Summary
Een protocol voor de oprichting van een genetisch gemanipuleerde muismodel van colorectale kanker door middel van segmentale adeno-cre infectie en zijn bewaking via hoge resolutie colonoscopie wordt gepresenteerd.
Abstract
Ondanks de voordelen van makkelijke toepasselijkheid en kosteneffectiviteit, hebben muskelkankermuizenmodellen op basis van tumorcelinjectie ernstige beperkingen en worden de tumorbiologie en tumorcel-verspreiding niet nauwkeurig gesimuleerd. Genetisch gemanipuleerde muismodellen zijn geïntroduceerd om deze beperkingen te overwinnen; Dergelijke modellen zijn echter technisch veeleisend, met name in grote organen zoals de dikke darm waarin slechts een enkele tumor gewenst is.
Als gevolg daarvan werd een immunocompetent, genetisch gemanipuleerd muismodel van colorectale kanker ontwikkeld die zeer uniforme tumoren ontwikkelt en kan gebruikt worden voor tumorbiologie studies en therapeutische proeven. Tumorontwikkeling wordt geïnitieerd door chirurgische, segmentale infectie van de distale dikke darm met adeno-cre-virus in samengestelde voorwaardelijke mutante muizen. De tumoren kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd en gecontroleerd via colonoscopie. Hier beschrijven we de chirurgische techniek van segmentale adeno-cre infectie vanDe dikke darm, het bewaken van de tumor via hoge resolutie colonoscopie en presenteren de resulterende colorectale tumoren.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) blijft een van de belangrijkste oorzaken van kankerverwante dood in westerse landen. 1 Terwijl de prognose van patiënten met vroegtijdige ziekte goed is, worden veel tumoren gediagnosticeerd in latere fasen, waarbij de prognose ondanks talrijke behandelingsopties beperkt is. 2 , 3 , 4 , 5
De meerderheid van de huidige muismodellen van CRC zijn gebaseerd op de implantatie van tumorcellen afgeleid van cellijnen of patiënttumoren in immunodeficiënte muizen. 6 , 7 , 8 Dit leidt tot lokale en, afhankelijk van de injectieplaats en de tumorcellen die worden gebruikt voor injectie, soms metastatische tumoren. 9 , 10 Maar de resulterende xenograftmodellen hebben majoBeperkingen. Ze moeten worden vastgesteld in immunodeficiënte muizen, waardoor de complexe interactie tussen de tumor en het immuunsysteem van de gastheer wordt opgeheven. Bovendien, aangezien het tumorstroma afgeleid is van gastheercellen, is de interactie tussen humane tumorparenchyma en muizenstroma defect en derhalve niet representatief voor de ziekte. Deze tekortkomingen kunnen vermeden worden door het gebruik van muizencellijnen voor injectie. Echter, er zijn maar weinig muizen CRC-cellijnen beschikbaar en, vergelijkbaar met de meeste beschikbare humane CRC-cellijnen, zijn monoklonale en zeer anaplastische. 11 Kortom, de meeste beschikbare CRC-muismodellen zijn zeer kunstmatig en niet volledig representatief voor de menselijke ziekte.
Genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's) van CRC kunnen deze nadelen vermijden aangezien zij echte muistumoren bevatten die worden gecreëerd via inductie van belangrijke mutaties van CRC in de dikke darm. 12 , 13 ,14 Dit kan worden bereikt door de activatie van conditional (floxed) germline mutaties door cre recombinase binnen de colorectale mucosa. Terwijl in GEMM's van veel andere tumorentiteiten kiemlijn (induceerbare) cre-expressie wordt aangedreven door weefselspecifieke promotors, kan germline cre niet in de dikke darm worden gebruikt, aangezien dit leidt tot een groot aantal adenomen in de dikke darm waardoor de dood door goedaardige tumorbelasting bij Een zeer jonge leeftijd. Daarom wordt in het hier beschreven model een adenovirale vectoruitdrukkende cre gebruikt om een kort darmsegment te infecteren. Dit leidt tot de inductie van tumorigenese binnen dit segment van de slijmvliezen op een tijdstip bepaald door de onderzoeker, waardoor adenomen uiteindelijk naar invasieve en metastatische carcinoom gaan. De tumoren zijn echte muistumoren, groeien in een intacte microomgeving en kunnen daarom het geheel van colorectale oncogenese simuleren, waaronder tumor-gastheerinteractie en de metastatische cascade. Dit model isDaarom een aantrekkelijk platform voor studies van kankerbiologie en preklinische therapeutische proeven.
