Summary
En protokol til etablering af en genetisk manipuleret musemodel af kolorektal cancer ved segmenteret adeno-cre-infektion og dens overvågning via højopløsnings-koloskopi præsenteres.
Abstract
På trods af fordelene ved let anvendelighed og omkostningseffektivitet har muskelmodeller med kolorektal cancer baseret på tumorcelleinjektion alvorlige begrænsninger og simulerer ikke nøjagtigt tumorbiologi og tumorcelleformidling. Genetisk manipulerede musemodeller er blevet introduceret for at overvinde disse begrænsninger; Imidlertid er sådanne modeller teknisk krævende, især i store organer som tyktarmen, hvor kun en enkelt tumor ønskes.
Som et resultat heraf blev der udviklet en immunokompetent, genetisk manipuleret musemodel af kolorektal cancer, der udvikler stærkt ensartede tumorer og kan anvendes til tumorbiologi studier samt terapeutiske forsøg. Tumorudvikling initieres ved kirurgisk, segmental infektion i det distale kolon med adeno-cre-virus i sammensatte betingede mutante mus. Tumorerne kan let registreres og overvåges via koloskopi. Her beskriver vi den kirurgiske teknik for segmental adeno-cre infektion afTyktarmen, overvågningen af tumoren via højopløsningskolonoskopi og præsenterer de resulterende kolorektale tumorer.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) er fortsat en af de førende årsager til kræftrelateret død i vestlige lande. 1 Mens prognosen hos patienter med tidlig stadium sygdom er god, diagnosticeres mange tumorer i senere stadier, hvor prognosen på trods af mange behandlingsmuligheder er begrænset. 2 , 3 , 4 , 5
Størstedelen af nuværende musemodeller af CRC er baseret på implantering af tumorceller afledt fra cellelinier eller patienttumorer i immunodeficiente mus. 6 , 7 , 8 Dette fører til lokal og, afhængigt af injektionsstedet og tumorcellerne, der anvendes til injektion, undertiden metastatiske tumorer. 9 , 10 Imidlertid har de resulterende xenograftmodeller majoR begrænsninger. De skal etableres i immunodeficiente mus og eliminerer således den komplekse interaktion mellem tumor og værtsimmunsystemet. Da tumorstroma er afledt fra værtsceller, er interaktionen mellem humant tumorparenchyma og murin stroma desuden defekt og derfor ikke repræsentativ for sygdommen. Disse mangler kan undgås ved anvendelse af murine cellelinjer til injektion. Imidlertid er kun få muse-CRC-cellelinier tilgængelige, og som de fleste tilgængelige humane CRC-cellelinier er monoklonale og stærkt anaplastiske. 11 Sammenfattende er de fleste tilgængelige CRC-musemodeller meget kunstige og ikke fuldt repræsentative for den menneskelige sygdom.
Genetisk manipulerede musemodeller (GEMM'er) af CRC kan undgå disse ulemper, da de har ægte musetumorer, som skabes via induktion af vigtige mutationer af CRC i tyktarmen. 12 , 13 ,14 Dette kan opnås ved aktivering af betingede (floxed) kimline-mutationer ved cre recombinase inden i den kolorektale slimhinde. Selvom der i GEMM'er fra mange andre tumorenheder anvendes germline (inducerbar) cre-ekspression drevet af vævsspecifikke promotorer, kan germline cre ikke anvendes i tyktarmen, da dette fører til et stort antal adenomer i hele tyktarmen, hvilket forårsager død ved godartet tumorbelastning ved En meget ung alder. Derfor anvendes i den her beskrevne model en adenoviral vektor-udtrykkende cre til at inficere et kort tyktarmsegment. Dette fører til induktion af tumorigenese inden for dette segment af slimhinden på et tidspunkt defineret af undersøgeren, hvilket resulterer i adenomer i sidste ende udvikler sig til invasiv og metastatisk carcinom. Tumorerne er ægte musetumorer, vokser i et intakt mikromiljø og kan derfor simulere hele den kolorektale onkogenese, herunder tumor-værtsinteraktion og metastatisk kaskade. Denne model erDerfor en attraktiv platform for studier af kræftbiologi og prækliniske terapeutiske forsøg.
