Summary
Представлен протокол создания генно-инженерной мышиной модели колоректального рака с помощью сегментарной адено-кремовой инфекции и ее наблюдения с помощью колоноскопии высокого разрешения.
Abstract
Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, мышиные модели колоректального рака, основанные на инъекции опухолевых клеток, имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены генно-инженерные мышиные модели; Однако такие модели технически требуются, особенно в больших органах, таких как толстая кишка, в которой желательна только одна опухоль.
В результате была разработана иммунокомпетентная генетически модифицированная мышечная модель колоректального рака, которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Развитие опухоли инициируется хирургической, сегментарной инфекцией дистальной кишки с адено-кре-вирусом у сложных условно мутантных мышей. Опухоли можно легко обнаружить и контролировать с помощью колоноскопии. Мы здесь описываем хирургическую методику сегментарной аденоскопной инфекцииОбодочную кишку, наблюдение за опухолью с помощью колоноскопии высокого разрешения и представление полученных колоректальных опухолей.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) по-прежнему является одной из ведущих причин смертности от рака в западных странах. 1 Хотя прогноз пациентов с ранней стадией заболевания хорош, многие опухоли диагностируются на более поздних стадиях, в которых, несмотря на многочисленные варианты лечения, прогноз ограничен. 2 , 3 , 4 , 5
Большинство современных моделей мыши CRC основаны на имплантации опухолевых клеток, полученных из клеточных линий или опухолей пациентов, на иммунодефицитных мышей. 6 , 7 , 8 Это приводит к локальному и, в зависимости от места инъекции и опухолевым клеткам, используемым для инъекций, иногда метастатическим опухолям. 9 , 10 Однако полученные модели ксенотрансплантатов имеют майоR ограничений. Они должны быть установлены у иммунодефицитных мышей, что устраняет сложное взаимодействие между опухолью и иммунной системой хозяина. Кроме того, поскольку строма опухоли получена из клеток-хозяев, взаимодействие между паренхимой опухоли человека и стромой мыши является дефектной и поэтому не является репрезентативным для данного заболевания. Эти недостатки можно избежать с помощью мышиных клеточных линий для инъекций. Однако доступны только несколько линий клеток CRC мыши и, подобно большинству доступных человеческих CRC-клеточных линий, являются моноклональными и сильно анапластичными. 11 Таким образом, большинство доступных в настоящее время моделей мышей CRC являются очень искусственными и не полностью репрезентативными для болезни человека.
Генетически спроектированные мышиные модели (GEMM) CRC могут избежать этих недостатков, поскольку они показывают истинные мышечные опухоли, которые создаются посредством индукции ключевых мутаций CRC в толстой кишке. 12 , 13 ,14 Это может быть достигнуто путем активации условных (floxed) мутаций зародышевой линии путем рекомбиназы в слизистой оболочке колоректального отдела. В то время как в GEMMs многих других опухолевых сущностей используется зародышевая (индуцибельная) экспрессия cre, обусловленная тканеспецифическими промоторами, зародышевая структура не может использоваться в толстой кишке, так как это приводит к большому количеству аденом во всей толстой кишке, вызывающему смерть при доброкачественной опухолевой нагрузке при Очень молодой возраст. Поэтому в описанной здесь модели используется аденовирусный вектор, выражающий cre, для заражения короткого сегмента толстой кишки. Это приводит к индукции опухолевого генеза в этом сегменте слизистой оболочки в момент времени, определенный исследователем, в результате чего аденомы в конечном итоге прогрессируют до инвазивной и метастатической карциномы. Опухоли являются настоящими мышечными опухолями, растут в интактном микроокружении и поэтому способны имитировать полноту колоректального онкогенеза, включая взаимодействие опухоли-хозяина и метастатический каскад. Эта модельПоэтому является привлекательной платформой для исследований биологии рака и доклинических терапевтических испытаний.