Een belangrijk nadeel van genetisch gemanipuleerde muismodellen van CRC is hun technische complexiteit. Lokale bezorging met behulp van rectale adeno-cre enemas in muizen die gevlochten Apc allelen heeft, is eerder beschreven; Echter, de incidentie, multipliciteit en plaats van de darm tumoren kunnen zeer variabel zijn met deze techniek. 15 Daarom is de techniek om de adeno-cre infectie te beperken door chirurgische klemmen van het te induceren segment te ontwikkelen. 13 Wij hebben deze procedure aangepast om het dierenwelzijn te verbeteren, evenals de sterfte en het aantal resulterende tumoren te verminderen. Met dit protocol moeten alle laboratoria met ervaring in kleine knaagdierchirurgie het model kunnen reproduceren en tumoren produceren die zeer reproduceerbaar en gemakkelijk toegankelijk zijn voor colonoscopie. Afhankelijk van de voorwaardelijke mUitingen die worden gebruikt voor tumorigenese, kan het volledige spectrum van adenoom, invasieve carcinoom en metastasen waargenomen worden. Aangezien de tumoren zich in de distale dikke darm bevinden, is seriële endoscopische beoordeling eenvoudig in dit model mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier gepresenteerde dierproeven werden onafhankelijk beoordeeld en goedgekeurd door een institutioneel en een overheidsdier voor dierenwelzijn en gebruik en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Federatie van Laboratorium Diervoederverenigingen (FELASA). Alle mogelijke maatregelen werden genomen om het lijden te verminderen, met inbegrip van verdoving en analgesie of, indien nodig, vroegtijdige euthanasie.
1. Lokale tumorinductie via chirurgische adeno-cre infectie
- Voorbereiding van dieren voor operatie
OPMERKING: Vrijwel elke voorwaardelijke ("floxed") mutatie kan worden geïnduceerd via de hier beschreven methode. Het gebruik van mutaties in genen die relevant zijn voor colorectale kanker zoals Apc, Kras of Tp53 wordt aanbevolen. De efficiëntie van cre-recombinatie is afhankelijk van de grootte van het te elimineren construct. Grote gevlochten sequenties worden minder efficiënt gesneden. De recombinatie van alle allelen moet door de pc in de tumoren worden bevestigdR.- Voor de ontwikkeling van colorectale tumoren, gebruik een kruis van de volgende voorwaardelijke allelen voor een basismodel van CRC (MGI databanknummer tussen haakjes):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Als een fluorescentieverslaggever allele nodig is ( bijvoorbeeld om micrometastasen te detecteren), gebruik dan de volgende allel:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
OPMERKING: Alle bovenstaande stammen zijn verkrijgbaar via de NCI Mouse Repository of het Jackson Laboratory. Geen vasten is nodig aangezien alle overgebleven fecale stoffen vóór de adenovirale infectie kunnen worden afgespoeld. Preoperatieve vasten leidt tot hogere perioperatieve sterfte en vormt enorme stress voor kleine knaagdieren. - Gebruik sevofluraan bij 3 - 3,5 vol% voor algemene verdoving. Een verlies van tHij geeft een nippelreflex aan.
- Voor de eerste incisie injecteer 0,05 mg / kg buprenorfine subcutaan.
- Bedek de ogen van de verdoofde muis met oftalmische zalf om uitdroging van de hoornvlies te vermijden.
