Summary
פרוטוקול להקמת מודל עכבר מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס על ידי זיהום adeno-cre קטע ו מעקב שלה באמצעות קולונוסקופיה ברזולוציה גבוהה מוצג.
Abstract
למרות היתרונות של תחולת קל ויעילות עלות, מודלים של סרטן המעי הגס המעי הגס המבוססים על הזרקת תאים סרטניים יש מגבלות חמורות ולא מדויק המדמה גידול ביולוגיה גידול תאים סרטניים. מודלים עכבר מהונדסים גנטית הוכנסו כדי להתגבר על מגבלות אלה; עם זאת, מודלים כאלה דורשים מבחינה טכנית, במיוחד באיברים גדולים כגון המעי הגס שבו רק גידול אחד הוא הרצוי.
כתוצאה מכך, פותח מודל עכבר מהונדס גנטית, מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס, אשר מפתחת גידולים אחידים מאוד וניתן להשתמש בו ללימודי ביולוגיה של הגידול, כמו גם ניסויים טיפוליים. פיתוח הגידול הוא יזמה על ידי זיהום כירורגי, מקטעי של המעי הגס דיסטלי עם וירוס adeno-cre בעכברים מוטציה מותנה מותנה. גידולים ניתן לזהות בקלות ובקרה באמצעות קולונוסקופיה. אנו מתארים כאן את הטכניקה הכירורגית של זיהום אדגנו-קריטיאת המעי הגס, את מעקב אחר הגידול באמצעות קולונוסקופיה ברזולוציה גבוהה ולהציג את גידולים המעי הגס וכתוצאה מכך.
Introduction
סרטן המעי הגס (CRC) ממשיך להיות אחד הגורמים המובילים למוות הקשור לסרטן במדינות המערב. 1 בעוד שהפרוגנוזה של מטופלים בשלב מוקדם של המחלה טובה, גידולים רבים מאובחנים בשלבים מאוחרים יותר, שלמרות אפשרויות הטיפול הרבות, הפרוגנוזה מוגבלת. 2 , 3 , 4 , 5
רוב המודלים עכבר הנוכחי של CRC מבוססים על ההשתלה של תאים סרטניים נגזר שורות תאים או גידולים החולה לעכברים immunodeficient. 6 , 7 , 8 זה מוביל המקומי, בהתאם לאתר ההזרקה ואת תאים סרטניים המשמשים להזרקת, לפעמים גידולים גרורתי. 9 , 10 עם זאת, מודלים xenograft וכתוצאה מכך יש majoR מגבלות. הם חייבים להיות הוקמה בעכברים immunodeficient, ובכך לחסל את האינטראקציה המורכבת בין הגידול לבין המערכת החיסונית המארחת. בנוסף, כמו stroma הגידול נגזר תאים המארח, האינטראקציה בין parenchyma הגידול האנושי stroma הגידול הוא פגום ולכן לא נציג של המחלה. ליקויים אלה ניתן להימנע על ידי שימוש שורות תאים Murine עבור הזרקת. עם זאת, רק כמה תאים Murine תא CRC זמינים, בדומה לקווים התא האנושי CRC ביותר זמינים, הם חד שבטיים ו anaplastic. 11 לסיכום, רוב הדגמים עכבר CRC זמין כיום הם מלאכותיים מאוד ולא נציג מלא של המחלה האנושית.
מודלים עכבר מהונדסים גנטית (GEMM) של CRC יכולים למנוע את החסרונות הללו כאשר הם מכילים גידולי עכבר אמיתיים אשר נוצרים באמצעות אינדוקציה של מוטציות מפתח של CRC במעי הגס. 12 , 13 ,14 זה יכול להיות מושגת על ידי הפעלת מוטציות גרמלין מותנה (floxed) germline ידי recombinase cre בתוך רירית המעי הגס. בעוד GEMMs של גופים רבים אחרים של הגידול germline (inducible) ביטוי ביטוי מונע על ידי מקדמי רקמה ספציפי משמש, germline cre לא ניתן להשתמש במעי הגס כמו זה מוביל למספר רב של אדנומות ברחבי המעי הגס גרימת מוות על ידי עומס הגידול שפיר ב גיל צעיר מאוד. לכן, במודל המתואר כאן וקטור adenoviral להביע Cre משמש להדביק קטע המעי הגס קצר. זה מוביל את אינדוקציה של tumorigenesis בתוך קטע זה של רירית בנקודת זמן שהוגדר על ידי החוקר, וכתוצאה מכך אדנומות בסופו של דבר מתקדמים קרצינומה פולשנית וגרורות. הגידולים הם גידולים אמיתיים של העכבר, לגדול microenvironment שלם ולכן הם מסוגלים לדמות את מכלול של oncogenesis המעי הגס כולל אינטראקציה המארח הגידול ואת מפל גרורתי. מודל זה הואולכן פלטפורמה אטרקטיבית למחקרים על ביולוגיה של סרטן ומחקרים פרה-קליניים.
