Summary
Se presenta un protocolo para la cuantificación de proteínas en fluidos biológicos complejos utilizando tecnología automatizada inmuno-MALDI (iMALDI).
Abstract
Espectrometría de masas (MS) es una de las tecnologías más utilizadas para la cuantificación de proteínas en muestras complejas, con la especificidad del ensayo excelente como resultado de la detección directa de la relación masa / carga de cada molécula de la blanco. Sin embargo, proteómica basada en la MS, como la mayoría otras técnicas analíticas, tiene un sesgo hacia la medición de analitos de alta abundancia, por lo que es un reto a alcanzar límites de detección bajos ng/ml o pg/mL en muestras complejas y esto es el intervalo de concentraciones para muchos proteínas enfermedad relevante en biofluidos como plasma humano. Para ayudar en la detección de analitos de baja abundancia, inmuno-enriquecimiento ha sido integrado en el ensayo para concentrar y purificar la sustancia a analisar antes de medición MS, mejorando significativamente la sensibilidad del ensayo. En este trabajo, la tecnología de inmuno - mediante desorción/ionización del Laser (iMALDI) es presentada para la cuantificación de proteínas y péptidos en biofluidos, basada en inmuno-enriquecimiento en granos, seguida por MALDI-MS medida sin previa elución. Los anticuerpos anti péptidos son funcionalizados en bolas magnéticas y se incubaron con muestras. Después del lavado, los granos son transferidos directamente en un plato blanco MALDI y las señales son medidas por un MALDI-tiempo de instrumento de vuelo (MALDI-TOF) después de la solución de la matriz se ha aplicado a los granos. Se simplifica el procedimiento de preparación de la muestra en comparación con otros ensayos inmuno-MS, y la medición de MALDI es rápida. La preparación de toda la muestra se automatiza con un líquido, manejo del sistema, con mayor rendimiento y mejor reproducibilidad. En este artículo, el ensayo de iMALDI se utiliza para determinar la angiotensina péptido I (Ang I) concentración en el plasma, que se utiliza clínicamente como lectura de la actividad de renina plasmática para la detección del aldosteronism primario (PA).
Introduction
Espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta indispensable en proteómica cuantitativa. Espectrometría de masas puede determinar las masas de blanco proteínas o péptidos, por lo tanto las señales del analito obtenido pueden ser altamente específicas en comparación con los inmunoensayos. Dos métodos de ionización por electrospray y MALDI, comúnmente se utilizan para la detección de proteínas y péptidos1,2,3,4. Un desafío importante en la cuantificación de la proteína basada en MS radica en la detección de proteínas de baja abundancia en muestras complejas en las concentraciones de ng/mL o pg/mL en presencia de proteínas de alta abundancia, y muchos candidatos biomarcadores de proteínas encontradas plasma humano son dentro de esta gama5. Este problema es causado en gran parte por el inherentemente amplio rango dinámico y la complejidad del proteoma humano6.
Para superar estos desafíos de detección, se han desarrollado métodos inmuno-MS para enriquecer el objetivo proteínas o péptidos de las soluciones de la muestra sobre una superficie sólida, seguido por elución de los analitos y MS medida7,8 , 9 , 10. a través del enriquecimiento de inmuno, se purifican los analitos de muestras complejas y por lo tanto se reducen al mínimo los efectos del ion-supresión de otras moléculas. Entre diferentes soportes sólidos, bolas magnéticas son actualmente más utilizados ya que tienen las ventajas de la capacidad de unión de anticuerpos alto y facilidad de manejo. Granos magnéticos con diferentes functionalizations y tamaños se han desarrollado y comercializado para los experimentos de inmunoprecipitación. Hasta la fecha, inmuno-enriquecimiento en granos ha sido interconectado con ionización por electrospray (ESI) y MALDI-MS para la medición de proteínas y péptidos. En normas de isótopos estables y captura por la tecnología de los anticuerpos anti péptido (SISCAPA), son digeridas proteínas en las muestras, seguido por la incubación con los granos recubiertos de anticuerpos inmuno-enriquecimiento. En SISCAPA "clásico", los péptidos de proteotypic capturados son eluidos de los granos y mide por líquido cromatografía-ESI-MS (LC-MS), o por infusión directa ESI-múltiple reacción monitoreo-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Inmuno-enriquecimiento mejoró la sensibilidad del ensayo MRM en 3-4 órdenes de magnitud, alcanzando los bajos ng/mL rango13.