- Plaats de muis in een rugliggende positie op een kleine tafel. Gebruik niet-traumatische kleefbandjes om de muis te beperken.
- Scheer de buik met een elektrische scheerapparaat (afzettende crème kan alternatief worden gebruikt) en desinfecteren met alcoholwatten of jodium. Gebruik de door de fabrikant aanbevolen contacttijd.
- Bedek het chirurgische veld met steriele gordijnen.
OPMERKING: Het gebruik van perioperatieve antibiotica is facultatief en onderworpen aan institutionele richtlijnen. - Gebruik steriele single-use of gesteriliseerde instrumenten voor alle chirurgische procedures.
- Voor de ontwikkeling van colorectale tumoren, gebruik een kruis van de volgende voorwaardelijke allelen voor een basismodel van CRC (MGI databanknummer tussen haakjes):
- Midlijn laparotomie en blootstelling van de dikke darm
- Gebruik een schaar (scalpels kunnen alternatief worden gebruikt) om een middelste snede te maken(~ 15 mm) van de huid op de onderbuik.
- Pak de buikspiermuskulatuur op met pincet en zorg het voorzichtig met een schaar, zodat de buikholte wordt geopend.
- Identificeer de distale dikke darm, raak het alleen met atraumatische tang. Klem de dikke darm met een delicate klem ( bijv . Een Micro Serrefine vascular clamp) ongeveer 15 mm proximaal van de anus.
OPMERKING: Speciale aandacht besteden aan de kwetsbaarheid van de dikke darm. Perforatie leidt onvermijdelijk tot peritonitis en sepsis en vereist euthanasie van het dier.
- Segmentale dikke darm infectie met Adeno-cre virus
- Breng een flexibele Teflon buis transanaal in en zorg voorzichtig totdat het de lumen-okklusie bereikt door de klem die eerder bij 15 mm van de anale rand is geplaatst. Gebruik geen overmatige kracht, omdat dit kan leiden tot perforatie.
- Verbind de buis met een 30G kanyle, verbind een standaard 1 ml spuit en spoel de coloN met normale zoutoplossing om de resterende fecale stof te evacueren. Dit kan een aantal ml zoutoplossing vereisen.
- Zodra de distale dikke darm leeg is, verwijder de buis en vervang deze met een frisse Teflonbuis en plaats deze weer direct distaal aan de klem zoals hierboven beschreven.
- Zet de dikke darm bij een tweede klem ~ 3 mm distaal aan de proximale klem ( dwz over de ingebouwde buis, ~ 12 mm van de anale rand), waardoor er een geïnfecteerd 3 mm-segment is.
OPMERKING: Voor distale occlusie van het segment hebben Fogarty-coronaire klappen zich het meest geschikt aangezien ze gegumpeerd zijn, waardoor de dikke darm dicht wordt afgesloten ondanks de intraluminale buis tussen de takken van de klem. - Gebruik een tweede spuit (standaard 1 ml met een 30G canule) om 50 tot 80 μL 0,25% Trypsin-EDTA nauwkeurig in het geklemde darmsegment te injecteren en 10 minuten te incuberen. Laat de canule en de spuit aan de Teflonbuis vastzetten om te voorkomen dat de vloeistof terug lekt.
- Verwijder eerst de distale klem en vervolgens de trypsinbuis.
- Spoel de distale dikke darm met ~ 500 μL normale zoutoplossing om resterende trypsine te verwijderen.
- Plaats een nieuwe Teflonbuis, plaats de distale klem terug en plaats het darmsegment met 50 - 80 μL adenovirale oplossing (10 11 plaque-forming units (PFU) / mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing) en incubeer gedurende 30 minuten ( Figuur 2A ).
OPMERKING: Spoel geen virale oplossing omdat contact met adeno-cre kan leiden tot tumorontwikkeling in elk weefsel van voorwaardelijke mutante muizen. - Verwijder de klemmen en de buis.