החסרון העיקרי של מודלים עכבר מהונדסים גנטית של CRC הוא המורכבות הטכנית שלהם. לידה מקומית באמצעות חוקנים אדקטו-קיציים בעכברים שנשאו אללים של Apc מתפוררים תוארה בעבר; עם זאת, שכיחות, ריבוי ומיקום של גידולים המעי יכול להיות משתנה מאוד עם טכניקה זו. 15 לכן, הטכניקה של הגבלת זיהום adeno-cre ידי הידוק כירורגית של קטע להיות המושרה פותחה. 13 שינינו את הנוהל הזה כדי לשפר את רווחת בעלי החיים, כמו גם להפחית את התמותה ואת מספר הגידולים שהתקבלו. עם פרוטוקול זה, כל המעבדות עם ניסיון ניתוח מכרסמים קטנים צריכים להיות מסוגלים לשכפל את המודל לייצר גידולים אשר לשחזור מאוד נגיש בקלות קולונוסקופיה. בהתאם מ מותנהUtations המשמשים tumorigenesis, הספקטרום המלא של אדנומה, קרצינומה פולשנית וגרורות ניתן לראות. כמו גידולים ממוקמים המעי הגס דיסטלי, הערכה אנדוסקופית טורית הוא אפשרי בקלות במודל זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים שהוצגו כאן נבדקו ואושרו באופן עצמאי על ידי גוף מוסדי וועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים ונערכו על פי הנחיות הפדרציה של מעבדות מדענים בבעלי חיים (FELASA). כל האמצעים האפשריים נלקחו כדי למזער את הסבל כולל הרדמה משכך כאבים או, אם יש צורך, המתת חסד מוקדמת.
1. אינדוקציה מקומית הגידול באמצעות זיהום כירורגי Adeno-Cre
- הכנת בעלי חיים לניתוח
הערה: כמעט כל מותנה ("floxed") מוטציה יכול להיות המושרה באמצעות השיטה המתוארת כאן. מומלץ להשתמש במוטציות בגנים הרלוונטיים לסרטן המעי הגס, כגון Apc, Kras או Tp53. היעילות של רקומבינציה CR תלוי בגודל של המבנה להיות נכרת. רצפים גדולים floxed הם נכרת פחות יעיל. רקומבינציה של כל אללים צריך להיות מאושרים על ידי גידולים PCר- לצורך פיתוח של גידולי המעי הגס, השתמש בחצות של אללים מותנים עבור מודל בסיסי של CRC (מספר מסד נתונים MGI בסוגריים):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - אם אלל כתב פלואורסצנטי נדרש ( למשל , כדי לזהות micrometastases), השתמש האלל הבא:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
הערה: כל הזנים לעיל זמינים באמצעות מאגר העכבר NCI או מעבדה ג 'קסון. אין צורך בצום כמו כל החומר הנותר צואה ניתן סומק לפני זיהום אדנוביראלי. צום לפני הניתוח מוביל לתמותה perioperative גבוה ומהווה לחץ עצום עבור מכרסמים קטנים. - השתמש sevoflurane ב 3 - 3.5% כרך עבור הרדמה כללית. הפסד של tהוא קמצוץ רפסלקס מציין הרדמה מספקת.
- לפני החתך הראשון, להזריק 0.05 מ"ג / ק"ג של בופרנורפין תת עורי.
- לכסות את העיניים של העכבר הרדים עם משחה עיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
- מניחים את העכבר במצב שכיבה על שולחן קטן. השתמש קלטות דבק שאינם טראומטיים כדי לרסן את העכבר.