Основным недостатком генно-инженерных моделей мыши CRC является их техническая сложность. Ранее была описана локальная сборка с использованием ректальных аденоцитарных клизмов у мышей, несущих аллергические аллели Apx. Однако, частота, множественность и расположение опухолей кишечника могут быть весьма переменными с помощью этой техники. Таким образом, была разработана методика ограничения адено-крестовой инфекции хирургическим зажимом сегмента, который должен быть индуцирован. 13 Мы изменили эту процедуру, чтобы улучшить благосостояние животных, а также снизить смертность и число возникающих опухолей. С помощью этого протокола все лаборатории, обладающие опытом в малой хирургии грызунов, должны иметь возможность воспроизводить модель и производить опухоли, которые очень воспроизводимы и легко доступны для колоноскопии. В зависимости от условного mUtations, используемых для опухолегенеза, можно наблюдать полный спектр аденомы, инвазивной карциномы и метастазов. Поскольку опухоли расположены в дистальной кишке, серийная эндоскопическая оценка легко возможна в этой модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Представленные здесь эксперименты на животных были независимо рассмотрены и одобрены институциональным и правительственным комитетом по уходу и использованию животных и проводились в соответствии с руководящими принципами Федерации лабораторных ассоциаций животных (FELASA). Были приняты все возможные меры для минимизации страданий, включая анестезию и анальгезию, или, при необходимости, преждевременную эвтаназию.
1. Индукция локальной опухоли через хирургическую адено-кремовую инфекцию
- Подготовка животных к хирургии
ПРИМЕЧАНИЕ. Практически любая условная («floxed») мутация может быть вызвана посредством описанного здесь метода. Рекомендуется использовать мутации в генах, подходящих для колоректального рака, таких как Apc, Kras или Tp53. Эффективность cre-рекомбинации зависит от размера вырезаемой конструкции. Большие флуксовые последовательности вырезаются менее эффективно. Рекомбинация всех аллелей должна быть подтверждена в опухолях ПКР.- Для развития колоректальных опухолей используйте крестик следующих условных аллелей для базовой модели CRC (номер базы MGI в скобках):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Красный tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Если требуется аллель репортера флуоресценции ( например , для обнаружения микрометастаз), используйте следующий аллель:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
ПРИМЕЧАНИЕ. Все вышеперечисленные штаммы доступны через репозиторий мыши NCI или лабораторию Джексона. Пост не требуется, так как все оставшиеся фекальные вещества могут быть вымыты до аденовирусной инфекции. Предоперационный пост приводит к более высокой периоперационной смертности и представляет собой огромный стресс для мелких грызунов. - Используйте севофлуран при 3 - 3,5 об.% Для общей анестезии. Потеря tОн указывает на достаточную анестезию.
- Перед первым разрезом вводят 0,05 мг / кг бупренорфина подкожно.
- Накройте глаза анестезированной мышью глазной мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
- Поместите мышь в лежачее положение на маленьком столе. Используйте невращающиеся клейкие ленты, чтобы сдержать мышь.
- Бритье живота с помощью электробритвы (в качестве альтернативного варианта можно использовать депиляционный крем) и дезинфицировать спиртовыми тампонами или йодом. Используйте время контакта, рекомендованное производителем.
- Покройте хирургическое поле стерильными драпировками.
ПРИМЕЧАНИЕ. Использование периоперационных антибиотиков является факультативным и подлежит институциональным руководящим принципам. - Используйте стерильные одноразовые или стерилизованные инструменты для всех хирургических процедур.
- Для развития колоректальных опухолей используйте крестик следующих условных аллелей для базовой модели CRC (номер базы MGI в скобках):
- Средняя лапаротомия и воздействие толстой кишки
- Используйте ножницы (скальпели можно использовать альтернативно), чтобы сделать срединный разрез(~ 15 мм) кожи на нижней части живота.
- Возьмите мускулатуру брюшной стенки с помощью щипцов и аккуратно поднимите ее ножницами, открыв таким образом брюшную полость.
- Определите дистальную кишку, только коснитесь ее атравматическими щипцами. Закрепите толстую кишку тонким зажимом ( например , сосудистым зажимом Micro Serrefine) примерно на 15 мм в проксимальном направлении заднего прохода.