- Sluiting van de buik en postoperatieve herstel
- Sluit de buikwand met 6-0 snel absorbeerbare hardloopTures ( bijvoorbeeld polydioxanon (PDS)).
- Sluit de huid met chirurgische wondklemmen.
- Plaats de muis op het verwarmingspaneel ingesteld op 38 ° C tot het volledig uit de anesthesie is hersteld.
- Geef een andere bolus van 0,05 mg / kg buprenorfine ip 12 uur na de operatie, gevolgd door extra buprenorfine bolussen om de 12 uur indien nodig.
- Monitor de muizen ten minste eenmaal per dag voor tekenen van nood als gevolg van tumorgroei.
2. Colonoscopie
OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte voorwaardelijke mutaties leidt adenovirale infectie tot endoscopisch zichtbare tumoren binnen 2 - 4 weken. Voer daarom de eerste postoperatieve colonoscopie 2 weken na de adenovirale inductie uit en herhaal elke 2 weken. Een commercieel verkrijgbaar systeem wordt aanbevolen voor muizen colonoscopie. 20
- Voorbereiding van dieren voor colonoscopie
OPMERKING: Geen vasten is required. Resterende fecale stof is meestal goed gevormd in de distale dikke darm en kan tijdens de colonoscopie buiten de tumor worden geduwd, waardoor het stressvolle proces van herhaalde vasten onnodig wordt.- Gebruik sevofluraan bij 3 - 3,5 vol% voor algemene verdoving. Een verlies van de teenvliesreflex geeft voldoende narkose aan.
- Bedek de ogen van de verdoofde muizen met oftalmische zalf om uitdroging van de hoornvlies te vermijden.
- Houd de muizen in een rugliggende positie op een kleine tafel.
- colonoscopie
- Plaats het bereik (diameter 1,9 mm, lengte 10 cm) in het darmkanaal door de anus en zorgvuldig insufflate lucht onder visuele controle om de dikke darm te verdelen. Maak geen lucht meer dan nodig voor het onderzoek.
OPMERKING: Voor luchtinsufflatie mag de anti-mist luchtpomp van het colonoscopiesysteem gebruikt worden. Als er geen anti-mist luchtpomp beschikbaar is, kan elke andere luchtpomp met zeer lage drukinstellingen gebruikt worden of voorafSsurized lucht met een delicate drukreductieklep. Kooldioxide (CO 2 ) leidt gemakkelijk tot acidose bij kleine knaagdieren en moet daarom vermeden worden. - Zet het bereik voorzichtig voorzichtig tot een mucosale letsel in de distale dikke darm kan worden geïdentificeerd ( Figuur 1A - 1D ).
- Bewaar endoscopische afbeeldingen voor latere evaluatie. Een endoscopisch scoringssysteem voor intraluminale tumoren is eerder beschreven. 20
- Verwijder het bereik zorgvuldig en plaats de muis op het verwarmingspaneel ingesteld op 38 ° C tot het volledig is hersteld van de verdoving.
- Plaats het bereik (diameter 1,9 mm, lengte 10 cm) in het darmkanaal door de anus en zorgvuldig insufflate lucht onder visuele controle om de dikke darm te verdelen. Maak geen lucht meer dan nodig voor het onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als adequaat uitgevoerd, ontwikkelen> 85% van de dieren tumoren. De sterfte van de hier beschreven chirurgische procedure is <5%, de sterfte van de colonoscopie is vrijwel niet bestaand. In de meerderheid van de muizen wordt een enkele letsel gedetecteerd; In ongeveer 30% kunnen 2 tot 3 kleine adenomen worden gedetecteerd die binnen 2 tot 3 weken na een tumorinductie door een enkele tumor worden gesmolten.
