Summary
Segmental adeno-cre enfeksiyonu ile genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli kurulması ve yüksek çözünürlüklü kolonoskopi ile gözlemlenmesi için bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Kolay uygulanabilirlik ve maliyet etkinliğinin avantajlarına rağmen, tümör hücresi enjeksiyonuna dayanan kolorektal kanserli fare modelleri ciddi sınırlamalara sahiptir ve tümör biyolojisi ve tümör hücresi yayılımını doğru şekilde simüle etmez. Genetik olarak tasarlanmış fare modelleri bu sınırlamaların üstesinden gelmek için sunulmuştur; Bununla birlikte, bu tür modeller, özellikle tek bir tümörün arzulanan kolon gibi büyük organlarda teknik olarak talep edilmektedir.
Sonuç olarak, oldukça uyumlu tümörler geliştiren ve tümör biyolojisi çalışmaları ve terapötik denemeler için kullanılabilen, bağışıklık kazandırıcı, genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli geliştirildi. Tümör gelişimi, bileşik koşullu mutant farelerde distal kolonun adeno-cre virüsü ile cerrahi, segmental enfeksiyonu ile başlatılır. Kolonoskopi ile tümörler kolayca tespit edilebilir ve izlenebilir. Burada segmental adeno-cre enfeksiyonunun cerrahi tekniğini tanımlıyoruzKolon, yüksek çözünürlüklü kolonoskopi ile tümörün gözetimi ve oluşan kolorektal tümörler.
Introduction
Kolorektal kanser (ÇHS), batı ülkelerinde kansere bağlı ölümlerin başlıca nedenlerinden biri olmayı sürdürüyor. Erken evre hastalığı olan hastaların prognozu iyi olmakla birlikte, birçok tedavi seçeneği olmasına rağmen prognozu sınırlı olan sonraki aşamalarda birçok tümör tanısı konur. 2 , 3 , 4 , 5
Mevcut CRC fare modellerinin çoğunluğu, hücre hatlarından veya hasta tümörlerinden türetilen tümör hücrelerinin immün yetersiz farelere implante edilmesine dayanır. 6 , 7 , 8 Bu, lokal yol açar ve enjeksiyon yerine ve enjeksiyon için kullanılan tümör hücrelerine bağlı olarak, bazen metastatik tümörler oluşturur. Ancak, ortaya çıkan xenograft modelleri majo'yduSınırlamaları. Bağışıklık eksikliği olan farelerde kurulmalılar, böylece tümör ve bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşim ortadan kaldırılmalıdır. Buna ek olarak, tümör stroması konukçu hücrelerden türetildiğinde, insan tümörü parankimi ile mürin stroması arasındaki etkileşim kusurludur ve bu nedenle hastalığı temsil etmez. Bu eksiklikler, enjeksiyon için fare hücre dizilerinin kullanımı ile engellenebilir. Bununla birlikte, sadece birkaç fare CRC hücre çizgisi mevcuttur ve en çok bulunan insan CRC hücre çizgilerine benzer şekilde, monoklonal ve oldukça anaplastiktir. Özetle, halihazırda mevcut CRC fare modellerinin çoğu yapaytır ve insan hastalığını tam olarak temsil etmez.
CRC'nin genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler), bu iki dezavantajdan kaçınılabildikleri için kolondaki CRC'nin anahtar mutasyonlarının indüksiyonu yoluyla oluşturulan gerçek fare tümörleri özelliği taşırlar. 12 , 13 ,14 Bu, kolorektal mukozadaki kreatin recombinaz tarafından koşullu (ökelenmiş) tohum çizgisi mutasyonlarının aktivasyonu ile başarılabilir. Diğer pek çok tümör varlıklarının GEMM'lerinde dokuya özgü hızlandırıcılar tarafından yönlendirilen germline (indüklenebilir) cre ifadesi kullanılırken, germline cre, kolondaki çok sayıda adenomaya yol açtığı için benign tümör yükü tarafından ölüm neden olur Çok genç yaş. Bu nedenle, burada tarif edilen modelde, cre'yi ifade eden bir adenoviral vektör kısa bir kolon segmentini enfekte etmek için kullanılır. Bu, araştırmacı tarafından tanımlanan bir zaman noktasında, mukozanın bu segmenti içindeki tümörojenezin uyarılmasına yol açarak sonuçta invaziv ve metastatik karsinomaya ilerleyen adenomlarla sonuçlanır. Tümörler orijinal fare tümörleri olup bozulmamış bir mikro ortamda büyür ve bu nedenle tümör-konakçı etkileşimi ve metastatik kaskad da dahil olmak üzere kolorektal onkogenezin tamamını taklit edebilmektedir. Bu modelBu nedenle kanser biyolojisi ve klinik öncesi terapötik denemeler için çekici bir platform.
