Summary
En protokoll for etablering av en genetisk utviklet musemodell av kolorektal kreft ved segmentert adeno-cre infeksjon og overvåkning via kolonoskopi med høy oppløsning presenteres.
Abstract
Til tross for fordelene ved enkel brukbarhet og kostnadseffektivitet, har muskelmodeller med tykktarmskreft basert på tumorcelleinjeksjon alvorlige begrensninger og simulerer ikke nøyaktig simulering av tumorbiologi og tumorcelle. Genetisk utviklede musemodeller er innført for å overvinne disse begrensningene; Imidlertid er slike modeller teknisk krevende, spesielt i store organer som tykktarmen der bare en enkelt tumor er ønsket.
Som et resultat ble en immunokompetent, genetisk utviklet musemodell av kolorektal kreft utviklet som utvikler høyt ensartede tumorer og kan brukes til tumorbiologi studier samt terapeutiske studier. Tumorutvikling initieres ved kirurgisk, segmental infeksjon i distal kolon med adeno-cre-virus i sammensatte betingede mutante mus. Tumorene kan lett oppdages og overvåkes via koloskopi. Vi beskriver her kirurgisk teknikk for segmental adeno-cre infeksjon avKolon, overvåkning av svulsten via kolonoskopi med høy oppløsning og presentere de resulterende kolorektale svulstene.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) er fortsatt en av de viktigste årsakene til kreftrelatert død i vestlige land. 1 Mens prognosen til pasienter med tidlig stadiumssykdom er god, diagnostiseres mange svulster ved senere stadier der, til tross for mange behandlingsalternativer, er prognosen begrenset. 2 , 3 , 4 , 5
Flertallet av nåværende musemodeller av CRC er basert på implantering av tumorceller som er avledet fra cellelinjer eller pasienttumorer i immunodeficiente mus. 6 , 7 , 8 Dette fører til lokal og, avhengig av injeksjonsstedet og tumorcellene som brukes til injeksjon, noen ganger metastaserende tumorer. 9 , 10 Imidlertid har de resulterende xenograftmodellene majoR begrensninger. De må etableres i immunodeficiente mus, og eliminerer dermed det komplekse samspillet mellom svulsten og vertsimmunsystemet. I tillegg, da tumorstroma er avledet fra vertsceller, er samspillet mellom humant tumorparenchyma og murint stroma defekt og derfor ikke representativt for sykdommen. Disse manglene kan unngås ved bruk av murine cellelinjer for injeksjon. Imidlertid er bare få muse-CRC-cellelinjer tilgjengelige, og er lik monoklonale og svært anaplastiske, som de fleste tilgjengelige humane CRC-cellelinjer. 11 Sammendrag er de fleste tilgjengelige CRC-musemodellene svært kunstige og ikke fullt representative for den menneskelige sykdommen.
Genetisk utviklede musemodeller (GEMMs) av CRC kan unngå disse ulempene da de har ekte musetumorer som er opprettet via induksjon av nøkkelmutasjoner av CRC i kolon. 12 , 13 ,14 Dette kan oppnås ved aktivering av betingede (floxed) germline mutasjoner av cre recombinase i kolorektal mucosa. Mens det i GEMMer av mange andre tumor-enheter er kimlinje (inducerbart) cre-uttrykk drevet av vevsspesifikke promotorer, kan germline cre ikke brukes i tykktarmen da dette fører til et stort antall adenomer gjennom tykktarmen som forårsaker død ved godartet tumorbelastning ved En veldig ung alder. Derfor, i den her beskrevne modellen, brukes en adenoviral vektor-uttrykkende cre til å infisere et kort tarmsegment. Dette fører til induksjon av tumorigenese innenfor dette segmentet av slimhinnen på et tidspunkt definert av etterforskeren, noe som resulterer i adenomer i ferd med å utvikle seg til invasiv og metastatisk karsinom. Tumorene er ekte musetumorer, vokser i intakt mikromiljø og kan derfor simulere hele kolorektal onkogenesen, inkludert tumor-vert-interaksjon og metastatisk kaskade. Denne modellen erDerfor en attraktiv plattform for studier av kreftbiologi og prekliniske terapeutiske studier.