En comparación con electrospray-MS, MALDI-MS es más rápido y no involucra la limpieza y volver a equilibrar columnas LC por lo que no existen problemas contaminación cruzada y la contaminación, lo que es más adecuado para estudios de alto rendimiento14. Inmuno-MALDI tecnología ha sido desarrollada en nuestro laboratorio para combinar inmuno-enriquecimiento con MALDI-MS para la cuantificación sensible y específica de péptidos y proteínas (basadas en la cuantificación de péptidos proteotypic)15,16 ,17. Después de inmuno-enriquecimiento, los granos se depositan en una placa de destino de MALDI, la solución de la matriz se agrega a los granos y la placa está lista para el análisis por MALDI-TOF-MS después del secado. Elución de los péptidos de los granos no se realiza como un paso separado, pero afinidad-limite los analitos se eluyen por la solución de matriz MALDI cuando se añade a los puntos de grano, lo que simplifica la preparación de la muestra y minimizar la pérdida de muestra. La tecnología iMALDI se ha aplicado en una variedad de aplicaciones18,19y recientemente ha sido automatizada y utilizado para medir la angiotensina I (Ang I) para la determinación de la actividad (PRA) de renina de plasma20. Este Protocolo será demostrar el procedimiento utilizado para realizar un análisis automatizado iMALDI. Tomando el ensayo PRA como ejemplo, CV interdía de menos del 10% se han logrado gracias a la automatización, con la capacidad de medición de las 744 muestras por día20.
El ensayo PRA iMALDI demostrado en este manuscrito no requiere digestión de proteínas, como la molécula objetivo (Ang I) es un péptido con un peso molecular de 1295.7 Da. En otros ensayos donde hay digestión de proteína y un péptido es utilizado como el sustituto de la proteína intacta, el péptido seleccionado para iMALDI debe ser único y específico a la proteína diana, con una masa más de 800 Da para que ello puede distinguirse fácilmente de la c hemical ruido de la solución de matriz MALDI. Anticuerpos anti péptidos son necesarios para el inmuno-enriquecimiento de los péptidos. El protocolo de un ensayo de iMALDI medición PRA consta de cuatro pasos: 1) generación de Ang I en plasma humano; 2) inmuno-enriquecimiento de Ang I utilizando granos recubiertos de anticuerpos; 3) transferencia de granos a una placa de destino de MALDI y agregar solución de matriz; y 4) adquisición de la señal por un MALDI-TOF-MS y los datos de análisis20.
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Protocol
las cantidades de los reactivos que se describen a continuación se basan en la medición de muestras de plasma paciente 20. El protocolo presentado a continuación sigue las directrices de la Universidad de Victoria ' Comité de ética de investigación de s.
1. generación de la Ang I en Plasma humano
- descongelar las muestras de plasma (≥ 200 μL) en una sala de temperatura agua baño durante 5 minutos y luego coloque las muestras en hielo hasta completamente descongelada.
- Transfiera 200 μL de cada muestra de plasma manualmente para separar pocillos de una placa de la pozo profundo de 1.1 mL (placa de la muestra) y centrifugar la placa en una centrifugadora durante 10 minutos a 2 ° C y 1278 x g.
- Use un automatizado sistema para manejo de líquidos para diluir en serie 500 fmol/μl Ang I NAT solución patrón para preparar seis soluciones de calibrador con la albúmina de la clara de huevo de pollo (0.1, 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, 17.2 fmol/μL).
- Pipeta de 200 μL de cada calibrador para un bien y 125 μl de generación tampón de placa de la muestra.
Nota: El CEWA en fosfato buffer de solución salina tamponada (PBS) tiene que ser recién preparado en el día del experimento. - Utilizando un líquido automatizado sistema de manejo, en un nuevo plato mezclar 125 μl de plasma sobrenadante o 125 μl de CEWA en PBS con 25 μl de Ang I buffer de generación, que contiene 1 M Tris, ácido etilendiaminotetracético de 0,2 mM (EDTA) y 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF).
