Summary
Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.
Abstract
Spettrometria di massa (MS) è una delle tecnologie più comunemente utilizzate per la quantificazione di proteine in campioni complessi, con eccellente specificità come risultato la rilevazione diretta del rapporto massa / carica di ogni molecola target. Tuttavia, proteomica basata su MS-, come la maggior parte delle altre tecniche analitiche, ha una polarizzazione verso analiti alta-abbondanza di misura, quindi è difficile da raggiungere limiti di rilevazione di bassa ng/mL o pg/mL in campioni complessi e questo è l'intervallo di concentrazione per molti malattia-relative proteine in biofluidi quali plasma umano. Per aiutare nella rilevazione di analiti di basso-abbondanza, immuno-arricchimento è stato integrato il saggio a concentrarsi e purificare l'analita prima misurazione MS, migliorando significativamente la sensibilità del test. In questo lavoro, la tecnologia di immuno - Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) è presentato per la quantificazione delle proteine e dei peptidi in biofluidi, basato su immuno-arricchimento su perline, seguito dalla misura di MALDI-MS senza previa eluizione. Gli anticorpi anti-peptide sono funzionalizzati su biglie magnetiche e incubati con campioni. Dopo il lavaggio, le perle vengono trasferite direttamente su una lastra di destinazione MALDI e i segnali sono stati misurati da un MALDI-tempo di volo (MALDI-TOF) strumento dopo la soluzione di matrice è stata applicata ai talloni. La procedura di preparazione del campione è semplificata rispetto ad altri saggi immuno-MS, e la misurazione di MALDI è veloce. La preparazione del campione intero è automatizzata con un liquido sistema, manipolazione con riproducibilità del migliorato e un throughput più elevato. In questo articolo, l'analisi di iMALDI è usata per determinare l'angiotensina peptide ho (Ang ho) concentrazione nel plasma, che è usato clinicamente come lettura di attività della renina plasmatica per lo screening di aldosteronismo primario (PA).
Introduction
Spettrometria di massa è diventato uno strumento indispensabile in proteomica quantitativa. Spettrometria di massa in grado di determinare le masse delle proteine bersaglio o peptidi, quindi i segnali ottenuti analita possono essere altamente specifici rispetto ai test immunologici. Due metodi di ionizzazione electrospray e MALDI, sono più comunemente utilizzati per la rilevazione di proteine e peptidi1,2,3,4. Una sfida importante nella quantificazione della proteina basate su MS si trova nella rilevazione di bassa-abbondanza di proteine in campioni complessi alle concentrazioni ng/mL o pg/mL in presenza di alta-abbondanza di proteine, e molti candidati proteine biomarcatori trovati nel plasma umano sono all'interno di questa gamma5. Questo problema è causato in gran parte dall'intrinsecamente ampio range dinamico e dalla complessità del proteoma umano6.
Per superare queste difficoltà di rilevazione, sono stati sviluppati metodi immuno-MS per arricchire il bersaglio proteine o peptidi da soluzioni campione su una superficie solida, seguita da eluizione degli analiti e MS misura7,8 , 9 , 10. con immuno-arricchimento, gli analiti sono purificati da campioni complessi e pertanto sono ridotti al minimo gli effetti di ioni-soppressione da altre molecole. Tra i vari supporti solidi, biglie magnetiche attualmente sono più ampiamente usati come hanno i vantaggi della capacità di legame dell'anticorpo alta e maneggevolezza. Biglie magnetiche con diverse funzionalizzazioni e dimensioni sono stati sviluppati e commercializzati per esperimenti di immunoprecipitazione. Fin qui, immuno-arricchimento su perline è stato interfacciato con MALDI-MS e ionizzazione electrospray (ESI) per la misurazione della proteina e del peptide. Isotopo stabile standard e la cattura di tecnologia di anticorpi anti-peptide (SISCAPA), proteine nei campioni sono digeriti, seguita da incubazione con anticorpo-rivestite di perline per immuno-arricchimento. In SISCAPA "classica", i peptidi proteotypic catturati sono eluiti dalle perline e misurati da liquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), o infusione diretta ESI multiplo reazione monitoraggio-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Immuno-arricchimento migliorata la sensibilità del dosaggio MRM di 3-4 ordini di grandezza, raggiungendo la fascia bassa ng/mL13.