ПРИМЕЧАНИЕ. Уделяйте особое внимание уязвимости двоеточия во все времена. Перфорация неизбежно приводит к перитониту и сепсису и требует эвтаназии животного.
- Сегментарная инфекция двоеточия вирусом Adeno-cre
- Вставьте гибкую тефлоновую трубку трансанально и осторожно продвиньте ее до тех пор, пока она не достигнет окклюзии просвета, достигнутой зажимом, ранее установленным на расстоянии 15 мм от анального края. Не используйте избыточную силу, так как это может привести к перфорации.
- Канюлируйте трубку с канюлей 30G, соедините стандартный 1 мл шприц и промойте колостьN с нормальным физиологическим раствором для эвакуации оставшегося фекального вещества. Это может потребовать несколько мл физиологического раствора.
- Как только дистальная толстая кишка пуста, удалите трубку и замените ее свежей тефлоновой трубкой и снова поместите ее прямо на дистальную сторону зажима, как описано выше.
- Окуните двоеточие со вторым зажимом ~ 3 мм, дистальным к проксимальному зажиму ( то есть через вставленную трубку, ~ 12 мм от анального края), в результате чего изолированный сегмент 3 мм будет инфицирован.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для дистальной окклюзии сегмента зажимы коронарной артерии Fogarty оказались наиболее подходящими, поскольку они прорезинизированы, что приводит к плотной закупорке толстой кишки, несмотря на внутрипросветную трубку между ветвями зажима. - Используйте второй шприц (стандартный 1 мл с канюлей 30G), чтобы осторожно влить 50 - 80 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА в отрезанный сегмент толстой кишки и инкубировать в течение 10 мин. Оставьте канюлю и шприц, прикрепленные к тефлоновой трубке, чтобы предотвратить утечку жидкости.
- Сначала удалите дистальный зажим, а затем трипсиновую трубку.
- Промойте дистальную кишку с помощью 500 мл нормального физиологического раствора, чтобы удалить оставшийся трипсин.
- Вставьте новую тефлоновую трубку, верните дистальный зажим на место и надуйте сегмент толстой кишки 50 - 80 мкл аденовирусного раствора (10 11 единиц образования бляшек (PFU) / мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе) и инкубируйте в течение 30 мин ( Рисунок 2A ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Не проливайте вирусный раствор, поскольку контакт с адено-креамином может привести к развитию опухоли в любой ткани условно мутантных мышей. - Снимите зажимы и трубку.
- Закрытие брюшной полости и послеоперационное восстановление
- Закройте брюшную стенку с 6-0 быстро абсорбируемым бегом su( Например , полидиоксанон (PDS)).
- Закройте кожу хирургическими раневыми зажимами.
- Поместите мышь на нагревательную подушку, установленную на 38 ° C, пока она полностью не восстановится после анестезии.
- Администрировать еще один болюс 0,05 мг / кг бупренорфина через 12 ч после операции, а затем дополнительные бупренорфиновые болюсы каждые 12 ч, если это необходимо.
- Наблюдайте за мышами не реже одного раза в день за признаки дистресса из-за роста опухоли.
2. Колоноскопия
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от условных мутаций аденовирусная инфекция приводит к эндоскопически видимым опухолям в течение 2-4 недель. Поэтому выполните первую послеоперационную колоноскопию через 2 недели после индукции аденовируса и повторите каждые 2 недели. Для мышечной колоноскопии рекомендуется использовать коммерчески доступную систему. 20
- Подготовка животных к колоноскопии
ПРИМЕЧАНИЕ. Пост не требуется.редактор Оставшееся фекальное вещество обычно хорошо формируется в дистальной толстой кишке и может вытесняться за пределы опухоли во время колоноскопии, что делает ненужным стрессовый процесс повторного поста.- Используйте севофлуран при 3 - 3,5 об.% Для общей анестезии. Потеря рефлекса пинча пальца указывает на достаточную анестезию.
- Накройте глаза анестезированных мышей офтальмической мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
- Удерживайте мышей в лежачем положении на маленьком столе.