- לגלח את הבטן עם מכונת גילוח חשמלית (קרם דפילציה ניתן להשתמש לחילופין) ולחטא עם אלכוהול swabs או יוד. השתמש בזמן המגע המומלץ על ידי היצרן.
- לכסות את שדה כירורגי עם וילונות סטריליים.
הערה: השימוש באנטיביוטיקה perioperative הוא אופציונלי ובכפוף להנחיות מוסדיות. - השתמש סטרילי לשימוש יחיד או מכשירים מעוקרים עבור כל הליכים כירורגיים.
- לצורך פיתוח של גידולי המעי הגס, השתמש בחצות של אללים מותנים עבור מודל בסיסי של CRC (מספר מסד נתונים MGI בסוגריים):
- Laparotomy midline וחשיפה של המעי הגס
- השתמש במספריים (אזמלים ניתן להשתמש לחילופין) לעשות חתך קו האמצע(~ 15 מ"מ) של העור על הבטן התחתונה.
- להרים את שרירי דופן דופן הבטן עם מלקחיים בזהירות לחתוך אותו במספריים, ובכך לפתוח את חלל הבטן.
- זהה את המעי הגס דיסטלי, רק לגעת בו עם מלקחיים atraumatic. מהדק את המעי הגס עם מהדק עדין ( למשל , מיקרו סרפינה כלי דם מהדק) כ 15 מ"מ פרוקסימלי של פי הטבעת.
הערה: תן תשומת לב מיוחדת הפגיעות של המעי הגס בכל עת. ניקוב מוביל בהכרח דלקת הצפק ואת אלח דם ודורש המתת חסד של החיה.
- זיהום המעי הגס עם וירוס Adeno-cre
- הכנס צינור טפלון גמיש transanally בקפידה לקדם אותו עד שהוא מגיע לחסימת לומן מושגת על ידי מהדק שהוצב בעבר ב 15 מ"מ מן השוליים אנאלי. אין להשתמש בכוח מופרז כמו זה עלול להוביל ניקוב.
- Cannulate את הצינור עם צינורית 30G, לחבר מזרק רגיל 1 מ"ל ולשטוף את קולוN עם מלוחים רגילים על מנת לפנות את החומר הצואה הנותר. זה עשוי לדרוש כמה מ"ל של תמיסת מלח.
- לאחר המעי הגס דיסטלי ריק להסיר את הצינור ולהחליף אותו עם צינור טפלון טרי ושוב למקם אותו דיסטלי ישירות על מהדק כמתואר לעיל.
- לחסום את המעי הגס עם מהדק השני ~ 3 מ"מ דיסטלי כדי מהדק הפרוקסימלי ( כלומר , מעל צינור מוכנס, ~ 12 מ"מ מן השוליים אנאלי), וכתוצאה מכך קטע מבודד 3 מ"מ להיות נגועים.
הערה: עבור חסימה דיסטלי של קטע Fogarty מחלת עורקים הכליליים הוכיחו המתאים ביותר כפי שהם rubberized, המוביל חסימה הדוק של המעי הגס למרות צינור intraluminal בין הענפים של מהדק. - השתמש מזרק השני (1 מ"ל רגיל עם צינורית 30G) בזהירות להזריק 50 - 80 μL של 0.25% טריפסין- EDTA לתוך קטע המעי הגס clamped ו דגירה של 10 דקות. השאירו את הצינורית ואת המזרק מחובר לצינור טפלון כדי למנוע את הנוזל דולף בחזרה.
- ראשית להסיר את מהדק דיסטלי, ולאחר מכן את צינור טריפסין.
- שטוף את המעי הגס דיסטלי עם μL 500 ~ של מלוחים רגילים להסיר טריפסין הנותרים.
- הכנס צינור טפלון חדש, לשים את מהדק דיסטלי בחזרה במקום לנפח את קטע המעי הגס עם 50 - 80 μL של פתרון אדנובירל (10 11 יחידות רובד להרכיב (PFU) / מ"ל ב מלוחים זרחן מלוחים) ו דגירה של 30 דקות ( איור 2 א ).
הערה: אין לשפוך פתרון ויראלי כמו מגע עם adeno-cre עשוי להוביל להתפתחות הגידול בכל רקמה של עכברים מוטציה מותנית. - הסר את מהדקי ואת הצינור.