Rispetto a MS di electrospray, MALDI-MS è più veloce e non comporta la pulizia e il riequilibrio delle colonne LC così non ci sono problemi riporto e contaminazione, rendendolo più adatto per studi di alto-rendimento14. Immuno-MALDI tecnologia è stata sviluppata nel nostro laboratorio di combinare immuno-arricchimento con MALDI-MS per quantificazione sensibile e specifica di peptidi e proteine (basate sulla quantificazione dei peptidi proteotypic)15,16 ,17. Dopo immuno-arricchimento, le perle sono depositate su un piatto di destinazione MALDI, la soluzione di matrice viene aggiunta di perline e il piatto è pronto per l'analisi di un MALDI-TOF-MS dopo l'essiccazione. Eluizione dei peptidi dalle perline non viene eseguita come un passaggio separato, ma associato a affinità analiti sono eluiti dalla soluzione MALDI matrice quando viene aggiunto ai punti tallone, quindi semplificare la preparazione del campione e minimizzazione della perdita di campione. La tecnologia iMALDI è stata applicata in una varietà di applicazioni18,19e recentemente è stata automatizzata e utilizzata per la misurazione dell'angiotensina I (Ang ho) per la determinazione della renina del plasma attività (PRA)20. Questo protocollo sarà dimostrare la procedura utilizzata per eseguire un test automatizzato iMALDI. Prendendo il test PRA come esempio, Inter-giorno CVs di meno del 10% sono stati raggiunti grazie all'automazione, con la capacità di misurare 744 campioni al giorno20.
Il dosaggio PRA iMALDI ha dimostrato in questo manoscritto non richiede la digestione di proteine, come la molecola bersaglio (Ang ho) è un peptide con un peso molecolare di 1295.7 Da. In altri saggi cui digestione delle proteine è necessaria e un peptide è utilizzato come surrogato per la proteina intatta, il peptide selezionato per iMALDI deve essere univoco e specifico per la proteina dell'obiettivo, con una massa oltre 800 Da così che esso può essere facilmente distinto dal c hemical rumore dalla soluzione matrice MALDI. Gli anticorpi anti-peptide sono necessari per l'immuno-arricchimento dei peptidi. Il protocollo per un dosaggio di iMALDI PRA di misura è costituito da quattro fasi: 1) generazione di Ang I nel plasma umano; 2) immuno-arricchimento di Ang che usando le perle di anticorpo-rivestite; 3) trasferimento di perline a una piastra MALDI e aggiungendo soluzione matrix; e 4) acquisizione del segnale con una di analisi dati e MALDI-TOF-MS20.
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Protocol
gli importi dei reagenti descritti di seguito si basano sulla misurazione di 20 campioni di plasma paziente. Il protocollo presentato di seguito segue le linee guida dell'Università di Victoria ' Comitato etico ricerca umana di s.
1. generazione di Ang I nel Plasma umano
- scongelare i campioni di plasma (≥ 200 µ l) in una stanza temperatura dell'acqua del bagno per 5 min e poi mettere i campioni su ghiaccio fino a quando completamente sciolto.
- Trasferire 200 µ l di ogni campione di plasma manualmente per separare pozzetti di una piastra di profondo-pozzo (piatto del campione), di 1,1 mL e centrifugare la piastra in una centrifuga per 10 min a 2 ° C e 1278 x g.
- Utilizzare un liquido automatizzato sistema di movimentazione in serie diluire una soluzione standard di 500 fmol / µ l Ang I NAT per preparare sei calibratore soluzioni con l'albumina del bianco d'uovo di pollo (0,1, 0,2, 0,6, 1,9, 5.7, 17,2 fmol / µ l).
- Pipetta 200 µ l di ciascun calibratore a un bene e 125 µ l di generazione buffer per piastra campione.
Nota: Il CIPRACCA in fosfato tampone soluzione salina tamponata (PBS) deve essere preparata il giorno dell'esperimento. - Usa un liquido automatizzato sistema di movimentazione, in una nuova piastra mescolare 125 µ l di plasma surnatante o 125 µ l di CIPRACCA in PBS con 25 µ l di Ang I buffer di generazione, che contiene 1 M Tris, acido etilendiamminotetracetico 0,2 mM (ed) e 1 mM fluoruro di phenylmethylsulfonyl (PMSF).