En stor ulempe ved genmodificerede musemodeller af CRC er deres tekniske kompleksitet. Lokal cre-afgivelse ved anvendelse af rektale adeno-cre-enemaser i mus, der bærer floxede Apc-alleler, er tidligere blevet beskrevet; Imidlertid kan forekomsten, multipliciteten og placeringen af tarmtumorerne være meget variabel med denne teknik. Derfor er teknikken til at begrænse adeno-cre-infektionen ved kirurgisk klemning af det segment, der skal induceres, blevet udviklet. 13 Vi har ændret denne procedure for at forbedre dyrevelfærden samt reducere dødeligheden og antallet af resulterende tumorer. Med denne protokol skal alle laboratorier med erfaring i lille gnaveroperation være i stand til at reproducere modellen og producere tumorer, som er meget reproducerbare og let tilgængelige for koloskopi. Afhængigt af den betingede mUdstillinger anvendt til tumorigenese, det fulde spektrum af adenom, invasiv karcinom og metastaser kan observeres. Da tumorerne er placeret i det distale kolon, er seriel endoskopisk vurdering let mulig i denne model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyreforsøg, der blev præsenteret her, blev uafhængigt gennemgået og godkendt af en institutionel og en offentlig dyrepleje- og brugskomité og blev udført i henhold til retningslinjerne for FELASA's Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Alle mulige foranstaltninger blev truffet for at minimere lidelse, herunder anæstesi og analgesi eller om nødvendigt for tidlig dødshjælp.
1. Lokal tumorinduktion via kirurgisk adeno-cre infektion
- Forberedelse af dyr til kirurgi
BEMÆRK: Næsten enhver betinget ("floxed") mutation kan induceres via den her beskrevne metode. Anvendelsen af mutationer i gener, der er relevante for kolorektal cancer, såsom Apc, Kras eller Tp53, anbefales. Effektiviteten af cre rekombination er afhængig af størrelsen af konstruktionen, der skal udskæres. Store floksede sekvenser udskæres mindre effektivt. Rekombinationen af alle alleler bør bekræftes i tumorerne ved hjælp af PCR.- Til udvikling af kolorektale tumorer skal du bruge et kryds af følgende betingede alleler til en grundlæggende model af CRC (MGI-databasenummer i parentes):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Hvis der kræves en fluorescens reporter allel ( fx for at detektere mikrometastaser), brug følgende allel:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
BEMÆRK: Alle ovenstående stammer er tilgængelige via NCI Mouse Repository eller Jackson Laboratory. Ingen fasting er nødvendig, da alle resterende fækale stoffer kan skylles ud før den adenovirale infektion. Præoperativ fasting fører til højere perioperativ dødelighed og udgør en enorm belastning for små gnavere. - Brug sevofluran ved 3 - 3,5 vol% til generel anæstesi. Et tab af tHan tåspids refleks indikerer tilstrækkelig bedøvelse.
- Inden den første snit indsprøjtes 0,05 mg / kg buprenorphin subkutant.
- Dækk øjnene af den bedøvede mus med ophthalmisk salve for at undgå udtørring af hornhinden.
- Placer musen i en liggende stilling på et lille bord. Brug ikke-traumatiske klæbebånd til at holde musen tilbage.
- Barber maven med en elektrisk barbermaskine (depilatory cream kan alternativt anvendes) og desinficere med alkoholpind eller jod. Brug den kontakttid, som fabrikanten anbefaler.
- Dæk det kirurgiske felt med sterile gardiner.
BEMÆRK: Brug af perioperative antibiotika er valgfrit og underlagt institutionelle retningslinjer. - Brug steril engangsbrug eller steriliserede instrumenter til alle kirurgiske procedurer.
- Til udvikling af kolorektale tumorer skal du bruge et kryds af følgende betingede alleler til en grundlæggende model af CRC (MGI-databasenummer i parentes):
- Midline laparotomi og eksponering af tyktarmen
- Brug saks (skalpeller kan bruges som alternativ) for at lave et midtlinie snit(~ 15 mm) af huden på underlivet.
- Optag muskulaturen i mavemusklerne med pincet og omhyggeligt indse det med en saks og dermed åbne bukhulen.
- Identificer den distale tyktarm, kun røre den med atraumatiske tang. Klip tyktarmen med en delikat klemme ( f.eks . En Micro Serrefine vaskulær klemme) ca. 15 mm nær anus.