- סגירת הבטן והתאוששות לאחר הניתוח
- סגור את דופן הבטן עם 6-0 במהירות absorbable su( למשל , polydioxanone (PDS)).
- סגור את העור עם קליפ הפצע כירורגי.
- מניחים את העכבר על כרית חימום להגדיר 38 מעלות צלזיוס עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
- ניהול עוד בולוס של 0.05 מ"ג / ק"ג IP buprenorphine 12 שעות לאחר הניתוח, ואחריו בולוסים נוספים של בופרנורפין כל 12 שעות אם יש צורך.
- לפקח על העכברים לפחות פעם אחת ביום עבור סימנים של מצוקה בשל הגידול בגידול.
2. קולונוסקופיה
הערה: בהתאם למוטציות מותנות בשימוש, זיהום adenoviral מוביל לגידולים נראים אנדוסקופיים בתוך 2 - 4 שבועות. לכן, בצע את קולונוסקופיה לאחר הניתוח הראשון 2 שבועות לאחר האינדוקציה adenoviral לחזור כל שבועיים. מערכת זמינה מסחרית מומלץ קולונוסקופיה Murine. 20
- הכנת בעלי חיים לקולונוסקופיה
הערה: אין צורך בצוםEd. החומר הצואה הנותר הוא בדרך כלל טוב בצורת המעי הגס דיסטלי ניתן לדחוף מעבר לגידול במהלך קולונוסקופיה, ובכך להפוך את תהליך מלחיץ של צום חוזר מיותר.- השתמש sevoflurane ב 3 - 3.5% כרך עבור הרדמה כללית. אובדן רפלקס קמצוץ הבוהן מעיד על הרדמה מספקת.
- לכסות את העיניים של עכברים הרדים עם משחה עיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
- לרסן את העכברים במצב שכיבה על שולחן קטן.
- קולונוסקופיה
- הכנס את היקף (קוטר 1.9 מ"מ, אורך 10 ס"מ) לתוך מערכת העיכול דרך פי הטבעת בזהירות האוויר לדפוק תחת שליטה חזותית כדי להקטין את המעי הגס. אין לדחוס יותר אוויר מאשר נדרש לבדיקה.
הערה: לאינפוזיה של האוויר, ניתן להשתמש במשאבת אוויר נגד ערפל של מערכת קולונוסקופיה. אם אין משאבת אוויר אנטי ערפל זמין, כל משאבת אוויר אחרת עם הגדרות לחץ נמוך מאוד ניתן להשתמש, או מראשאוויר סנסורי עם שסתום עדין להורדת לחץ. פחמן דו חמצני (CO 2 ) בקלות מוביל acidosis במכרסמים קטנים ולכן יש להימנע. - בזהירות לדחוף את היקף קדימה עד הנגע רירית המעי הגס הדיסטלי ניתן לזהות ( איור 1A - 1D ).
- שמור תמונות אנדוסקופיות להערכה מאוחר יותר. מערכת ניקוב אנדוסקופית עבור גידולים תוך-פנימיים תוארה בעבר. 20
- בזהירות להסיר את היקף ומקום העכבר על כרית חימום להגדיר ל 38 מעלות צלזיוס עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
- הכנס את היקף (קוטר 1.9 מ"מ, אורך 10 ס"מ) לתוך מערכת העיכול דרך פי הטבעת בזהירות האוויר לדפוק תחת שליטה חזותית כדי להקטין את המעי הגס. אין לדחוס יותר אוויר מאשר נדרש לבדיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אם מתבצע כראוי,> 85% מהחיות לפתח גידולים. התמותה של הניתוח המוצג כאן הוא <5%, התמותה של קולונוסקופיה הוא כמעט לא קיים. ברוב העכברים, נגע בודד מזוהה; ב 30% - 2 - 3 אדנומות קטנות ניתן לזהות אשר בדרך כלל נתיך לגידול אחד בתוך 2-3 שבועות לאחר אינדוקציה הגידול.