Nota: Preparare il Ang I buffer di generazione mescolando un tampone acquoso 1m Tris/0,2 mM EDTA (regolare a pH 5.5 utilizzando acido acetico) e una soluzione PMSF (100 mM in metanolo). Entrambe le soluzioni possono essere conservate fino a 1 mese a soluzioni di mescolare i due 4 ° C. il giorno dell'esperimento. - Trasferire automaticamente le soluzioni in una piastra a 96 pozzetti, 3 ripetizioni per soluzione, 34 µ l per pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 3 h.
2. Immuno-arricchimento di Ang ho perline rivestite con anticorpo usando
- coniugazione dell'anticorpo su biglie magnetiche di proteina G
Nota: coniugazione dell'anticorpo con le perline viene eseguita manualmente durante i 3 h Ang I periodo di generazione sul giorno dell'esperimento. Per altri analiti, i branelli coniugati potrebbero essere in grado di essere memorizzati nel buffer di PBS contenente 0.015% CHAPS (PBSC) a 4 ° C per tre mesi o più, a seconda della proprietà e la stabilità dell'anticorpo.- Trasferimento 110 µ l di liquami perlina (sufficiente per 20 campioni di misura e facendo una curva standard di 6 punti) in una provetta da 1,5 mL. Lavare le perle sette volte con 1 mL di acetonitrile/PBSC 25% e tre volte con 1 mL di PBSC. Utilizzare un supporto magnetico per appallottolare le perline tra ogni fase di lavaggio. Rimuovere il tampone di lavaggio dopo l'ultimo nello stato di Washington
Nota: Lavaggio 7 volte con 25% acetonitrile/PBSC è critico per la rimozione degli additivi di MS-incompatibile nel liquame tallone, come Tween-20. Se non esistono nessun tali additivi nelle perle selezionate, questa fase di lavaggio estesa potrebbe non essere necessaria. - Risospendere le sfere in 110 µ l di PBSC e 110 µ l di anti-Ang ho anticorpo (concentrazione finale: 100 µ g/mL). Miscelare la soluzione e perline pipettando e poi li Incubare a temperatura ambiente per 1 h, rotante a 8 giri/min.
- Lavare le perle 3 volte con 1 mL di PBSC e risospendere in 1100 µ l di PBSC.
Nota: Se qualsiasi soluzione perlina ha fluito nel tappo del tubo durante l'incubazione, girare giù la soluzione utilizzando una centrifuga da banco a 2680 x g. - Trasferire la soluzione perlina manualmente in una piastra a 96 pozzetti (piastra standard con nervature). Utilizzare il liquido automatizzato sistema ad aliquota di movimentazione le perline per la stessa piastra a 96 pozzetti, 120 µ l per pozzetto.
- Trasferimento 110 µ l di liquami perlina (sufficiente per 20 campioni di misura e facendo una curva standard di 6 punti) in una provetta da 1,5 mL. Lavare le perle sette volte con 1 mL di acetonitrile/PBSC 25% e tre volte con 1 mL di PBSC. Utilizzare un supporto magnetico per appallottolare le perline tra ogni fase di lavaggio. Rimuovere il tampone di lavaggio dopo l'ultimo nello stato di Washington
- Immuno-arricchimento sui branelli
- dopo la h 3 Ang periodo di generazione, metto la piastra di incubazione su ghiaccio per 10 min terminare la generazione di I. Ang
- Automaticamente diluire la soluzione di riserva del peptide SIS (10 pmol/μL) 100 volte con PBS buffer e in seguito automaticamente aliquota alla diluizione standard peptide yannick2k stabile una piastra PCR a 96 pozzetti. Trasferire 1,5 µ l di una soluzione di peptide standard (SIS) di isotopo stabile (contenente 100 fmol) in ciascun pozzetto della piastra incubazione e mescolare con i campioni di plasma o CIPRACCA nei buffer di PBS.
- Automaticamente trasferire il contenuto della piastra incubazione alla soluzione perlina, 10ml per bene, mescolare.
- Incubare la piastra a 4 ° C per 1 h durante la rotazione a 8 giri/min.
- Lavare le perle tre volte automaticamente con soluzione di bicarbonato di ammonio (AmBic) 5 mM, 100 µ l per pozzetto a lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 7 µ l di 5mm AmBic soluzione in ciascun pozzetto. Utilizzare un magnete per tirare i talloni verso il basso dopo l'ultimo nello stato di Washington
3. Trasferimento di perline su una piastra MALDI e aggiunta di soluzione di Matrix
- Transfer 7 µ l del liquame perlina automaticamente su un piatto di destinazione MALDI con un formato di punto di 2.600 µm. Lasciate asciugare i branelli.