Nota: Preparar la Ang I buffer generación mezclando un tampón acuoso de 1 M Tris/0.2 mM EDTA (ajustado a pH 5.5 con ácido acético) y una solución PMSF (100 mM en metanol). Ambas soluciones pueden almacenarse 1 mes en soluciones de mezcla los dos de 4 ° C. en el día del experimento. - Transferir automáticamente las soluciones en una placa de 96 pocillos, 3 repeticiones por solución, 34 μl por pocillo. Incubar la placa a 37 ° C por 3 h.
2. Inmuno-enriquecimiento de Ang I granos recubiertos de anticuerpos usando
- conjugación del anticuerpo en granos magnéticos de la proteína G
Nota: Conjugación del anticuerpo con los granos se realiza manualmente durante la 3 h de Ang I período de generación en el día del experimento. Para otros analitos, los granos conjugados podrían ser capaces de almacenar en buffer de PBS que contiene 0,015% CHAPS (PBSC) a 4 ° C durante tres meses o más, dependiendo de las propiedades y estabilidad del anticuerpo.- Transferencia 110 μl de mezcla de grano (suficiente para 20 muestras de medición y haciendo una curva estándar de 6 puntos) en un tubo de 1,5 mL. Lavar los granos siete veces con 1 mL de acetonitrilo/PBSC de 25% y tres veces con 1 mL de PBSC. Utilizar un soporte magnético para que sedimenten los granos entre cada paso de lavado. Eliminar el tampón de lavado después de la última Washington
Nota: Lavarse 7 veces con 25% acetonitrilo/PBSC es fundamental para eliminar los aditivos incompatibles con la MS en la mezcla de grano, como Tween-20. Si no hay estos aditivos en los granos seleccionados, este paso de lavado amplia podría no ser necesario. - Suspender los granos en 110 μl de PBSC y añadir 110 μl de anti-Ang anticuerpo (concentración de anticuerpos final: 100 μg/mL). Mezclar los granos de la solución mediante pipeteo y entonces les incube a temperatura ambiente durante 1 h, rotación en rpm 8.
- Lave los granos 3 veces con 1 mL de PBSC y resuspender en 1100 μl de PBSC.
Nota: Si cualquier solución de grano ha fluido en la tapa del tubo durante la incubación, girar por la solución utilizando una centrífuga de sobremesa a 2680 x g. - Transferir la solución grano manualmente a una placa de 96 pocillos (placa estándar del grano). Utilizar el líquido automatizado manejo sistema de alícuota los granos a la misma placa de 96 pocillos, 120 μl por pozo.
- Transferencia 110 μl de mezcla de grano (suficiente para 20 muestras de medición y haciendo una curva estándar de 6 puntos) en un tubo de 1,5 mL. Lavar los granos siete veces con 1 mL de acetonitrilo/PBSC de 25% y tres veces con 1 mL de PBSC. Utilizar un soporte magnético para que sedimenten los granos entre cada paso de lavado. Eliminar el tampón de lavado después de la última Washington
- inmuno-enriquecimiento en las cuentas
- después de la 3 h Ang período de generación, colocar la placa de incubación en hielo durante 10 min terminar la generación de Ang I.
- Automáticamente diluya la solución stock del péptido SIS (10 pmol/μL) 100-fold con PBS buffer y automáticamente más alícuota la dilución estándar péptido de isoptope estable a una placa PCR de 96 pocillos. Transferir 1,5 μl de una solución de péptido de normas (SIS) de isótopos estables (contiene 100 fmol) en cada pocillo de la placa de incubación y se mezcla con las muestras de plasma o el CEWA buffers PBS.
- Automáticamente transferir el contenido de la placa de incubación para la solución de grano, 10 mL por pocillo, mezclar el.
- Incubar la placa a 4 ° C durante 1 hora mientras gira a rpm 8.
- Lave los granos tres veces automáticamente con una solución de bicarbonato de amonio (AmBic) de 5 mM, 100 μl por pozo por lavado. Después del último lavado, suspender las cuentas en 7 μl de 5 mM AmBic solución en cada pocillo. Use un imán para tirar los granos al fondo después de la última Washington
3. Transferencia de granos en un plato de destino MALDI y agregar solución de matriz
- Transfer 7 μl de la mezcla de grano automáticamente en un plato de destino MALDI con un tamaño de punto de 2.600 μm. Deje secan los granos de.