Het fenotype en biologisch gedrag van de resulterende tumoren is sterk afhankelijk van de voorwaardelijke mutaties van de dieren. De lokale gecommuniceerde knock-out van Apc is voldoende om tumorigenese te veroorzaken en leidt tot adenoom, die 2 tot 4 weken na adenovirale infectie kan worden gedetecteerd en binnen 12 tot 16 weken naar invasieve adenocarcinoom gaat. Dit proces kan worden versneld door een voorwaardelijke oncogene Kras mutatie (Kras G12D) toe te voegen, de resulterende tumoren gaan snel vooruit naar invasieveadenocarcinoom. Bij de toevoeging van oncogene Tp53 R172H worden de tumoren snel ontwikkeld tot invasieve en metastatische carcinoom. Overleving hangt sterk af van het genotype van de tumoren; Mediane overleving is meestal ongeveer 80 - 200 dagen na tumorinductie. De oorzaak van de dood in de overgrote meerderheid van de gevallen is dikke darm obstructie, afgezien van tumorgroei.
De tumoren kunnen gemakkelijk en herhaaldelijk worden gecontroleerd via colonoscopie ( Figuur 1 ) zonder grote stress voor de dieren.
De ziekte manifestaties zijn zeer vergelijkbaar met menselijke CRC. De dieren ontwikkelen adenomen en uiteindelijk adenocarcinomen van de distale dikke darm ( figuren 2B, 2C, 2F ). Afhankelijk van het voorwaardelijke genotype van de muizen worden de tumoren ook gemetastaseerd naar het peritoneum ( Figuur 2D ), de lever ( Figuur 2E ) en zeldzaam Lijd de longen (niet afgebeeld). Als er een cre-reporter-allel ( bijvoorbeeld ZSGreen 19 ) wordt gebruikt, kunnen alle tumor manifestaties gemakkelijk worden geïdentificeerd. De ZSGreen reporter-allele heeft een fluorescerende eiwituitdrukking, die helder genoeg is om zichtbaar te zijn bij daglicht ( Figuur 1B , Figuur 2C ).
Histologisch zijn 95% van de ontwikkelende tumoren adenocarcinomen. Ongeveer 5% van de tumoren hebben mesenchymale afkomst, bijvoorbeeld fibrosarcoma of leiomyosarcoom, die waarschijnlijk ontstaan uit stromale cellen die per ongeluk met adeno-cre zijn geïnfecteerd. De histomorfologie van de adenocarcinomen lijkt zeer op het menselijke CRC, dat het gehele spectrum van niet-invasieve adenoom aan adenocarcinoom invallende omliggende structuren kenmerkt ( Figuur 3A-3C ).
Bestanden / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
Figuur 1. Colonoscopische afbeeldingen van colorectale tumoren (conditional allelen van het gegeven dier tussen haakjes).
A. Normale distale colon. B. Early adenoma 2 weken na adeno-cre infectie. Let op de groene kleur door een GFP reporter allel in deze muis. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Laat adenoom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Colorectale adenocarcinoom (zoals gediagnosticeerd door pathologie nadat de colonoscopie beelden werden verkregen; Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2.jpg "/>
Figuur 2. A. Intraoperatieve Situs . Let op de grote, rubberen Fogarty clip onderaan en de transanaal ingebouwde buis voor adeno-cre injectie (rode pijl). B. Colorectale tumor (witte pijl) met opeenvolgende dikke darm obstructie 8 weken na adeno-cre infectie (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Colorectale tumor (witte pijl) 10 weken na adeno-infectie (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Let op de groene kleur door een groene fluorescerende proteïne (GFP) reporter allel in deze muis. D. Peritoneale carcinose (zwarte pijlen) in de GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Lever en darm zijn verwijderd om de nieren en het diafragma bloot te stellen. E. Bruto levermetastasen in de GEMM 12 weken na adeno-cre inFection (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colon met tumor na verwijdering uit het dier afgebeeld in Figuur 2C . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Hematoxyline / Eosine (H / E) Gebleekte Afdelingen van Colorectale Tumoren uit het GEMM.