BEMÆRK: Vær opmærksom på sårbarheden af tyktarmen til enhver tid. Perforering fører uundgåeligt til peritonitis og sepsis og kræver eutanasi hos dyret.
- Segmental kolon infektion med Adeno-cre virus
- Indsæt et fleksibelt Teflon-rør på tværs og forskyd forsigtigt det, indtil det når lumeneklusionen opnået ved klemmen, der tidligere er anbragt ved 15 mm fra den analske kant. Brug ikke overskydende kraft, da dette kan føre til perforering.
- Kanyler røret med en 30 g kanyle, tilslut en standard 1 ml sprøjte og skyll coloN med normal saltvand for at evakuere resterende fækalt stof. Dette kan kræve flere mL saltvand.
- Når den distale tyktarm er tom, skal du fjerne røret og erstatte det med et nyt Teflon-rør og igen placere det direkte distalt på klemmen som beskrevet ovenfor.
- Undgå tyktarmen med en anden klemme ~ 3 mm distal til den proximale klemme ( dvs. over det indsatte rør, ~ 12 mm fra den analske kant), hvilket resulterer i et 3 mm isoleret segment, der skal inficeres.
BEMÆRK: For distal okklusion af segmentet har Fogarty koronararterieklip det mest velegnede, da de gummeres, hvilket fører til tæt okklusion af tyktarmen på trods af det intraluminale rør mellem klemmens grene. - Brug en anden sprøjte (standard 1 ml med en 30 G kanyle) til forsigtigt at injicere 50 - 80 μL 0,25% Trypsin-EDTA i det klumpede tyktarmsegment og inkuber i 10 minutter. Lad kanylen og sprøjten fastgøres til Teflon-røret for at undgå, at væsken lækker tilbage.
- Fjern først den distale klemme og derefter trypsinrøret.
- Skyll det distale kolon med ~ 500 μl normal saltopløsning for at fjerne resterende trypsin.
- Indsæt et nyt Teflon-rør, læg den distale klemme på plads og blæs kolonssegmentet op med 50 - 80 μL adenoviral opløsning (10 11 plaque-dannende enheder (PFU) / mL i fosfatbuffet saltopløsning) og inkuber i 30 minutter ( Figur 2A ).
BEMÆRK: Spild ikke viral opløsning, da kontakt med adeno-cre kan føre til tumorudvikling i ethvert væv af betinget mutante mus. - Fjern klemmerne og røret.
- Afslutning af maven og postoperativ genopretning
- Luk abdominalvæggen med 6-0 hurtigt absorberbar løbe suTures ( fx polydioxanon (PDS)).
- Luk huden med kirurgiske sårklip.
- Placer musen på varmepuden indstillet til 38 ° C, indtil den er fuldt ud genoprettet fra bedøvelsen.
- Administrer en anden bolus på 0,05 mg / kg buprenorphin ip 12 timer efter operationen, efterfulgt af yderligere buprenorphin bolus hver 12. time, hvis det er nødvendigt.
- Monitor musene mindst en gang dagligt for tegn på nød som følge af tumorvækst.
2. Koloskopi
BEMÆRK: Afhængigt af de anvendte betingede mutationer fører adenoviral infektion til endoskopisk synlige tumorer inden for 2 - 4 uger. Udfør derfor den første postoperative koloskopi 2 uger efter adenoviral induktion og gentag hver anden uge. Et kommercielt tilgængeligt system anbefales til murinsk koloskopi. 20
- Forberedelse af dyr til kolonoskopi
BEMÆRK: Ingen fasting er requirred. Resterende fækalt stof er normalt godt dannet i det distale tyktarm og kan skubbes ud over tumoren under koloskopi, hvilket gør den stressende proces med gentagen fastning unødvendig.- Brug sevofluran ved 3 - 3,5 vol% til generel anæstesi. Et tab af tårefleksrefleksen indikerer tilstrækkelig bedøvelse.
- Dækk øjnene hos de bedøvede mus med oftalmisk salve for at undgå udtørring af hornhinden.
- Hold musene i en liggende stilling på et lille bord.