En stor ulempe med genetisk utviklede musemodeller av CRC er deres tekniske kompleksitet. Lokal kreverlevering ved hjelp av rektale adeno-cre-enemaser i mus som bærer flomede Apc-alleler, er tidligere beskrevet; Imidlertid kan forekomsten, multiplikasjonen og plasseringen av tarmtumorene være svært variabel med denne teknikken. Derfor er teknikken for å begrense adeno-cre-infeksjonen ved kirurgisk klemming av segmentet som skal induseres, blitt utviklet. 13 Vi har endret denne prosedyren for å forbedre dyrevelferd, samt redusere dødelighet og antall resulterende svulster. Med denne protokollen skal alle laboratorier med erfaring i liten gnagekirurgi kunne reproducere modellen og produsere svulster som er svært reproduserbare og lett tilgjengelige for koloskopi. Avhengig av betinget mUtgaver som brukes til tumorigenese, det fullstendige spektrum av adenom, invasiv karsinom og metastaser kan observeres. Da svulstene befinner seg i distal kolon, er seriell endoskopisk vurdering lett mulig i denne modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøkene som presenteres her, ble uavhengig gjennomgått og godkjent av en institusjonell og en statlig dyrepleie- og brukskomité og ble utført i henhold til retningslinjer fra FELASA (Federation of Laboratory Animal Science Associations). Alle mulige tiltak ble tatt for å minimere lidelse, inkludert anestesi og analgesi eller om nødvendig for tidlig dødshjelp.
1. Lokal tumorinduksjon via kirurgisk adeno-cre-infeksjon
- Forberedelse av dyr for kirurgi
MERK: Nesten enhver betinget ("floxed") mutasjon kan induseres via den her beskrevne metoden. Bruk av mutasjoner i gener som er relevante for kolorektal kreft, som Apc, Kras eller Tp53, anbefales. Effektiviteten av cre rekombinasjon er avhengig av størrelsen på konstruksjonen som skal utskåret. Store floksede sekvenser blir skåret ut mindre effektivt. Rekombinationen av alle alleler bør bekreftes i tumorene ved PCR.- For utvikling av kolorektale tumorer, bruk et kryss av følgende betingede alleler for en grunnleggende modell av CRC (MGI databasenummer i parentes):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Hvis en fluorescens reporter allel er nødvendig (for eksempel å oppdage mikrometastaser), bruk følgende allel:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
MERK: Alle overstammene er tilgjengelige via NCI Mouse Repository eller Jackson Laboratory. Ingen fasting er nødvendig da alle resterende fecale stoffer kan spyles ut før adenoviral infeksjon. Preoperativ fasting fører til høyere perioperativ dødelighet og utgjør enorm stress for små gnagere. - Bruk sevofluran ved 3 - 3,5 vol% for generell anestesi. Et tap på tHan tåspenningsrefleks indikerer tilstrekkelig anestesi.
- Før første snitt injiseres 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant.
- Dekk øynene til den bedøvede musen med oftalmisk salve for å unngå uttørking av hornhinnen.
- Plasser musen i en liggende stilling på et lite bord. Bruk ikke-traumatiske limbånd for å holde musen på plass.
- Barber magen med en elektrisk barbermaskin (avskallende krem kan brukes alternativt) og desinfiseres med alkoholpinner eller jod. Bruk kontakttid anbefalt av produsenten.
- Dekk det kirurgiske feltet med sterile gardiner.
MERK: Bruk av perioperative antibiotika er valgfritt og underlagt institusjonelle retningslinjer. - Bruk steril engangsbruk eller steriliserte instrumenter for alle kirurgiske prosedyrer.
- For utvikling av kolorektale tumorer, bruk et kryss av følgende betingede alleler for en grunnleggende modell av CRC (MGI databasenummer i parentes):
- Midline laparotomi og eksponering av tykktarmen
- Bruk saks (scalpels kan brukes alternativt) for å lage en midtlinje snitt(~ 15 mm) av huden på underlivet.
- Plukk opp muskulaturen i bukveggen med pincet og legg det forsiktig inn med saks, og dermed åpne bukhulen.
- Identifiser den distale kolon, bare berør den med atraumatiske tang. Klem kolon med en delikat klemme ( f.eks . En Micro Serrefine vaskulær klemme) ca. 15 mm nær anusen.