CRC'nin genetik olarak tasarlanmış fare modellerinin büyük bir dezavantajı teknik karmaşıklığıdır. Floxed Apc alelleri taşıyan farelerde rektal adeno-cre enema kullanan lokal cre doğum daha önce tanımlanmıştır; Bununla birlikte, bağırsak tümörlerinin insidansı, çokluğu ve lokalitesi, bu teknikle oldukça değişken olabilir. 15 Bu nedenle, adeno-cre enfeksiyonunun indüklenecek segmentin ameliyat klemplemesi ile sınırlandırılması tekniği geliştirilmiştir. 13 Bu prosedürü, hayvan refahını arttırmak için, ayrıca mortaliteyi ve ortaya çıkan tümör sayısını azaltmak için değiştirdik. Bu protokol ile, küçük kemirgen cerrahide deneyime sahip tüm laboratuarlar, modeli çoğaltmalı ve kolonoskopi için kolaylıkla erişilebilen ve oldukça tekrarlanabilir olan tümörler üretmelidir. Koşullu m'ye bağlı olarakTümörigenez için kullanılan utasyonlar, adenomun tam spektrumu, invaziv karsinom ve metastazlar gözlenebilir. Tümörler distal kolondaki konumundan dolayı bu modelde seri endoskopik değerlendirme kolayca mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada sunulan hayvan deneyleri, kurumsal ve resmi bir Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından bağımsız olarak gözden geçirildi ve onaylandı ve FELASA (Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu) kurallarına göre gerçekleştirildi. Anestezi ve analjezi ya da gerekirse erken ötanazi gibi acıyı en aza indirmek için olası tüm önlemler alındı.
1. Cerrahi Adeno-cre Enfeksiyonu ile Lokal Tümör İndüksiyonu
- Ameliyat için hayvanların hazırlanması
NOT: Hemen hemen her şarta bağlı ("floxed") mutasyon burada açıklanan yöntem vasıtasıyla indüklenebilir. Apc, Kras veya Tp53 gibi kolorektal kanserle ilgili genlerde mutasyonların kullanılması önerilir. Cre rekombinasyonunun etkinliği, eksize edilecek yapı büyüklüğüne bağlıdır. Büyük floxed sekanslar daha az verimli eksize edilir. Tüm allellerin rekombinasyonu tümörlerde PC ile teyit edilmelidirR.- Kolorektal tümörlerin gelişimi için, CRC'nin temel bir modeli (parantez içinde MGI veritabanı numarası) için aşağıdaki koşullu alellerin çaprazını kullanın:
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 242.9948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Bir floresan muhabir alleli gerekliyse ( örn. Mikrometastazları saptamak için), aşağıdaki alleli kullanın:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
NOT: Yukarıdaki tüm suşlara NCI Mouse Repository veya Jackson Laboratuarı aracılığıyla erişilebilir. Geri kalan tüm dışkı maddeleri, adenovirüs enfeksiyonundan önce yıkanabildiğinden, oruç tutmaya gerek yoktur. Preoperatif açlık, perioperatif mortaliteye yol açar ve küçük kemirgenler için muazzam stres oluşturur. - Genel anestezi için sevofluran'ı% 3 - 3.5 hacimde kullanın. T kaybıO ayak parmağı refleksi yeterli anestezi gösterir.
- İlk insizyon öncesinde subkutan olarak 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin.
- Anestezi uygulanmış farenin gözlerini oftalmik merhem ile örtün, kornea kurutulmasını önleyin.
- Fareyi küçük bir masanın üzerine yatar pozisyonda tutun. Fareyi tutmak için travmatik olmayan yapışkan bantlar kullanın.
- Karnınızı elektrikli bir tıraş makinesiyle tıraş edin (alternatif olarak kaşeleştirici krem kullanılabilir) ve alkollü çubuk veya iyot ile dezenfekte edin. Üretici tarafından önerilen temas süresini kullanın.