- koloskopi
- Indsæt omfanget (diameter 1,9 mm, længde 10 cm) i tarmkanalen gennem anus og forsigtigt insufflat luft under visuel kontrol for at fjerne tyktarmen. Indsæt ikke mere luft end krævet til undersøgelsen.
BEMÆRK: Til luftinsufflation kan kolonoskopysystemets anti-tåge-luftpumpe anvendes. Hvis der ikke er nogen anti-tåge-luftpumpe, kan enhver anden luftpumpe med meget lave trykindstillinger anvendes eller førSsuriseret luft med en delikat trykreducerende ventil. Kuldioxid (CO 2 ) fører let til acidose hos små gnavere og skal derfor undgås. - Skub forsigtigt omfanget fremad, indtil en slimhinde læsion i det distale kolon kan identificeres ( Figur 1A - 1D ).
- Gem endoskopiske billeder til senere evaluering. Et endoskopisk scoringssystem til intraluminale tumorer er tidligere blevet beskrevet. 20
- Fjern forsigtigt rækkevidden og læg musen på varmepuden indstillet til 38 ° C, indtil den er fuldt ud genoprettet fra bedøvelsen.
- Indsæt omfanget (diameter 1,9 mm, længde 10 cm) i tarmkanalen gennem anus og forsigtigt insufflat luft under visuel kontrol for at fjerne tyktarmen. Indsæt ikke mere luft end krævet til undersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis det udføres tilstrækkeligt, udvikler> 85% af dyrene tumorer. Dødeligheden af den her fremlagte kirurgiske procedure er <5%, kolonoskopiens dødelighed er stort set ikke-eksisterende. I størstedelen af mus er en enkelt læsion detekteret; I ca. 30% kan 2-3 små adenomer detekteres, som sædvanligvis smelter til en enkelt tumor inden for 2 - 3 uger efter tumorinduktion.
Fænotypen og den biologiske opførsel af de resulterende tumorer er stærkt afhængig af dyrs betingede mutationer. Den lokale cre-medierede knockout af Apc er tilstrækkelig til at inducere tumorigenese og fører i starten til adenom, som kan påvises 2-4 uger efter adenovirusinfektion, og som udvikler sig til invasivt adenocarcinom inden for 12-16 uger. Denne proces kan accelereres ved at tilføje en betinget onkogen Kras mutation (Kras G12D), de resulterende tumorer udvikler sig hurtigt til invasiveadenocarcinom. Efter tilsætning af onkogen Tp53 R172H udvikler tumorerne hurtigt til invasivt og metastatisk carcinom. Overlevelse afhænger stærkt af tumorens genotype; Median overlevelse er normalt omkring 80-200 dage efter tumorinduktion. Dødsårsagen i de fleste tilfælde er stor tarmobstruktion sekundær til tumorvækst.
Tumorerne kan let og gentagne gange overvåges via koloskopi ( Figur 1 ) uden større stress for dyrene.
Sygdoms manifestationerne ligner meget på human CRC. Dyrene udvikler adenomer og i sidste ende adenocarcinomer i det distale kolon ( figur 2B, 2C, 2F ). Afhængig af musens betingede genotype metastaserer tumorerne også til peritoneum ( figur 2D ) leverne ( figur 2E ) og sjældne Lungerne (ikke vist). Hvis en cre reportere allel ( fx ZSGreen 19 ) anvendes, kan alle tumor manifestationer let identificeres. ZSGreen reporter allelen har en fluorescerende protein ekspression lyse nok til at være synlig ved dagslys ( Figur 1B , Figur 2C ).
Histologisk er 95% af de udviklende tumorer adenocarcinomer. Ca. 5% af tumorer er af mesenkymal oprindelse, fx fibrosarkom eller leiomyosarcoma, der antages at udvikle sig fra stromalceller, der ved en uheld er inficeret med adeno-cre. Histomorfologien af adenocarcinomerne ligner tæt på human CRC, og det indeholder hele spektret fra ikke-invasiv adenom til adenocarcinomindadvendende omgivende strukturer ( Figur 3A-3C ).
Filer / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
Figur 1. Koloskopiske billeder af kolorektale tumorer (betingede alleler af det givne dyr i parenteser).