MERK: Vær spesielt oppmerksom på tykktarmenes sårbarhet hele tiden. Perforering fører uunngåelig til peritonitt og sepsis og krever eutanasi av dyret.
- Segmental kolon infeksjon med Adeno-cre virus
- Sett inn et fleksibelt Teflon-rør på transanalt og forsiktig forsiktig det til det når lumeneklusjonen som oppnås ved klemmen som tidligere er plassert ved 15 mm fra den analske randen. Ikke bruk overflødig kraft, da dette kan føre til perforering.
- Kanyler røret med en 30 G kanyle, koble en standard 1 ml sprøyte og spyl koloN med vanlig saltløsning for å evakuere gjenværende fecal matter. Dette kan kreve flere mL saltvann.
- Når den distale tykktarmen er tom fjerner du røret og erstatter det med et friskt Teflon-rør og plasserer det igjen direkte i klemmen som beskrevet ovenfor.
- Unngå tykktarmen med en andre klemme ~ 3 mm distal til den proksimale klemmen ( dvs. over det innførte røret, ~ 12 mm fra den analske randen), noe som resulterer i et 3 mm isolert segment som skal infiseres.
MERK: For distal okklusjon av segmentet har Fogarty kranspulsåpner vist seg å være mest egnet ettersom de er gummierte, noe som fører til tett okklusjon av tykktarmen til tross for det intraluminale røret mellom klemmenes grener. - Bruk en ny sprøyte (standard 1 ml med en 30 G kanyl) for å forsiktig injisere 50 - 80 μL 0,25% Trypsin-EDTA i klemmet kolon-segmentet og inkuber i 10 minutter. La kanylen og sprøyten festes til Teflon-røret for å forhindre at væsken lekker tilbake.
- Fjern først den distale klemmen, og deretter trypsinrøret.
- Skyll den distale tykktarmen med ~ 500 μl normal saltoppløsning for å fjerne resterende trypsin.
- Sett inn et nytt Teflon-rør, sett den distale klemmen på plass og oppblåse tykktarmen med 50 - 80 μl adenoviral oppløsning (10 11 plakkdannende enheter (PFU) / ml i fosfatbuffert saltvann) og inkuber i 30 minutter ( Figur 2A ).
MERK: Ikke spill viral løsning, da kontakt med adeno-cre kan føre til utvikling av svulster i noe vev av betinget mutante mus. - Fjern klemmene og røret.
- Lukking av magen og postoperativ utvinning
- Lukk bukveggen med 6-0 raskt absorberbar løpestrømTures ( f.eks . Polydioxanon (PDS)).
- Lukk huden med kirurgiske sårklemmer.
- Plasser musen på varmeputen satt til 38 ° C til den er fullstendig gjenopprettet fra bedøvelsen.
- Administrer en annen bolus på 0,05 mg / kg buprenorfin ip 12 timer etter operasjonen, etterfulgt av ytterligere buprenorfin-bolus hver 12. time, hvis nødvendig.
- Overvåk musene minst en gang daglig for tegn på nød som følge av tumorvekst.
2. Koloskopi
MERK: Adenoviral infeksjon fører til endoskopisk synlige svulster i løpet av 2 - 4 uker, avhengig av de anvendte betingede mutasjonene. Utfør derfor den første postoperative koloskopien 2 uker etter adenoviralinduksjonen og gjenta hver 2 uke. Et kommersielt tilgjengelig system anbefales for murinsk koloskopi. 20
- Forberedelse av dyr for koloskopi
MERK: Ingen fasting er required. Resterende fekal materiale er vanligvis godt formet i distal kolon og kan skyves utover svulsten under koloskopi, og gjør dermed den stressfulle prosessen med gjentatt fasting unødvendig.- Bruk sevofluran ved 3 - 3,5 vol% for generell anestesi. Et tap av tå-nippelrefleksen indikerer tilstrekkelig anestesi.
- Dekk øynene til de bedøvede musene med oftalmisk salve for å unngå uttørking av hornhinnen.
- Hold musene i en liggende stilling på et lite bord.
- koloskopi
- Sett inn omfanget (diameter 1,9 mm, lengde 10 cm) i tarmkanalen gjennom anusen og forsiktig insufflat luft under visuell kontroll for å fjerne tyktarmen. Ikke insufflere mer luft enn nødvendig for undersøkelsen.