Nota: Un piccolo ventilatore alimentato USB può essere utilizzato per accelerare il tallone processo di secchezza. - Automaticamente aggiungere 2 µ l di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (HCCA)-soluzione a matrice (che contiene 3 mg/mL HCCA, citrato di ammonio di 1,8 mg/mL, acetonitrile 70% e 0,1% di acido trifluoroacetico) dalla matrice bene su ogni campione posto sulla piastra di destinazione .
4. Acquisizione di un MALDI-TOF-MS e analisi dei dati del segnale
- analizza il campione macchie con uno strumento di MALDI-TOF utilizzando la modalità di reflector positivo. Eseguire la calibrazione interna, dati levigante e sottrazione della linea di base automaticamente con software specifici del fornitore.
Nota: La modalità (positivo/negativo, lineare/riflettore) selezionata per misurazione di MALDI-TOF dipende la destinazione peptidi o proteine. - Calcolare il rapporto di risposta relativa (rapporto di intensità di Nat/SIS) e confrontarlo con la curva standard per determinare del Ang ho concentrazione in ciascun campione. Calcolare PRA tramite l'equazione (1), dove Δt Ang ho generazione rappresenta il tempo utilizzato per la generazione di I. Ang
PRA = [Ang ho] / Δt Ang ho generazione (1)
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Representative Results
Una procedura automatizzata iMALDI per la misurazione Ang mi è mostrato nella Figura 1. Peptidi di destinazione (peptidi endogeni o peptidi da proteine digerite) sono arricchite il anti-peptide biglie magnetiche, e quindi le perle vengono trasferite ad una piastra di destinazione per la misura di MALDI. L'intera procedura è semplificata rispetto ad altre tecnologie di immuno-MS che richiedono ulteriori peptide eluizione passaggi. Automazione del dosaggio iMALDI permette analisi di alto-rendimento di un gran numero di campioni con un Inter-giorno di coefficiente di variazione (CV) in meno di 10% 20. Rappresentante spettri ottenuti misurando Ang ho in campioni di plasma umano è illustrato nella Figura 2. La funzione di peptidi SIS come standard interno per la quantificazione del peptide. Correlazione dei valori PRA da 188 campioni ottenuti con il dosaggio automatizzato iMALDI con PRA valori ottenuti utilizzando un clinico di routine di LC-MS/MS17 è mostrato nella Figura 3. I due metodi hanno un coefficiente di correlazione di 0,98; la differenza tra le piste potrebbe essere causata dall'utilizzo di diversi standard interni nei due metodi, o mediante l'uso di anticorpi differenti in iMALDI procedura20. La gamma lineare di dosaggio e la precisione di dosaggio sono mostrati in Figura 4 e Figura 5.
Figura 1: Schema di flusso di processo di un'analisi PRA iMALDI automatizzato. Adattato da riferimento20, con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentante spettri del NAT e SIS Ang I peptidi misurato da un campione di plasma umano.
Figura 3: Correlazione di PRA valori misurati da iMALDI e da LC-MS/MS da 188 campioni. Adattato da riferimento20, con permesso.
Figura 4: Gamme lineari del dosaggio PRA iMALDI riflettore (A) sia in modalità lineare (B). Adattato da riferimento20, con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Intraday precisione (A) e la precisione interday (B) di saggi PRA iMALDI su pool di plasma con i valori PRA di bassa, medi e alti. Adattato da riferimento20, con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Rispetto alla quantificazione di proteine convenzionali basati su MS, iMALDI utilizza anticorpi per arricchire gli analiti e purificarle da campioni complessi, rendendo quindi possibile quantificare le proteine o peptidi a basse concentrazioni. Un passo fondamentale nel protocollo iMALDI è l'immuno-arricchimento dei peptidi destinazione. Per questo scopo, è necessario selezionare anticorpi con alta specificità e affinità. In SISCAPA, è stato segnalato che affinità dell'anticorpo a 10-9 M o meglio sarebbe necessaria per raggiungere alta sensibilità alle basse ng/mL21. Inoltre, perline con capacità di legame dell'anticorpo alta sono preferiti per arricchimento ottima.