A. Normal distal kolon. B. Tidligt adenom 2 uger efter adeno-cre infektion. Bemærk den grønne farve på grund af en GFP reporter allel i denne mus. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Sene adenom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Colorektalt adenocarcinom (som diagnosticeret ved patologi efter kolonoskopibillederne blev opnået; Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Klik her for at se en større version af denne figur.
2.jpg "/>
Figur 2. A. Intraoperativ Situs . Bemærk det store, gummierede Fogarty-klip i bunden og det transanalt indsatte rør til adeno-cre-injektion (rød pil). B. Colorectal tumor (hvid pil) med sammenhængende stor tarmobstruktion 8 uger efter adeno-cre infektion (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Colorektal tumor (hvid pil) 10 uger efter adeno-cre infektion (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Bemærk den grønlige farve på grund af en grøn fluorescerende protein (GFP) reporter allel i denne mus. D. Peritoneal carcinose (svarte pile) i GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Lever og tarm er blevet fjernet for at udsætte nyrerne og membranen. E. Brutto levermetastaser i GEMM 12 uger efter adeno-cre iFection (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colon med tumor efter fjernelse fra dyret afbildet i figur 2C . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Hematoxylin / Eosin (H / E) farvede sektioner af kolorektale tumorer fra GEMM.
A. Overgangszone fra normal slimhinde til adenocarcinom med infiltrering af slimhinde, submucosa og muskularis slimhinder (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Overgangszone fra normal colon slimhinder til invasivt adenocarcinom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Højkvalitets adenocarcinom med infiltrering af omgivende væv (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens de generelt er nemme at generere og vedligeholde, er klassiske CRC-musemodeller baseret på cellelinjinsprøjtning kunstige og kan ikke fuldt ud rekapitulere den menneskelige sygdom. Som følge heraf er GEMM'er blevet udviklet. Den første CRC GEMM var Apc Min- musen, som har en heterozygot null-mutation i Apc-genet, og efterligner derfor den menneskelige arvelige sygdom familiel adenomatøs polyposis (FAP). 21 Apc Min- mus udvikler dog altid flere intestinale adenomer, der ikke er begrænset til tyktarmen; Også tiden og den nøjagtige placering af adenomdannelsen er tilfældig, og tumorerne udvikler sjældent til maligne læsioner, da musen dør af godartet tumorbelastning, før adenomerne kan udvikle sig. Derfor er Apc Min- musen en model for FAP, ikke sporadisk CRC. Andre modeller præsenterer mutationer i DNA mismatch reparationsgener. 22 , 23 Selvom nogle af disseMus er fremragende modeller for arvelig gastrointestinal cancer, de repræsenterer ikke sporadisk kolorektal cancer.
Bortset fra den underliggende genetiske ændring er placeringen af den genetiske læsion, som adskiller modeller af sporadisk og syndromal kolorektal cancer. Alle ovennævnte modeller har mutationer, som er konstitutivt aktive eller induceret gennem tyktarmen eller endda hele mave-tarmkanalen. Dette resulterer i dannelsen af flere adenomer, som ikke er repræsentativ for human sporadisk CRC, næppe vurderes ved koloskopi, og derudover forlader normalt ikke tumorerne tilstrækkelig tid til at udvikle sig før dyret undertrykker den omfattende tumorbelastning. Derfor skal en musemodel for sporadisk kolorektal cancer indeholde lokal aktivering af kolorektal tumorigenese.
De tumorer, der opstår i den her præsenterede GEMM, er strengt begrænset til det kirurgisk spændte og adeno-cre-inficerede segmentAf tyktarmen. Dette resulterer i dannelsen af en enkelt tumor, der er let tilgængelig til påvisning og overvågning ved koloskopi. Desuden gør den distale placering tarmobstruktion en sen komplikation af tumorvækst, hvilket gør tumorerne til at udvikle sig til invasive og afhængig af genotypen, metastatisk carcinom, før dyret kræver eutanasi. En anden fordel ved segmentinfektion er det upåvirket miljø. I Apc Min og andre arvelige musemodeller lider den omgivende slimhinder og endda stromacellerne de samme genetiske afvigelser som tumorerne, tumorerne i den her foreslåede model udvikles inden for normal colonepitel og stroma. Dette muliggør mere realistisk tumor-vært interaktion og molekylære undersøgelser uden begrænsninger. Endvidere er tidspunktet for tumorinduktion veldefineret i denne model. Mens i Apc Min- musen udvikler tumorer efter "andet hit", hvor den anden Apc allel er stochastIcally tabt ved et tilfældigt tidspunkt, aktiveres alle ønskede mutationer samtidigt i den her beskrevne model, hvilket tillader undersøgelser af meget tidlige læsioner eller på hinanden følgende biopsier på en meget defineret måde.