MERK: For luftinnblåsning kan tåkluftspumpen i koloskopi systemet brukes. Hvis det ikke er noen anti-tåke luftpumpe, kan du bruke en annen luftpumpe med svært lave trykkinnstillinger, eller førSsurisert luft med en delikat trykkreduserende ventil. Kullsyre (CO 2 ) fører lett til acidose hos små gnagere og må derfor unngås. - Forsiktig skyv omfanget framover til en slimhinne lesjon i distal kolon kan identifiseres ( figur 1A - 1D ).
- Lagre endoskopiske bilder for senere evaluering. Et endoskopisk scoring system for intraluminale svulster har blitt beskrevet tidligere. 20
- Fjern forsiktig rekkevidden og legg musen på varmeputen satt til 38 ° C til den er fullstendig gjenopprettet fra bedøvelsen.
- Sett inn omfanget (diameter 1,9 mm, lengde 10 cm) i tarmkanalen gjennom anusen og forsiktig insufflat luft under visuell kontroll for å fjerne tyktarmen. Ikke insufflere mer luft enn nødvendig for undersøkelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis det utføres tilstrekkelig, utvikler> 85% av dyrene svulster. Dødeligheten av den her presenterte kirurgiske prosedyren er <5%, dødeligheten av koloskopien er praktisk talt ikke-eksisterende. I de fleste mus, oppdages en enkelt lesjon; I ca 30% kan 2 - 3 små adenomer detekteres som vanligvis smelter til en enkelt tumor innen 2 - 3 uker etter tumorinduksjon.
Fenotypen og biologisk oppførsel av de resulterende svulstene er høyt avhengig av dyrs betingede mutasjoner. Den lokale cre-medierte knockout av Apc er tilstrekkelig til å indusere tumorigenese og fører i utgangspunktet til adenom, som kan påvises 2-4 uker etter adenoviral infeksjon, og som utvikler seg til invasiv adenokarsinom innen 12-16 uker. Denne prosessen kan akselereres ved å legge til en betinget onkogen Kras mutasjon (Kras G12D), de resulterende svulstene utvikler seg raskt til invasiveadenokarsinom. Ved tilsetning av onkogen Tp53 R172H utvikler svulstene raskt til invasiv og metastatisk karsinom. Overlevelse avhenger sterkt av tumorens genotype; Median overlevelse er vanligvis ca 80-200 dager etter tumorinduksjon. Dødsårsaken i det store flertallet av tilfellene er stor tarmobstruksjon sekundær til tumorvekst.
Tumorene kan enkelt og gjentatte ganger overvåkes via koloskopi ( Figur 1 ) uten store belastninger for dyrene.
Sykdoms manifestasjoner er svært lik human CRC. Dyrene utvikler adenomer og til slutt adenokarcinomer i den distale kolon ( figur 2B, 2C, 2F ). Avhengig av musens betingede genotype, metastaserer tumorene også til peritoneum ( Figur 2D ) leverene ( Figur 2E ) og sjeldne Lungene (ikke vist). Hvis en cre reporter allel (for eksempel ZSGreen 19 ) brukes, kan alle tumor manifestasjoner enkelt identifiseres. ZSGreen reporterallelen har et fluorescerende proteinuttrykk som er sterkt nok til å være synlig ved dagslys ( figur 1B , figur 2C ).
Histologisk er 95% av de utviklende svulstene adenokarcinomer. Omtrent 5% av svulstene har mesenkymal opprinnelse, for eksempel fibrosarkom eller leiomyosarkom, som antas å utvikle seg fra stromalceller som ved et uhell er infisert med adeno-cre. Histomorfologien til adenokarcinomene ligner i stor grad menneskelig CRC, og inneholder hele spektret fra ikke-invasiv adenom til adenokarcinom-invaderende omgivende strukturer ( figur 3A-3C ).
Filer / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
Figur 1. Koloskopiske bilder av kolorektale tumorer (betingede alleler av det gitte dyret i parenteser).