הפנוטיפ וההתנהגות הביולוגית של הגידולים המתקבלים תלויים מאוד במוטציות המותנות של החיות. נוקאאוט המקומי מתווכת Cre של Apc מספיקה כדי לגרום tumorigenesis ומוביל בתחילה אדנומה, אשר ניתן לזהות 2 - 4 שבועות לאחר זיהום adenoviral ואשר מתקדם אדנוקרצינומה פולשני בתוך 12-16 שבועות. תהליך זה יכול להיות מואץ על ידי הוספת מוטציה מותנית קראס oncogenic (Kras G12D), הגידולים שהתקבלו במהירות התקדמות פולשניתאדנוקרצינומה. עם תוספת של Tp53 R172H Oncogenic הגידולים במהירות התקדמות קרצינומה פולשנית וגרורות. הישרדות תלויה במידה רבה בגנוטיפ של הגידולים; חציון ההישרדות הוא בדרך כלל על 80 - 200 ימים לאחר אינדוקציה הגידול. סיבת המוות ברוב המקרים היא חסימת מעיים גדולה לצמיחת הגידול.
את הגידולים ניתן לפקח בקלות שוב ושוב באמצעות קולונוסקופיה ( איור 1 ) ללא מתח גדול עבור בעלי החיים.
ביטויי המחלה דומים מאוד ל- CRC האנושי. החיות לפתח אדנומות ובסופו של דבר אדנוקרצינומה של המעי הגס הדיסטלי ( תרשימים 2B, 2C, 2F ). בהתאם לגנוטיפ מותנה של העכברים, הגידולים גם גרורות לצפק ( איור 2 ד ) הכבדים ( איור 2E ) ונדיר Ly הריאות (לא מוצג). אם אלל כתב כתב ( למשל , ZSGreen 19 ) משמש, כל גילויי הגידול ניתן לזהות בקלות. אלל הכתב ZSGreen תכונות ביטוי חלבון פלואורסצנטי בהיר מספיק כדי להיות גלויים לאור היום ( איור 1 ב , איור 2 ג ).
מבחינה היסטולוגית, 95% מהגידולים המתפתחים הם אדנוקרצינומה. כ -5% מהגידולים הם ממוצא מזנכימלי, כגון פיברוזרקומה או ליומיאוסרקומה, ככל הנראה מתפתחים מתאי סטרומה שנדבקו בטעות באדנו-קרי. היסטומורפולוגיה של adenocarcinomas מקרוב דומה CRC האדם, שמציעה את כל הספקטרום של אדנומה לא פולשני אדנוקרצינומה פולש מבנים שמסביב ( איור 3 א - 3 ג ).
Files / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
איור 1. קולונוסקופי תמונות של גידולים המעי הגס (אללים מותנה של בעל חיים נתון בסוגריים).
א המעי הגס דיסטלי רגיל. ב מוקדם אדנומה 2 שבועות לאחר זיהום אדנו. הערה הצבע הירוק עקב אלל הכתב GFP בעכבר זה. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. אדנומה מאוחרת (Apc tm2Rak , קראס tm4Tyj ). ד. המעי הגס אדנוקרצינומה (כפי שאובחן על ידי הפתולוגיה לאחר קולונוסקופיה תמונות הושגו, Apc tm2Rak , קראס tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
22pl "/>
איור 2. סיטוס Intraoperative . הערה קליפ Fogarty גדול, גומי בתחתית ואת צינור מוכנס transnally עבור הזרקת adeno-cre (חץ אדום). ב. גידול המעי הגס (חץ לבן) עם חסימת מעיים רציפה 8 שבועות לאחר ההדבקה של אדנו- קרי (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). ג. סרטן המעי הגס (חץ לבן) 10 שבועות לאחר ההדבקה של אדנו- קרי (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). הערה צבע ירקרק בשל אלל ירוק ניאון חלבון (GFP) אלל הכתב בעכבר זה. ד caritinosis דלקתית (חיצים שחורים) ב GEMM (Apc tm2Rak , קראס tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). הכבד והמעיים הוסרו כדי לחשוף את הכליות ואת הסרעפת. E. גרורות בכבד גס ב GEMM 12 שבועות לאחר adeno-cre פנימה( APC tm2Rak , קראס tm4Tyj ). פ קולון עם הגידול לאחר הסרת מן החיה מתואר באיור 2C . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Hematoxylin / Eosin (H / E) כתמים מוכתמים של גידולים המעי הגס מן GEMM.