Men denne model kommer også med begrænsninger. Krydsningen af flere alleler i en model kræver enorm tid og ressourcer; Derudover kan ikke alle afkom ofte bruges til forsøgene på grund af en uegnet genotype. Proceduren selv kræver praksis og er tidskrævende. Fremstillingen af adeno-cre-virus suspension med tilstrækkeligt høje titere og i store mængder er omkostningsintensive. Derfor er denne model ikke egnet til at erstatte alle andre CRC-musemodeller og vil være begrænset til laboratorier med et særligt fokus på GEM-modeller.
Selve protokollen er teknisk krævende, men med noget træning kan ikke-kirurgisk personale udføre procedurerne tilstrækkeligt. Det kritiske trin under adeno-cre iNfection er inflationen i det klamede tarmsegment - overskydende intraluminalt tryk fører til perforering, utilstrækkeligt tryk reducerer hastigheden af vellykket infektion. Dette trin kræver træning.
En protokol for adenoviral infektion i det distale kolon er blevet offentliggjort af Hung et al. Før. 13 Den her præsenterede protokol adskiller sig fra den ovennævnte protokol i flere vigtige aspekter. Da det ofte forårsager tarmperforering i uerfarne hænder, slettes mekanisk slid af slimhinden før adeno-cre-inkubation i den foreliggende protokol. Dette resulterer i en reduceret tumordannelseshastighed, som imidlertid kan modvirkes af forøgede viraltitere. På denne måde kan mængden af mesenkymale tumorer også reduceres, da uden mucosal slid mindre mesenkymale celler i tarmvæggen udsættes for adeno-cre.
I modsætning til den ovennævnte protokol 13 er der her ogsåBeskrevet protokol anbefaler ikke natten over fastende før kirurgi eller koloskopi. I stedet tømmer tarmen eller, i tilfælde af koloskopi, simpel mekanisk manipulation bruges til at fjerne resterende fækalt stof. Denne forbedring af protokollen forbedrer dyrevelfærden dramatisk. Ophold fasting er en meget stressende procedure for små gnavere og er kendt for stærkt at påvirke den murine metabolisme og påvirker derfor eksperimentelle resultater. 24 , 25 Disse uønskede effekter af natten fasting kan undgås i det her præsenterede manuskript.
En anden vigtig forskel mellem den her præsenterede protokol og protokollen af Hung et al. Er længden af det fastspændte segment (og dermed inficeret). Mens den her beskrevne protokol anbefaler en kort længde (~ 3 mm), er Hung et al. Anbefaler 20 mm af det distale tyktarm, der skal inficeres. Den kortere segmentlængde er valgt for at reducere antalletAf rekombinerede krypter og dermed resulterende tumorer. Da størstedelen af patienter med sporadisk CRC udvikler en enkelt tumor i stedet for flere tumorer, øger denne foranstaltning den kliniske relevans af modellen. Graden af tumordannelse synes ikke at være påvirket af den reducerede overflade af inficeret tyktarm.
Fremtidige anvendelser af denne teknik indbefatter alle protokoller, der kræver lokal cre-rekombination i colon mucosa. De fleste anvendelser i kræftforskning vil omfatte betingede onkogener, hvilket fører til dannelse af kolorektale tumorer; Imidlertid kan alle andre anvendelser såsom inducerende reporterkonstruktioner inden i colon mucosa opnås med den her præsenterede protokol.
Som konklusion giver den her præsenterede kombination af en yderst sofistikeret genetisk manipuleret musemodel af kolorektal cancer sammen med muligheden for kolonoskopi med høj opløsning til påvisning og overvågning af udviklende tumorer at tilvejebringeS en fremragende ramme for at studere biologi og behandling af CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er dedikeret til hukommelsen til professor Moritz Koch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F. Fasting of mice: a review. Lab Anim. 47 (4), 225-240 (2013).