A. Normal distal kolon. B. Tidlig adenom 2 uker etter adeno-cre infeksjon. Merk den grønne fargen på grunn av en GFP reporter allel i denne musen. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Sent adenom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Colorektal adenokarcinom (som diagnostisert ved patologi etter at kolonoskopibildene ble oppnådd; Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2.jpg "/>
Figur 2. A. Intraoperativ Situs . Legg merke til det store, gummierte Fogarty-klippet i bunnen og det transanalt innførte røret for adeno-cre-injeksjon (rød pil). B. Colorectal tumor (hvit pil) med påfølgende tarmobstruksjon 8 uker etter adeno-cre infeksjon (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Colorectal tumor (hvit pil) 10 uker etter adeno-cre infeksjon (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Merk grønn farge på grunn av grønt fluorescerende protein (GFP) reporter allel i denne musen. D. Peritoneal karsinose (svarte piler) i GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Lever og tarm har blitt fjernet for å utsette nyrene og membranen. E. Brutto levermetastaser i GEMM 12 uker etter adeno-cre iFection (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colon med tumor etter fjerning fra dyret avbildet i figur 2C . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Hematoksylin / Eosin (H / E) fargede seksjoner av kolorektale tumorer fra GEMM.
A. Overgangssone fra normal slimhinne til adenokarsinom med infiltrering av slimhinne, submukosa og muskularis slimhinne (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Overgangssone fra normal kolon slimhinne til invasivt adenokarsinom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Høykvalitets adenokarsinom med infiltrering av omgivende vev (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens de generelt er enkle å generere og vedlikeholde, er klassiske CRC-musemodeller basert på injeksjon av cellelinjer kunstige og kan ikke fullt ut rekapulere den menneskelige sykdommen. Som en konsekvens er GEMMer blitt utviklet. Den første CRC GEMM var Apc Min- musen, som har en heterozygot null mutasjon i Apc-genet, og etterligner derfor den menneskelige arvelige sykdommen familial adenomatous polyposis (FAP). 21 Apc Min- mus utvikler imidlertid alltid flere intestinale adenomer som ikke er begrenset til tykktarmen; Også tid og eksakt plassering av adenomdannelse er tilfeldig, og svulstene utvikler sjelden til maligne lesjoner som musen dør av godartet tumorbelastning før adenomene kan utvikles. Derfor er Apc Min- musen en modell for FAP, ikke sporadisk CRC. Andre modeller presenterer mutasjoner i DNA-mismatch reparasjonsgener. 22 , 23 Selv om noen av disseMus er gode modeller for arvelig gastrointestinal kreft, de representerer ikke sporadisk kolorektal kreft.
Bortsett fra den underliggende genetiske endringen er det plasseringen av den genetiske lesjon som skiller ut modeller av sporadisk og syndromal kolorektal kreft. Alle de ovennevnte modellene har mutasjoner som er konstitutivt aktive eller indusert gjennom hele tykktarmen eller til og med hele tarmkanalen. Dette resulterer i dannelsen av flere adenomer, som ikke er representativ for human sporadisk CRC, er vanskelig å vurdere ved koloskopi, og gir vanligvis ikke svulstene nok tid til å utvikle seg før dyret gir etter den omfattende tumorbelastningen. Derfor må en musemodell for sporadisk kolorektal kreft inneholde lokal aktivering av kolorektal tumorigenese.
Tumorene som oppstår i den her presenterte GEMM er strengt begrenset til kirurgisk klemmet og adeno-cre-infisert segmentAv tykktarmen. Dette resulterer i dannelsen av en enkelt tumor som er lett tilgjengelig for deteksjon og overvåkning ved koloskopi. I tillegg gjør den distale beliggenheten tarmobstruksjon en sen komplikasjon av tumorvekst, slik at tumorene kan utvikle seg til invasiv og, avhengig av genotype, metastatisk karsinom før dyret krever eutanasi. En annen fordel med segmentinfeksjon er det upåvirket miljøet. Mens i Apc Min og andre arvelige musemodeller lider den omkringliggende slimhinnen og til og med stromalcellene de samme genetiske avvikene som svulstene, utvikler svulstene i den her foreslåtte modellen innenfor normalt kolonepitel og stroma. Dette muliggjør mer realistisk tumor-vert-interaksjon og molekylære studier uten restriksjoner. Videre er tidspunktet for tumorinduksjon veldefinert i denne modellen. Mens i Apc Min- musen utvikler svulster etter "andre treff", der den andre Apc-allelen er stochastIcally tapt på et tilfeldig tidspunkt, aktiveres alle ønskede mutasjoner samtidig i den her beskrevne modellen, slik at studier av svært tidlige lesjoner eller påfølgende biopsier på en meget definert måte.