Nota: Un pequeño ventilador alimentado por USB se puede utilizar para acelerar el proceso de secado del grano. - Añadir 2 μl de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA)-solución de matriz (que contiene 3 mg/mL HCCA, citrato de amonio de 1,8 mg/mL, 70% de acetonitrilo y 0.1% de ácido trifluoroacético) de la matriz bien sobre cada muestra en la placa de la blanco .
4. Adquisición por un MALDI-TOF-MS y análisis de los datos de la señal
- analizar la muestra de puntos con un instrumento de MALDI-TOF usando el modo de reflector positivo. Realizar la calibración interna, suavizado de datos y sustracción instantánea automáticamente con el software específico del proveedor.
Nota: El modo (positiva/negativa, lineal/reflector) seleccionado para la medición de MALDI-TOF depende el destino péptidos o proteínas. - Calcular el cociente de respuesta relativa (cociente de la intensidad de Nat/SIS) y se compara con la curva estándar para determinar de la Ang I concentración en cada muestra. Calcular PRA utilizando la ecuación (1), donde Δt Ang I generación representa el tiempo utilizado para la generación de Ang I.
PRA = [Ang I] / Δt Ang I generación (1)
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Representative Results
Un procedimiento automatizado iMALDI para medir Ang se muestra en la figura 1. Péptidos de destino (péptidos endógenos o péptidos de las proteínas digeridas) están enriquecidos en bolas magnéticas anti péptidos, y luego los granos se transfieren a una placa de la blanco para la medición de MALDI. Todo el procedimiento se simplifica en comparación con otras tecnologías inmuno-MS que requieren pasos de elución de péptido adicional. Automatización del ensayo iMALDI permite el análisis de alto rendimiento de un gran número de muestras con un día entre coeficiente de variación (CV) por debajo de 10% 20. Representante de espectros obtenidos mediante la medición de la Ang I en muestras de plasma humano se muestra en la figura 2. La función de péptidos SIS como estándar interno para la cuantificación del péptido. Correlación de valores PRA de 188 pacientes muestras obtenidas con el ensayo de iMALDI automatizado con PRA los valores obtenidos mediante el uso de un clínico de procedimiento de la LC-MS/MS17 se muestra en la figura 3. Los dos métodos tienen un coeficiente de correlación de 0.98; la diferencia entre las vertientes ocasionada por el uso de diferentes normas internas en los dos métodos, o por el uso de diferentes anticuerpos en iMALDI procedimiento20. Lineal entre el ensayo y la precisión del ensayo se muestran en la figura 4 y figura 5.
Figura 1: Esquema de flujo de proceso de un ensayo PRA automatizado iMALDI. Adaptado de referencia20, con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Espectros representativos de la NAT y SIS Ang péptidos medición de una muestra de plasma humano.
Figura 3: Correlación de PRA valores medidos por iMALDI y por LC-MS/MS de las muestras del paciente 188. Adaptado de referencia20, con permiso.
Figura 4: Rangos lineales del ensayo PRA iMALDI reflector (A) y (B) de modo lineal. Adaptado de referencia20, con permiso de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Precisión intradía (A) y (B) de la precisión de iMALDI PRA ensayos en piscinas del plasma con valores PRA de baja, medianos y altos. Adaptado de referencia20, con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En comparación con la cuantificación de proteína convencional basada en MS, iMALDI utiliza anticuerpos para enriquecer los analitos y purificarlos de muestras complejas, por lo tanto, lo que permite cuantificar proteínas o péptidos en bajas concentraciones. Un paso crítico en el protocolo de iMALDI es inmuno-enriquecimiento de los péptidos de destino. Para ello, se deben seleccionar anticuerpos con alta especificidad y afinidad. En SISCAPA, se ha divulgado que las afinidades de anticuerpo en el 10-9 M o mejor sería necesaria para lograr gran sensibilidad en ng/mL baja21. Además, cuentas con la capacidad de unión del anticuerpo alto se prefieren para enriquecimiento óptima.