- Колоноскопия
- Вставьте область (диаметр 1,9 мм, длина 10 см) в кишечный тракт через задний проход и тщательно инсуффляционный воздух под визуальным контролем, чтобы растянуть толстую кишку. Не вдыхайте больше воздуха, чем требуется для обследования.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для вдувания воздуха можно использовать противотуманный воздушный насос колоноскопической системы. Если не имеется противотуманный пневматический насос, можно использовать любой другой воздушный насос с настройками очень низкого давления или предварительноСжатый воздух с нежным редукционным клапаном. Двуокись углерода (CO 2 ) легко приводит к ацидозу у мелких грызунов и поэтому его следует избегать. - Тщательно продвиньте область вперед, пока не будет обнаружено повреждение слизистой оболочки в дистальной ободочной кишке ( рис. 1A-1D ).
- Сохраните эндоскопические изображения для последующей оценки. Ранее была описана эндоскопическая система подсчета для внутрипросветных опухолей. 20
- Осторожно снимите область и поместите мышь на нагревательную колодку, установленную на 38 ° C, пока она полностью не восстановится после анестезии.
- Вставьте область (диаметр 1,9 мм, длина 10 см) в кишечный тракт через задний проход и тщательно инсуффляционный воздух под визуальным контролем, чтобы растянуть толстую кишку. Не вдыхайте больше воздуха, чем требуется для обследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Если выполнить адекватно,> 85% животных развивают опухоли. Смертность представленной здесь хирургической процедуры составляет <5%, смертность колоноскопии практически не существует. У большинства мышей обнаружено одно поражение; Около 30% может быть обнаружено 2 - 3 небольших аденомы, которые обычно сливаются с одной опухолью в течение 2 - 3 недель после индукции опухоли.
Фенотип и биологическое поведение результирующих опухолей сильно зависят от условных мутаций животных. Местный cre-опосредованный нокаут Apc достаточен для индуцирования опухолевого генеза и изначально приводит к аденоме, которая может быть обнаружена через 2-4 недели после аденовирусной инфекции и которая прогрессирует до инвазивной аденокарциномы в течение 12 - 16 недель. Этот процесс можно ускорить, добавив условную онкогенную мутацию Kras (Kras G12D), полученные опухоли быстро переходят в инвазивныеаденокарциномы. При добавлении онкогенного Tp53 R172H опухоли быстро прогрессируют до инвазивной и метастатической карциномы. Выживание сильно зависит от генотипа опухолей; Медианная выживаемость обычно составляет примерно 80 - 200 дней после индукции опухоли. Причиной смерти в подавляющем большинстве случаев является большая непроходимость кишечника, вторичная по отношению к росту опухоли.
Опухоли можно легко и многократно контролировать с помощью колоноскопии ( рис. 1 ) без значительного стресса для животных.
Проявления болезни очень похожи на человеческий CRC. У животных развиваются аденомы и, в конечном счете, аденокарциномы дистальной толстой кишки ( фиг. 2В, 2С, 2F ). В зависимости от условного генотипа мышей опухоли также метастазируют до брюшины ( рис. 2D ) печени ( рис. 2Е ) и редко В легких (не показано). Если используется репортерный аллель ( например , ZSGreen 19 ), все проявления опухолей можно легко идентифицировать. Репортер-аллель ZSGreen имеет ярко выраженную флуоресцентную экспрессию белка, чтобы быть видимой при дневном свете ( рис. 1В , рис. 2С ).
Гистологически 95% развивающихся опухолей являются аденокарцином. Около 5% опухолей имеют мезенхимальное происхождение, например , фибросаркому или лейомиосаркому, предположительно развиваясь из стромальных клеток, которые были случайно инфицированы аденоскопом. Гистоморфология аденокарциномы очень похожа на человеческий CRC, характеризующийся полным спектром от неинвазивной аденомы до аденокарциномы, вторгающейся в окружающие структуры ( рис. 3A-3C ).
Files / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Колоноскопические изображения колоректальных опухолей (условные аллели данного животного в скобках).