Denne modellen kommer imidlertid også med begrensninger. Kryssing av flere alleler i en modell krever enorm tid og ressurser; I tillegg kan ofte ikke alle avkom brukes til forsøkene på grunn av en uegnet genotype. Prosedyren selv krever trening og er tidkrevende. Produksjonen av adeno-cre virus suspensjon med tilstrekkelig høye titere og i store mengder er kostnadskrevende. Derfor er denne modellen ikke egnet til å erstatte alle andre CRC-musemodeller, og vil være begrenset til laboratorier med tydelig fokus på GEM-modeller.
Protokollen i seg selv er teknisk krevende, men med litt trening kan ikke-kirurgisk personell utføre prosedyrene på en tilstrekkelig måte. Det kritiske trinnet under adeno-cre iNfection er oppblåsingen av det klemme tarmsegmentet - overflødig intraluminaltrykk fører til perforering, utilstrekkelig trykk reduserer hastigheten på vellykket infeksjon. Dette trinnet krever trening.
En protokoll for adenoviral infeksjon i distal kolon har blitt publisert av Hung et al. før. 13 Den her presenterte protokollen adskiller seg fra den nevnte protokollen i flere viktige aspekter. Da det ofte fører til tarmperforering i uerfarne hender, hoppes mekanisk slitasje av slimhinnen før adeno-cre-inkubasjon i foreliggende protokoll. Dette resulterer i en redusert hastighet av tumordannelse, som imidlertid kan motvirkes av økte viraltitere. På denne måten kan frekvensen av mesenkymale svulster også reduseres som uten mukosal slitasje mindre mesenkymale celler i tarmveggen blir utsatt for adeno-cre.
I motsetning til ovennevnte protokoll 13 er det også herBeskrevet protokoll anbefaler ikke natten over fasting før kirurgi eller koloskopi. I stedet er tarmutslipp eller, i tilfelle av koloskopi, enkel mekanisk manipulering brukt til å fjerne resterende fekalt materiale. Denne forbedringen av protokollen forbedrer dyrevelferdene dramatisk. Overnight fasting er en svært stressende prosedyre for små gnagere og er kjent for sterkt å påvirke den murine metabolismen, og påvirker derfor eksperimentelle resultater. 24 , 25 Disse uønskede effektene av natten fasting kan unngås i det her presenterte manuskriptet.
En annen viktig forskjell mellom den her presenterte protokollen og protokollen av Hung et al. Er lengden av klemmet (og dermed infisert) segmentet. Mens den her beskrevne protokollen anbefaler en kort lengde (~ 3 mm), er Hung et al. Anbefaler 20 mm av den distale kolon som skal smittes. Den kortere segmentlengden er valgt for å redusere nummeretAv rekombinerte krypter og dermed resulterende svulster. Som de fleste pasienter med sporadisk CRC utvikler en enkelt tumor i stedet for flere svulster, øker denne tiltak den kliniske relevansen av modellen. Graden av tumordannelse synes ikke å være påvirket av den reduserte overflaten av infisert tykktarm.
Fremtidige bruksområder av denne teknikken inkluderer alle protokoller som krever lokal re-rekombinasjon i kolon slimhinnen. De fleste bruksområder i kreftforskning vil inkludere betingede onkogener, som fører til dannelse av kolorektale tumorer; Imidlertid kan alle andre anvendelser som induserende reporterkonstruksjoner i tykktarmslimhinnen oppnås med den her presenterte protokollen også.
Til sammen konkluderer den her presenterte kombinasjonen av en svært sofistikert genetisk utviklet musemodell av kolorektal kreft sammen med muligheten for kolonoskopi med høy oppløsning for deteksjon og overvåkning av utviklingsvulstene å giEr en utmerket ramme for å studere biologi og behandling av CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er dedikert til minnet av professor Moritz Koch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F. Fasting of mice: a review. Lab Anim. 47 (4), 225-240 (2013).