א אזור המעבר מ רגיל רירית כדי adenocarcinoma עם חדירת רירית, submucosa ו musculis mucosae (Apc tm2Rak , קראס tm4Tyj ). ב אזור המעבר מ רגיל רירית המעי הגס עד אדנוקרצינומה פולשני (Apc tm2Rak , קראס tm4Tyj ). ג אדנוקרצינומה בדרגה גבוהה עם חדירת הרקמה הסובבת (Apc tm2)Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד הם בדרך כלל קל ליצור ולתחזק, מודלים קלאסיים עכבר CRC מבוסס על הזרקת קו התא הם מלאכותיים ולא מסוגלים לשחזר באופן מלא את המחלה האנושית. כתוצאה מכך, GEMMs פותחו. ה- CRC GEMM הראשון היה עכבר ה- Apc Min , המוטבע במוטציה מוטורית הטרוזיגוטית בגן ה- Apc, ולכן מחקה את המחלה ההומאנית האנושית המשפחתית (FAP). עם זאת, עכברים Apc מיני תמיד לפתח אדנומות מעיים מרובים לא מוגבל המעי הגס; כמו כן, הזמן והמיקום המדויק של היווצרות אדנומה היא אקראית הגידולים לעתים נדירות להתפתח נגעים ממאירים כמו העכבר מת של עומס הגידול שפיר לפני אדנומות יכול להתקדם. לכן, העכבר Apc Min הוא מודל של FAP, לא CRC ספוראדי. מודלים אחרים מציגים מוטציות בגנים של תיקון דנ"א. 22 , 23 למרות שחלקםעכברים הם מודלים מצוינים לסרטן הקיבה והמעיים התורשתי, הם אינם מייצגים סרטן קולו-רקטלי אקראי.
מלבד השינוי הגנטי הבסיסי הוא המיקום של הנגע הגנטי אשר קובע דגמים שונים של סרטן המעי הגס וסנדרום המעי הגס. כל הדגמים שהוזכרו לעיל כוללים מוטציות שהן פעילות אקטיבית או המושרות במעי הגס או אפילו במערכת העיכול כולה. התוצאה היא היווצרות של אדנומות מרובות, אשר אינו נציג של CRC אדם סדיר, הוא כמעט לא ניתן להערכה על ידי קולונוסקופיה, בנוסף, בדרך כלל, בדרך כלל לא משאיר את הגידולים מספיק זמן לפתח לפני החיה נכנע לעומס הגידול נרחב. לכן, מודל העכבר לסרטן המעי הגס הספוראדי חייב לכלול פעילות מקומית של גידול המעי הגס.
הגידולים המתעוררים כאן מוצגים GEMM מוגבלים אך ורק את קטע הידוק כירורגית adeno-creשל המעי הגס. התוצאה היא היווצרות של גידול אחד אשר נגיש בקלות לזיהוי ומעקב על ידי קולונוסקופיה. בנוסף, המיקום הדיסטלי גורם לחסימת מעיים לסיבוך מאוחר של גידול הגידול, ומאפשר לגידולים להתפתח פולשניים, בהתאם לגנוטיפ, קרצינומה גרורתית לפני החיה דורש המתת חסד. יתרון נוסף של זיהום קריטי הוא בסביבה לא מושפעת. בעוד ב Apc Min ודגמי עכברים אחרים, הרירית שמסביב ואפילו התאים סטרומה סובלים את אותם סטיות גנטיות כמו גידולים, גידולים במודל המוצע כאן לפתח בתוך אפיתל המעי הגס סטרומה. זה מאפשר אינטראקציה ריאליסטית יותר מארח המארח ומחקרים מולקולריים ללא הגבלות. יתר על כן, נקודת הזמן של אינדוקציה הגידול מוגדר היטב במודל זה. בעוד העכבר Apc מיני , גידולים לפתח לאחר "מכה שנייה", שבמהלכו אלל השני Apc הוא סטוכסט איבוד מוחלט בנקודת זמן אקראית, כל המוטציות הרצויות מופעלות בו זמנית במודל המתואר כאן, ובכך מאפשרות מחקרים של נגעים מוקדמים מאוד או ביופסיות רצופות בצורה מוגדרת מאוד.