También es importante generar espectros relativamente "limpios" para las moléculas objetivo con niveles mínimos. Altos cocientes signal-to-noise pueden lograrse a través de extenso grano lavado después del paso de inmuno-enriquecimiento. También, hemos encontrado que lavar las manchas de grano en la placa de la blanco después de agregar la solución matriz de secado reducen significativamente las señales de ruido y mejorar así los cocientes signal-to-noise.
El ensayo PRA iMALDI demostrado en este trabajo no requiere de los pasos de la proteólisis, como la molécula objetivo Ang I es un péptido. Para cuantificar moléculas de la proteína en una muestra, la proteína es digerida normalmente en péptidos antes inmuno-enriquecimiento, aunque para péptidos que contienen epítopos, la digestión puede realizarse en la proteína capturado22,23. En este caso, un protocolo de digestión de proteína existente pueda ser insertado fácilmente en el flujo de trabajo de iMALDI. Según el buffer de digestión, un paso desalinización podría necesitarse antes de captura de los péptidos en los granos, para evitar interferencias con el atascamiento del anticuerpo péptido.
Similar a otros métodos de inmuno-MS, producción de anticuerpos contra péptidos es un desafío importante en el desarrollo de ensayos iMALDI. Recientemente, la tecnología Triple X proteómica se ha desarrollado para producir aglutinantes de afinidad que pueden atacar varios péptidos por carpeta24. Esto puede reducir el costo de los anticuerpos anti péptidos y facilitaría el desarrollo de ensayos multiplexados simultánea mediante una incubación única. También, fragmentos de anticuerpo25 o aptámeros sintéticas26 podrían ser alternativas para el uso de anticuerpos intactos y tendría la ventaja de la producción más fácil. Aptámeros sintéticos se han divulgado como una muestra de menores niveles de fondo que anticuerpos intactos cuando se utiliza para enriquecimiento de afinidad26.
iMALDI tecnología combina las ventajas de inmunoensayos con espectrometría de masas MALDI, que permite el análisis rápido, alto rendimiento proteína/péptido en un gran número de muestras complejas, con alta sensibilidad y especificidad. A diferencia de otros métodos de inmuno-MS, después de inmuno-capturar, el objetivo de péptidos no se eluyen en el tubo, pero los granos de analitos que se transfieren en la placa de destino MALDI MS-análisis, evitando así la pérdida de péptidos debido a su adsorción a plástico tubos. En comparación con herramientas de proteómica ampliamente utilizado como western blot o ELISA, sólo un anticuerpo es necesaria en iMALDI, reduciendo significativamente el tiempo de desarrollo del ensayo y el costo. El límite inferior de detección que hemos obtenido en el ensayo PRA es comparable a ELISA convencional y bien dentro del rango fisiológico. El anticuerpo y la relación masa a carga proporcionan un proceso de doble selección, que asegura la alta especificidad de la prueba. Aplicaciones de iMALDI no se limita a ensayos PRA, pero puede ser aplicado para la cuantificación de cualquier expresión de la proteína y cuantificación incluso de modificación de la proteína en muestras complejas. En particular, el iMALDI automatizado de alto rendimiento podría ser una herramienta clínica para el descubrimiento y validación de biomarcadores de proteínas en una variedad de enfermedades, debido a la presencia de benchtop MALDI instrumentos actualmente utilizados en clínicas para bacterias identificación.
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Disclosures
C.H.B posee la patente sobre la tecnología iMALDI.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo financiero del genoma Canadá y Columbia Británica de genoma para operaciones (204PRO) y desarrollo de la tecnología (214PRO) a través de la red genoma de innovaciones (Ginebra). Agradecemos a la plataforma de descubrimiento de droga en el Instituto de investigación del centro de salud de la Universidad McGill para el uso del instrumento MALDI-TOF para la filmación. H.L. está agradecido por apoyo de una beca postdoctoral de la National Science and Engineering Research Consejo de Canadá (NSERC). C.H.B está agradecida por el apoyo del fondo de dotación de vanguardia (LEEF). C.H.B. está agradecido por apoyo de la Presidencia de McGill Segal en Oncología Molecular en la Universidad McGill (Montreal, Quebec, Canadá). M.X.C. y C.H.B. son agradecidos por apoyo de Warren Y. Soper Charitable Trust y la Fundación de familia de Segal de Alvin en el Hospital General judío (Montreal, Quebec, Canadá).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
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