- Cerrahi alanı steril perdeler ile örtün.
NOT: Perioperatif antibiyotik kullanımı isteğe bağlıdır ve kurumsal yönergelere tabidir. - Tüm cerrahi prosedürler için steril tek kullanımlık veya sterilize edilmiş aletler kullanın.
- Kolorektal tümörlerin gelişimi için, CRC'nin temel bir modeli (parantez içinde MGI veritabanı numarası) için aşağıdaki koşullu alellerin çaprazını kullanın:
- Orta hat laparotomisi ve kolonun maruziyeti
- Orta hat kesi yapmak için makas kullanın (alternatif olarak kaşaklar da kullanılabilir)(~ 15 mm) alt karın üzerindeki cilt.
- Forseps ile karın duvar kaslarını alın ve dikkatli bir şekilde makasla incise edin, böylece karın boşluğunu açar.
- Distal kolonu tanımlayın, sadece atravmatik forseps ile dokundurun. Kolonu, anüsün yaklaşık olarak 15 mm kadar ince bir kelepçesi ( örn. , Bir Micro Serrefine vasküler kelepçe) ile sıkıştırın.
NOT: Her zaman kolonun hassasiyetine özel dikkat gösterin. Perforasyon kaçınılmaz olarak peritonit ve sepsise yol açar ve hayvanın ötanazisi gerektirir.
- Adeno-cre virüsü ile Segmental kolon enfeksiyonu
- Esnek bir Teflon tüpünü transanal olarak yerleştirin ve daha önce anal vertikalden 15 mm'ye yerleştirilen kelepçe ile elde edilen lümen oklüzyonuna erişene kadar dikkatli bir şekilde ilerletin. Fazla güç kullanmayın, zira delik açılabilir.
- Tüpü bir 30G kanül ile kanüle edin, standart bir 1 mL şırınga takın ve kolonu boşaltınN, kalan fekal maddeyi boşaltmak için normal tuzlu su ile yıkayın. Bu birkaç mL serum fizyolojik gerektirir.
- Distal kolon boşaldığında tüpü çıkarın ve onu yeni bir Teflon tüpü ile değiştirin ve yine yukarıda tarif edildiği gibi kelepçeye doğrudan uzak tutun.
- Kolon, proksimal kelepçeye ~ 3 mm uzakta ( yani , yerleştirilen tüpün üzerinde, anal vertikal ~ 12 mm) ikinci bir kelepçe ile kapatın, böylece enfekte edilecek 3 mm izole bir segment elde edilir.
NOT: Fogarty koroner arter klipslerinin kauçuklaştırılmış olması nedeniyle klemp darlığı arasındaki intraluminal boruya rağmen kolonun sıkıca oklüzyona uğramasına yol açarak segmentin distal oklüzyonu için en uygun oldukları kanıtlanmıştır. - Sıkıca kelepçeli kolon segmentine 0.25% Trypsin-EDTA 50 - 80 mcL enjekte etmek için ikinci bir şırınga (30G kanül ile standart 1 mL) kullanın ve 10 dakika inkübe edin. Sıvının geri sızmasını önlemek için kanülü ve şırıngayı Teflon tüpüne yapışkan bırakın.
- Önce distal kelepçeyi ve sonra tripsin tüpünü çıkarın.
- Kalan tripsin uzaklaştırmak için distal kolonu ~ 500 μL normal salinle yıkayın.
- Yeni bir Teflon tüpü takın, distal kelepçeyi yerine geri koyun ve kolon segmentini 50 - 80 μL adenoviral solüsyon (fosfat tamponlu salin içinde 10 11 plak oluşturucu ünite (PFU) / mL) ile şişirin ve 30 dakika inkübe edin Şekil 2A ).
NOT: Adenoc ile temas, koşullu mutant farelerin tüm dokularında tümör gelişimine neden olabileceğinden, viral çözeltiyi dökmeyin. - Kelepçeleri ve boruyu çıkartın.
- Karın kapanması ve postoperatif iyileşme
- Karın duvarını 6-0 hızlı emilebilen su ile kapatın(Poldioksanon (PDS) gibi).
- Cerrahi yara klipsleri ile cildi kapatın.