A. Overgangszone van normale mucosa tot adenocarcinoom met infiltratie van mucosa, submucosa en muscularis mucosae (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Overgangszone van normaal colonslijmvlies tot invasieve adenocarcinoom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Hoogwaardig adenocarcinoom met infiltratie van omringend weefsel (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel ze over het algemeen makkelijk te genereren en te onderhouden zijn, zijn klassieke CRC-muismodellen op basis van cellijninjectie kunstmatig en kunnen ze de menselijke ziekte niet volledig herhalen. Als gevolg hiervan zijn GEMM's ontwikkeld. De eerste CRC GEMM was de Apc Min muis, die een heterozygotische null mutatie in het Apc gen heeft, waardoor de menselijke erfelijke ziekte familiale adenomatische polyposis (FAP) nabootst. 21 Apc Min muizen ontwikkelen echter altijd meerdere intestinale adenomen die niet beperkt zijn tot de dikke darm; Ook is de tijd en de precieze plaats van adenoomvorming willekeurig en de tumoren ontwikkelen zelden tot kwaadaardige letsels, aangezien de muis sterfte van goede tumorlast loopt voordat de adenomen kunnen voortgang. Daarom is de Apc Min muis een model van FAP, niet sporadisch CRC. Andere modellen presenteren mutaties in DNA-mismatch reparatiegenen. 22 , 23 Hoewel sommige van dezeMuizen zijn uitstekende modellen voor erfelijke gastro-intestinale kanker, zij vertegenwoordigen geen sporadische colorectale kanker.
Afgezien van de onderliggende genetische verandering is het de plaats van het genetische letsel dat de modellen van sporadische en syndromale colorectale kanker onderscheidt. Al de bovengenoemde modellen hebben mutaties die constitutief actief zijn of door de hele colon of zelfs door het hele maagdarmkanaal geïnduceerd worden. Dit resulteert in de vorming van meerdere adenomen, die niet representatief is voor menselijke sporadische CRC, nauwelijks te beoordelen door colonoscopie en bovendien vertoont de tumoren meestal niet voldoende tijd om te ontwikkelen voordat het dier zwanger wordt naar de uitgebreide tumorbelasting. Daarom moet een muismodel voor sporadische colorectale kanker plaatselijke activering van colorectale tumorigenese omvatten.
De tumoren die voortvloeien uit de hier gepresenteerde GEMM zijn strikt beperkt tot het segment dat door chirurgisch ingeklemd en adeno-cre geïnfecteerd wordtVan de dikke darm. Dit resulteert in de vorming van een enkele tumor die gemakkelijk toegankelijk is voor detectie en bewaking door colonoscopie. Daarnaast maakt de distale locatie de darmobstructie een late complicatie van tumorgroei waardoor de tumoren zich kunnen ontwikkelen tot invasieve en, afhankelijk van het genotype, metastatisch carcinoom voordat het dier euthanasie vereist. Een ander voordeel van segmentale cre infectie is de onaangetaste omgeving. Terwijl in Apc Min en andere erfelijke muismodellen, de omliggende slijmvliezen en zelfs de stromale cellen lijden aan dezelfde genetische afwijkingen als de tumoren, ontwikkelen de tumoren in het hier voorgestelde model binnen normaal colonepithelium en stroma. Dit maakt het mogelijk om meer realistische tumor-gastheer interactie en moleculaire studies zonder beperkingen mogelijk te maken. Bovendien is het tijdstip van tumorinductie goed gedefinieerd in dit model. Tijdens de Apc Min- muis ontwikkelen tumoren na de 'second hit', waarbij de tweede Apc-allele stochast isIcally verloren op een willekeurig tijdstip, worden alle gewenste mutaties gelijktijdig geactiveerd in het hier beschreven model, waardoor studies van zeer vroege letsels of opeenvolgende biopsies op een zeer bepaalde manier mogelijk zijn.
