes, ou par l’utilisation d’anticorps différents dans la procédure d’iMALDI20. La gamme de linéarité de l’essai et la précision de dosage sont indiquées dans la Figure 4 et Figure 5.
Figure 1 : Schéma de flux de processus d’un test PRA automatisé iMALDI. Adapté de référence20, avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Des spectres représentatifs du NAT et SIS Ang je peptides mesurée à partir d’un échantillon de plasma humain.
Figure 3 : Les valeurs de corrélation de PRA mesurées par iMALDI et par LC-MS/MS de 188 échantillons patients. Adapté de référence20, avec permission.
Figure 4 : Gammes linéaires du dosage iMALDI PRA en réflecteur (A) et en mode linéaire (B). Adapté de référence20, avec la permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Intrajournalier précision (A) et interday précision (B) des essais PRA iMALDI sur les pools de plasma avec des valeurs PRA faibles, moyens et élevés. Adapté de référence20, avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Par rapport à la quantification des protéines classiques basées sur, iMALDI utilise les anticorps d’enrichir l’analyser et de les purifier des échantillons complexes, rendant donc impossible de quantifier les protéines ou les peptides à de faibles concentrations. Une étape cruciale dans le protocole d’iMALDI est l’immuno-enrichissement des peptides cible. À cette fin, avec une grande spécificité et l’affinité des anticorps doivent être sélectionnés. Dans SISCAPA, on a signalé que des affinités d’anticorps à 10-9 M ou mieux seraient nécessaires pour atteindre la haute sensibilité à faible ng/mL21. En outre, perles avec capacité de liaison anticorps élevés sont préférés pour enrichissement optimale.
Il est également important générer des spectres relativement « propres » pour les molécules cibles avec des niveaux de fond minimal. Des rapports signal sur bruit élevés est possible dans une vaste perle lavage après l’étape d’enrichissement immuno. En outre, nous avons constaté qu’à laver les taches de perle sur la plaque cible après que l’ajout et le séchage de la solution de matrice peuvent réduire considérablement les signaux de bruit et donc d’améliorer le rapport signal-bruit.
Le test PRA iMALDI démontré dans ce travail ne nécessite pas les étapes de la protéolyse, comme la molécule cible Ang I est un peptide. Afin de quantifier les molécules de protéine dans un échantillon, la protéine est généralement digérée en peptides avant immuno-enrichissement, même si pour l’épitope contenant des peptides, la digestion peut être effectuée sur les protéines capturé22,23. Dans ce cas, un protocole existant de digestion des protéines peut être facilement inséré dans le flux de travail iMALDI. Selon le tampon de la digestion, une étape de dessalement peut-être être nécessaires avant la capture des peptides sur perles, pour ne pas gêner la liaison anticorps-peptide.
Semblable à d’autres méthodes d’immuno-MS, production d’anticorps anti-peptides est un défi majeur dans le développement de tests iMALDI. Récemment, la technologie Triple X protéomique a été développée pour produire des liants d’affinité qui peuvent cibler plusieurs peptides par liant24. Cela peut réduire le coût des anticorps anti-peptides et faciliterait le développement de tests de multiplexé simultanées à l’aide d’une seule période d’incubation. En outre,25 fragments d’anticorps ou synthétique aptamères26 pourraient être des solutions de rechange à l’utilisation d’anticorps intacts et aurait l’avantage de la production plus facile. Aptamères synthétiques ont été signalés comme présentant des niveaux de fond plus faibles que les anticorps intacts lorsqu’il est utilisé pour l’enrichissement de l’affinité26.
iMALDI technologie combine les avantages des immuno-essais avec la spectrométrie de masse MALDI, permettant l’analyse des protéines/peptides rapide et à haut débit dans un grand nombre d’échantillons complexes, avec une spécificité et une sensibilité élevée. Contrairement aux autres méthodes immuno-MS, après immuno-capture, la cible des peptides sont élués pas dans le tube, mais les perles des analytes comptables sont transférés sur la plaque de mire MALDI pour MS-analyse, évitant ainsi la perte des peptides en raison de leur adsorption au plastique tubes. Par rapport aux outils protéomiques largement utilisé comme tache occidentale ou ELISA, seul anticorps est requise dans iMALDI, réduisant considérablement le temps de développement de test et le coût. La limite inférieure de détection, que nous avons obtenus dans le dosage de la PRA est comparable à l’ELISA classique et bien dans les limites physiologiques. L’anticorps et le ratio de la masse de charge offrent un processus de sélection double, qui assure la haute spécificité de l’essai. Demandes d’iMALDI n’est pas limitées aux déterminations PRA, mais peut être appliqué pour dosage de toute expression de la protéine et de la même quantification de modification des protéines dans des échantillons complexes. Notamment, l’iMALDI haut débit automatisé peut être un puissant outil clinique pour la découverte et la validation de biomarqueurs protéiques dans une variété de maladies, en raison de la présence de benchtop MALDI instruments actuellement utilisés dans les cliniques pour bactérien identification.
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Disclosures
C.H.B détient le brevet sur la technologie iMALDI.
Acknowledgments
Nous remercions le soutien financier de Génome Canada et Génome Colombie-Britannique pour les opérations (204PRO) et le développement de la technologie (214PRO) à travers le génome Innovations Network (GIN). Nous remercions la plateforme de découverte de drogue à l’Institut de recherche de la McGill University Health Center pour l’utilisation de l’instrument de MALDI-TOF pour le tournage. H.L. est reconnaissante pour le soutien d’une bourse de recherche postdoctorale de la National Science et génie conseil recherche du Canada (CRSNG). C.H.B est reconnaissante pour le soutien de la pointe Endowment Fund (LEEF). C.H.B. est reconnaissante pour le soutien de la présidence de McGill Segal en oncologie moléculaire à l’Université McGill (Montréal, Québec, Canada). M.X.C. et C.H.B. sont reconnaissants pour le soutien de la Warren Y. Soper Charitable Trust et la Fondation de la famille Alvin Segal à l’hôpital général juif (Montréal, Québec, Canada).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
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