- Fareyi, anesteziden tamamen kuruyana kadar 38 ° C'ye ayarlanmış ısıtma yastığı üzerine yerleştirin.
- Ameliyattan 12 saat sonra başka bir 0.05 mg / kg buprenorfin bolusunu uygulayın, bunu takiben gerekirse 12 saatte bir ilave buprenorfin bolusları uygulayın.
- Fareler, tümör gelişimine bağlı olarak sıkıntı işaretleri için günde en az bir kere izleyin.
2. Kolonoskopi
NOT: Kullanılan koşullu mutasyonlara bağlı olarak, adenoviral enfeksiyon, 2-4 hafta içinde endoskopik olarak görülebilir tümörlere neden olur. Bu nedenle, adenoviral indüksiyondan 2 hafta sonra ilk postoperatif kolonoskopi uygulayın ve her 2 haftada bir tekrarlayın. Sıçan kolonoskopisi için piyasada bulunan bir sistem önerilir. 20
- Kolonoskopi için hayvanların hazırlanması
NOT: Açlık yok required. Kalan fekal madde genellikle distal kolondan iyi oluşur ve kolonoskopi sırasında tümörün ötesine itilebilir, böylece tekrarlanan orucun stresli işlemi gereksiz hale getirilir.- Genel anestezi için sevofluran'ı% 3 - 3.5 hacimde kullanın. Parmak çakma refleksi kaybı, yeterli anestezi anlamına gelir.
- Korneanın kurutulmasını önlemek için anestezi uygulanmış farelerin gözlerini oftalmik merhem ile örtün.
- Fareleri küçük bir masanın üzerinde yatay bir konumda tutun.
- kolonoskopi
- Kapağı (çap 1.9 mm, uzunluk 10 cm) anüs yoluyla bağırsak yoluna sokun ve kolonu genişletmek için görsel kontrol altında havayı dikkatle yerleştirin. Muayene için gereken miktardan fazla havayı koymayın.
NOT: Hava insuflasyonu için, kolonoskopi sisteminin sis önleyici hava pompası kullanılabilir. Hiçbir sis önleyici hava pompası yoksa, çok düşük basınç ayarları olan diğer herhangi bir hava pompası kullanılabilir veya önZarif bir basınç düşürücü valf ile püskürtülmüş hava. Karbondioksit (CO 2 ) küçük kemirgenlerde asidoza kolayca yol açar ve bu nedenle kaçınılmalıdır. - Distal kolondaki bir mukozal lezyon tanımlanıncaya kadar alanı dikkatle ileri itin ( Şekil 1A - 1D ).
- Daha sonraki değerlendirme için endoskopik görüntüleri saklayın. Daha önce intralüminal tümörler için bir endoskopik skorlama sistemi tanımlanmıştır. 20
- Kapsamı dikkatlice çıkarın ve fareyi, anesteziden tamamen kuruyana kadar 38 ° C'ye ayarlanmış ısıtma yastığı üzerine yerleştirin.
- Kapağı (çap 1.9 mm, uzunluk 10 cm) anüs yoluyla bağırsak yoluna sokun ve kolonu genişletmek için görsel kontrol altında havayı dikkatle yerleştirin. Muayene için gereken miktardan fazla havayı koymayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yeterli şekilde uygulandığında, hayvanlar> n% 85'inde tümörler gelişir. Burada sunulan cerrahi prosedürün mortalitesi <% 5, kolonoskopinin mortalitesi neredeyse mevcut değildir. Farelerin çoğunda tek bir lezyon tespit edilmiştir; Yaklaşık% 30 2-3 küçük adenom tespit edilebilir, bunlar genellikle tümör indüksiyonundan 2-3 hafta sonra tek bir tümöre bağlanır.
Ortaya çıkan tümörlerin fenotipi ve biyolojik davranışı, hayvanların koşullu mutasyonlarına oldukça bağımlıdır. Apc'nin yerel aracıyla nakavt edilmesi, tümörigenezi indüklemek için yeterlidir ve başlangıçta, adenovir enfeksiyonundan 2-4 hafta sonra tespit edilebilen ve 12-16 hafta içinde invaziv adenokarsinoma ilerleyen adenoma neden olur. Bu süreç, koşullu bir onkojenik Kras mutasyonu (Kras G12D) eklenerek hızlandırılabilir; bu da ortaya çıkan tümörler hızla invaziv hale geliradenokarsinom. Tümörler, onkojenik Tp53 R172H ilavesiyle invaziv ve metastatik karsinoma hızla ilerlenir. Hayatta kalma, tümörlerin genotipine bağlıdır; Medyan sağkalım genellikle tümör endüksiyonundan yaklaşık 80 - 200 gün sonra olur. Olguların çoğunda ölüm sebebi, tümör büyümesine sekonder kalın bağırsak tıkanıklığıdır.