עם זאת, מודל זה מגיע גם עם מגבלות. המעבר של אללים מרובים לתוך מודל אחד דורש זמן ומשאבים עצומים; בנוסף, לעתים קרובות לא כל הצאצאים ניתן להשתמש עבור הניסויים בשל גנוטיפ לא מתאים. ההליך עצמו דורש תרגול והוא זמן רב. הייצור של ההשעיה וירוס adeno-cre עם titers גבוה מספיק בכמויות גדולות היא עלות אינטנסיבית. לכן, מודל זה אינו מתאים להחליף את כל מודלים העכבר אחרים CRC ו יוגבל מעבדות עם דגש מיוחד על מודלים GEM.
הפרוטוקול עצמו הוא תובעני מבחינה טכנית, אך עם כמה אימון שאינם אנשי כירורגית יכול לבצע את ההליכים כראוי. השלב הקריטי במהלך adeno-cre אניNfection היא האינפלציה של קטע מעי הידוק - לחץ יתר פנימי עודף מוביל ניקוב, לחץ לא מספיק מפחית את שיעור זיהום מוצלח. צעד זה דורש הכשרה.
פרוטוקול דלקת אדנוביראלית של המעי הגס הדיסטלי פורסם על ידי Hung et al. לפני. 13 הפרוטוקול המוצג כאן שונה מן הפרוטוקול הנ"ל בכמה היבטים מרכזיים. כפי שהיא גורמת לעתים קרובות ניקוב המעי בידיים unexperienced, שחיקה מכנית של הרירית לפני דגירה אדנו-קריר הוא דילג בפרוטוקול הנוכחי. התוצאה היא שיעור מופחת של היווצרות הגידול, אשר עם זאת ניתן לנטרל על ידי titers ויראלי מוגבר. בדרך זו, שיעור של גידולים mesenchymal יכול גם להיות מופחת כמו בלי שחיקה ריריות תאים mesenchymal פחות בתוך קיר המעיים חשופים adeno-cre.
כמו כן, בניגוד לפרוטוקול הנ"ל 13 כאןפרוטוקול המתואר אינו ממליץ לילה צום לפני הניתוח או קולונוסקופיה. במקום זאת, שטיפה של המעיים, או במקרה של קולונוסקופיה, מניפולציה מכנית פשוטה משמשת כדי להסיר את החומר הצואה הנותר. חידוד זה של הפרוטוקול משפר באופן דרמטי את רווחת בעלי החיים. צום לילה הוא הליך מלחיץ מאוד עבור מכרסמים קטנים ידוע להשפיע מאוד על מטבוליזם Murine, ולכן גם להשפיע על תוצאות הניסוי. 24 , 25 אלה תופעות בלתי רצויות של צום לילה ניתן להימנע בכתב היד המוצג כאן.
הבדל חשוב נוסף בין הפרוטוקול המוצג כאן לבין פרוטוקול על ידי Hung et al. הוא אורך של קטע מהדוק (ולכן נגוע). בעוד כאן פרוטוקול המתואר ממליץ על אורך קצר (~ 3 מ"מ), Hung et al. ממליצים 20 מ"מ של המעי הגס הדיסטלי להיות נגועים. אורך הקטע קצר יותר נבחר כדי לצמצם את המספרשל שברי רקומין וכתוצאה מכך גידולים. כמו רוב החולים עם CRC ספוראדי לפתח גידול אחד ולא גידולים מרובים, מדד זה מגדיל את הרלוונטיות הקלינית של המודל. שיעור היווצרות הגידול לא נראה מושפע משטח מופחת של המעי הגס נגוע.
יישומים עתידיים של טכניקה זו כוללים את כל הפרוטוקולים הדורשים recombination Cre המקומי בתוך רירית המעי הגס. רוב היישומים במחקר הסרטן יכללו אונקוגנים מותנים, שיובילו להיווצרות גידולים של המעי הגס; עם זאת, כל שאר היישומים כגון גרימת בונה כתב בתוך רירית המעי הגס ניתן להשיג עם הפרוטוקול המוצג כאן גם כן.
לסיכום, כאן הציג שילוב של מתוחכם מהונדס גנטית מודל של סרטן המעי הגס יחד עם האפשרות של קולונוסקופיה ברזולוציה גבוהה עבור איתור ומעקב של גידולים מתפתחים לספקS הגדרה מצוינת ללמוד את הביולוגיה ואת הטיפול של CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו מוקדשת לזכרו של פרופ 'מוריץ קוך.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F.