A. Нормальная дистальная толстая кишка. B. Ранняя аденома через 2 недели после инфицирования аденоскопом. Обратите внимание на зеленый цвет из-за GFP-репортер-аллеля в этой мыши. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Поздняя аденома (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Колоректальная аденокарцинома (диагностирована по патологии после изображений колоноскопии, Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2.jpg "/>
Рисунок 2. A. Интраоперационный Situs . Обратите внимание на большой прорезиненный зажим Fogarty снизу и трансанально вставленную трубку для инъекции аденоскопа (красная стрелка). B. Колоректальная опухоль (белая стрелка) с последовательной обструкцией толстой кишки через 8 недель после аденоскопной инфекции (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Колоректальная опухоль (белая стрела) через 10 недель после адено-кремовой инфекции (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Обратите внимание на зеленоватый цвет из-за зеленого флуоресцентного белка (GFP) репортерного аллеля в этой мыши. D. Перитонеальный карциноз (черные стрелки) в GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Печень и кишечник были удалены, чтобы выявить почки и диафрагму. E. Гротевые метастазы в печени в GEMM через 12 недель после аденоскопии в(Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colon с опухолью после удаления из животного, изображенного на рисунке 2C . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Окрашенные пятна гематоксилин / эозин (H / E) из колоректальных опухолей из GEMM.
A. Переходная зона от нормальной слизистой оболочки до аденокарциномы с инфильтрацией слизистой оболочки, подслизистой и мускулатуры (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Переходная зона от нормальной слизистой оболочки толстой кишки до инвазивной аденокарциномы (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Аденокарцинома высокого класса с инфильтрацией окружающей ткани (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя их, как правило, легко создавать и поддерживать, классические мышиные модели CRC, основанные на инъекции клеточной линии, являются искусственными и не в состоянии полностью повторить человеческую болезнь. Как следствие, были разработаны GEMM. Первым CRC GEMM была мышь Apc Min , которая содержит гетерозиготную нулевую мутацию в гене Apc, поэтому имитирует семейный аденоматозный полипоз человека (FAP). Однако у мышей Apc Min неизменно развиваются множественные аденомы кишечника, не ограниченные толстой кишкой; Кроме того, время и точное местоположение образования аденомы являются случайными, и опухоли редко развиваются в злокачественные поражения, когда мышь умирает от доброкачественной опухолевой нагрузки до того, как аденомы могут прогрессировать. Поэтому мышь Apc Min является моделью FAP, а не спорадической CRC. Другие модели представляют мутации в генах, устраняющих несоответствие ДНК. 22 , 23 Хотя некоторые из этихМышей - отличные модели для наследственного рака желудочно-кишечного тракта, они не представляют собой спорадический колоректальный рак.
Помимо основополагающего генетического изменения, это место генетического поражения, которое выделяет модели спорадического и синдромального колоректального рака. Все вышеупомянутые модели содержат мутации, которые являются конститутивно активными или индуцированными во всей толстой кишке или даже во всем желудочно-кишечном тракте. Это приводит к образованию множественных аденом, который не является репрезентативным для человека с спорадическим CRC, вряд ли можно оценить с помощью колоноскопии и, кроме того, обычно не оставляет опухолей достаточно времени для развития до того, как животное уступит обширной опухолевой нагрузке. Поэтому модель мыши для спорадического колоректального рака должна включать локальную активацию колоректального опухолевого генеза.
Опухоли, возникающие в представленном здесь GEMM, строго ограничены хирургическим зажатым и адено-кре-инфицированным сегментомТолстой кишки. Это приводит к образованию единственной опухоли, которая легко доступна для обнаружения и наблюдения при колоноскопии. Кроме того, дистальное расположение препятствует обструкции кишечника поздним осложнением роста опухоли, позволяя опухолям развиваться в инвазивные и, в зависимости от генотипа, метастатическую карциному, прежде чем животное нуждается в эвтаназии. Другим преимуществом сегментарной инфекции является незатронутая среда. В то время как в Apc Min и других наследственных моделях мыши окружающая слизистая оболочка и даже стромальные клетки страдают от тех же генетических аберраций, что и опухоли, опухоли в предлагаемой здесь модели развиваются в пределах нормального кишечного эпителия и стромы. Это позволяет более реалистично взаимодействовать с опухолью-хозяином и молекулярными исследованиями без ограничений. Кроме того, момент времени индукции опухоли хорошо определен в этой модели. В то время как в мыши Apc Min , опухоли развиваются после «второго удара», во время которого вторая аллель Apc является стохастомПотеряно в случайном временном интервале, все необходимые мутации активируются одновременно в описанной здесь модели, что позволяет очень точно изучать очень ранние поражения или последовательные биопсии.