È anche importante generare spettri relativamente "puliti" per le molecole bersaglio con livelli minimi di fondo. Alti rapporti segnale-rumore possono essere raggiunto attraverso vasto perlina lavaggio dopo la fase di immuno-arricchimento. Inoltre, abbiamo scoperto che lavare le macchie di tallone sulla piastra di destinazione dopo l'aggiunta e la soluzione di matrice di essiccazione può ridurre in modo significativo i segnali di rumore e migliorare così i rapporti segnale-rumore.
Il dosaggio PRA iMALDI ha dimostrato in questo lavoro non richiede la procedura di proteolisi, come la molecola bersaglio Ang I è un peptide. Per quantificare le molecole di proteina in un campione, la proteina in genere viene digerita in peptidi prima immuno-arricchimento, anche se per peptidi contenenti epitopo, la digestione può essere eseguita sulle proteine catturate22,23. In questo caso, un protocollo di digestione della proteina esistente può essere facilmente inserito nel flusso di lavoro iMALDI. A seconda del buffer di digestione, un passo di dissalazione potrebbe essere necessario prima della cattura dei peptidi perline, per evitare interferenze con il grippaggio dell'anticorpo-peptide.
Simili ad altri metodi di immuno-MS, produzione di anticorpi anti-peptide è una sfida importante nello sviluppo di saggi iMALDI. Recentemente, la tecnologia Triple X proteomica è stata sviluppata per produrre leganti di affinità che possono mirare più peptidi per Raccoglitore24. Questo può ridurre il costo degli anticorpi anti-peptide e faciliterebbe lo sviluppo di saggi multiplex simultanei utilizzando una singola incubazione. Inoltre, frammenti di anticorpo25 o sintetico aptameri26 potrebbe essere alternative all'uso di anticorpi intatti e avrebbe il vantaggio di più facile produzione. Aptameri sintetici sono stati segnalati come risultati più bassi livelli di sfondo che gli anticorpi intatti quando utilizzato per affinità-arricchimento26.
iMALDI tecnologia combina i vantaggi di test immunologici con spettrometria di massa MALDI, consentendo l'analisi rapida, ad alta produttività peptide/della proteina in un gran numero di campioni complessi, con elevata sensibilità e specificità. A differenza di altri metodi di immuno-MS, dopo immuno-cattura, il bersaglio peptidi non sono eluiti nel tubo, ma le perline che trasportano analiti vengono trasferiti sulla piastra bersaglio MALDI per MS-analisi, evitando così la perdita di peptidi a causa loro adsorbimento alla plastica tubi. Rispetto a strumenti di proteomica ampiamente usato come macchia occidentale o ELISA, un solo anticorpo è necessaria in iMALDI, riducendo significativamente i tempi di sviluppo di test e i costi. Il limite inferiore di rilevamento che abbiamo ottenuto nel test PRA è paragonabile a ELISA convenzionale e ben all'interno della gamma fisiologica. L'anticorpo e il rapporto massa / carica fornire un processo di doppia selezione, che assicura l'elevata specificità del dosaggio. Le applicazioni di iMALDI non è limitate ai saggi di PRA, ma può essere applicato per la quantificazione di qualsiasi espressione di proteina e la quantificazione anche della modificazione di proteine in campioni complessi. In particolare, il iMALDI automatizzati ad alta velocità potrebbe essere un potente strumento clinico per la scoperta e validazione di biomarkers proteici in una varietà di malattie, a causa della presenza di benchtop MALDI strumenti attualmente utilizzati nelle cliniche per batterico identificazione.
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Disclosures
C.H.B detiene il brevetto sulla tecnologia iMALDI.
Acknowledgments
Ringraziamo il sostegno finanziario dal Genome Canada e Colombia britannica del genoma per operazioni (204PRO) e lo sviluppo della tecnologia (214PRO) attraverso la rete di innovazioni genoma (GIN). Ringraziamo la piattaforma di Drug Discovery presso l'Istituto di ricerca del McGill University Health Center per l'utilizzo dello strumento MALDI-TOF per le riprese. H.L. è grato per il sostegno da una borsa di studio post-dottorato dal National Science and Engineering Research Consiglio del Canada (NSERC). C.H.B è grato per il sostegno da Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. è grato per il sostegno della presidenza di McGill Segal in oncologia molecolare presso la McGill University (Montreal, Quebec, Canada). M.X.C. e C.H.B. sono grato per il sostegno del Warren Y. Soper Charitable Trust e la Fondazione di famiglia di Alvin Segal per l'ospedale generale ebreo (Montreal, Quebec, Canada).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
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