Dit model komt echter ook met beperkingen. Het oversteken van meerdere allelen in één model vereist enorme tijd en middelen; Bovendien kunnen vaak niet alle nakomelingen worden gebruikt voor de experimenten door een ongeschikt genotype. De procedure zelf vereist oefening en is tijdrovend. De productie van adeno-cre virus suspensie met voldoende hoge titers en in grote hoeveelheden is kostenintensief. Daarom is dit model niet geschikt om alle andere CRC-muismodellen te vervangen en wordt beperkt tot laboratoria met een specifieke focus op GEM-modellen.
Het protocol zelf is technisch veeleisend, maar met een opleiding kan niet-chirurgisch personeel de procedures adequaat uitvoeren. De kritische stap tijdens de adeno-cre iNfectie is de inflatie van het vastgeklemde darmsegment - overmatige intraluminale druk leidt tot perforatie, onvoldoende druk vermindert de snelheid van succesvolle infectie. Deze stap vereist training.
Een protocol voor adenovirale infectie van de distale dikke darm is gepubliceerd door Hung et al. voor. 13 Het hier gepresenteerde protocol verschilt van het voornoemde protocol in verscheidene belangrijke aspecten. Aangezien het dikke darm perforatie in onervaren handen veroorzaakt, wordt mechanisch slijtage van de slijmvlies voor adeno-cre incubatie in het onderhavige protocol overgeslagen. Dit resulteert in een verminderde snelheid van tumorvorming, die echter kan worden tegengegaan door verhoogde virale titers. Op deze manier kan de snelheid van mesenchymale tumoren ook verminderd worden, aangezien zonder mucosale schuring minder mesenchymale cellen binnen de darmwand worden blootgesteld aan adeno-cre.
Ook in tegenstelling tot het hierboven genoemde protocol 13 is het hierBeschreven protocol raadt geen nacht vasten voor de operatie of colonoscopie. In plaats daarvan wordt spoelvorming of, bij colonoscopie, eenvoudige mechanische manipulatie gebruikt om de resterende fecale stof te verwijderen. Deze verfijning van het protocol verbetert het dierenwelzijn dramatisch. Overnight fasting is een zeer stressvolle procedure voor kleine knaagdieren en heeft de invloed op de meneuze stofwisseling sterk beïnvloed en beïnvloedt daarmee ook experimentele resultaten. 24 , 25 Deze ongewenste effecten van 's nachts vasten kunnen vermeden worden in het hier gepresenteerde manuscript.
Een ander belangrijk verschil tussen het hier gepresenteerde protocol en het protocol van Hung et al. Is de lengte van het geklemde (en dus geïnfecteerde) segment. Terwijl het hier beschreven protocol aanbevolen een korte lengte (~ 3 mm), Hung et al. Aan te bevelen 20 mm van de infectie van de distale dikke darm. De kortere segmentlengte is gekozen om het nummer te verminderenVan gecombineerde crypten en aldus resulterende tumoren. Aangezien de meerderheid van de patiënten met sporadisch CRC één tumor ontwikkelt in plaats van meerdere tumoren, verhoogt deze maatregel de klinische relevantie van het model. De snelheid van de tumorvorming lijkt niet te worden beïnvloed door het verminderde oppervlak van geïnfecteerde dikke darm.
Toekomstige toepassingen van deze techniek omvatten alle protocollen die lokale cre-recombinatie binnen de dikke darm van de dikke darm vereisen. De meeste toepassingen in kankeronderzoek zullen conditional oncogenes omvatten, die leiden tot de vorming van colorectale tumoren; Echter kunnen alle andere toepassingen zoals inductieve reporterconstructies binnen de dikke darmkanaal worden bereikt met het hier gepresenteerde protocol.
Concluderend, de hier gepresenteerde combinatie van een zeer verfijnde genetisch gemanipuleerde muismodel van colorectale kanker, samen met de mogelijkheid van colonoscopie met hoge resolutie voor de detectie en bewaking van de ontwikkelende tumoren, verschaftHet is een uitstekende setting om de biologie en de behandeling van CRC te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk is gewijd aan de herinnering van professor Moritz Koch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F.