Однако эта модель также имеет ограничения. Пересечение множественных аллелей в одну модель требует огромного времени и ресурсов; Кроме того, часто не все потомки могут использоваться для экспериментов из-за неподходящего генотипа. Сама процедура требует практики и занимает много времени. Производство суспензии вируса adeno-cre с достаточно высокими титрами и в больших количествах является дорогостоящим. Поэтому эта модель не подходит для замены всех других моделей мыши CRC и будет ограничена лабораториями с особым упором на модели GEM.
Сам протокол является технически сложным, но при некоторых тренировках нехирургический персонал может адекватно выполнять процедуры. Критический шаг во время адено-креNfection - это инфляция зажатого сегмента кишечника - избыточное внутрипросветное давление приводит к перфорации, недостаточное давление снижает скорость успешной инфекции. Этот шаг требует обучения.
Протокол аденовирусной инфекции дистальной толстой кишки был опубликован Хунгом и др. до. 13 Представленный здесь протокол отличается от вышеупомянутого протокола несколькими ключевыми аспектами. Поскольку он часто вызывает перфорирование кишечника в неопытных руках, механическое истирание слизистой оболочки перед инкубацией аденоскопа пропускается в настоящем протоколе. Это приводит к снижению скорости образования опухолей, что, однако, может быть предотвращено увеличением вирусных титров. Таким образом, скорость мезенхимальных опухолей также может быть уменьшена, так как без абразии слизистой оболочки менее мезенхимальные клетки внутри стенки кишечника подвергаются воздействию адено-креа.
Кроме того, в отличие от вышеупомянутого протокола 13 здесьОписанный протокол не рекомендует ночного голодания до операции или колоноскопии. Вместо этого промывание кишечника или, в случае колоноскопии, простые механические манипуляции используются для удаления остаточного фекального вещества. Это уточнение протокола значительно улучшает благосостояние животных. Ночной пост является очень стрессовой процедурой для мелких грызунов и, как известно, сильно влияет на метаболизм мыши, поэтому также влияет на экспериментальные результаты. 24 , 25 Эти нежелательные эффекты ночного голодания можно избежать в представленной здесь рукописи.
Еще одно важное различие между представленным здесь протоколом и протоколом Hung et al. Это длина зажатого (и, следовательно, зараженного) сегмента. Хотя описанный здесь протокол рекомендует короткую длину (~ 3 мм), Hung et al. Рекомендуют инфицировать 20 мм дистальной кишки. Более короткая длина сегмента была выбрана для уменьшения числаРекомбинированных склепов и, следовательно, опухолей. Поскольку у большинства пациентов со спорадическим CRC развивается одна опухоль, а не несколько опухолей, эта мера повышает клиническую значимость модели. На скорость образования опухоли, по-видимому, не влияет уменьшенная поверхность инфицированной толстой кишки.
Будущие применения этого метода включают все протоколы, требующие локальной cre-рекомбинации в слизистой оболочке толстой кишки. Большинство применений в исследованиях рака будут включать условные онкогены, приводящие к образованию колоректальных опухолей; Однако все другие применения, такие как индуцирование репортерных конструкций в слизистой оболочке толстой кишки, могут быть достигнуты и с представленным здесь протоколом.
В заключение, представленная здесь комбинация очень сложной генно-инженерной мышиной модели колоректального рака наряду с возможностью колоноскопии высокого разрешения для обнаружения и наблюдения за развивающимися опухолями обеспечиваютS отличная настройка для изучения биологии и лечения CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа посвящена памяти профессора Морица Коха.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F.