Tümörler, hayvanlar için büyük stres olmaksızın kolonoskopi ( Şekil 1 ) ile kolayca ve tekrar tekrar izlenebilir.
Hastalık bulguları insan CRC'sine çok benzer. Hayvanlar, adenomları ve eninde sonunda distal kolondaki adenokarsinomları geliştirir ( Şekil 2B, 2C, 2F ). Farelerin koşullu genotipine bağlı olarak, tümörler ayrıca karaciğere ( Şekil 2E ) ve peritona ( Şekil 2D ) metastaz yapar ( Şekil 2E ) ve nadir Akciğerler (gösterilmiyor). Bir cre muhabir alleli ( örn. , ZSGreen 19 ) kullanılıyorsa, tüm tümör bulguları kolayca tespit edilebilir. ZSGreen raportör alleli, gün ışığında görülebilecek kadar parlak bir flüoresan proteini ifadesine sahiptir ( Şekil 1B , Şekil 2C ).
Histolojik olarak gelişen tümörlerin% 95'i adenokarsinomlardır. Tümörlerin yaklaşık% 5'inde mezenkimal kökenli, örneğin fibrozaroma veya leiomyosarkom, muhtemelen adeno-cre ile yanlışlıkla enfekte olmuş stromal hücrelerden gelişir. Adenokarsinomların histomorfolojisi insan invaziv olmayan adenomdan çevresindeki yapıları istila eden adenokarsinoma kadar uzanan tüm spektruma benzemektedir ( Şekil 3A - 3C ).
Files / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
Şekil 1. Kolorektal Tümörlerin Kolonoskopik Görüntüleri (Parantez içinde Verilen Hayvan Koşullu Alleller).
A. Normal distal kolon. B. Adenok enfeksiyonundan 2 hafta sonra erken adenom. Bu fare içinde bir GFP raportör alleli nedeniyle yeşil renkli not alın. (APC tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Geç adenoma (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Koloroskopi görüntülerinden sonra patoloji olarak teşhis edilen kolorektal adenokarsinoma; Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
2.jpg "/>
Şekil 2. A. İntraoperatif Situs . Alt kısımda büyük, kauçuklaştırılmış Fogarty klibi ve adeno-cre enjeksiyonu için transanal olarak yerleştirilen tüp (kırmızı ok) göz önüne alın. Adeno-cre enfeksiyonundan 8 hafta sonra ardışık geniş bağırsak tıkanıklığına sahip kolorektal tümör (beyaz ok) (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Adenok enfeksiyonundan 10 hafta sonra kolorektal tümör (beyaz ok) (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Bu farede yeşil flüoresan proteini (GFP) muhabiri alleli nedeniyle yeşilimsi renge dikkat edin. D. GEMM'de (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ) periton kanseri (siyah oklar). Böbrekleri ve diyaframı ortaya çıkarmak için karaciğer ve bağırsak çıkarıldı. E. GEMM'de adeno-cre'den 12 hafta sonra görülen brüt karaciğer metastazlarıFeksiyon (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). Şekil 2C'de tasvir edilen hayvandan çıkarıldıktan sonra tümörlü F. Kolon. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. GEMM'den Kolorektal Tümörlerin Hematoksilin / Eozin (H / E) Boyalı Bölümleri.
A. Normal mukozadan adenokarsinoma, mukoza, submukoza ve muskularis mukozasının infiltrasyonu ile geçiş bölgesi (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Normal kolon mukozasından invaziv adenokarsinomaya geçiş bölgesi (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Çevreleyen doku infiltrasyonu ile yüksek dereceli adenokarsinoma (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genellikle üretilmesi ve bakımı kolay olsa da, hücre çizgisi enjeksiyonuna dayanan klasik CRC fare modelleri yapaytır ve insan hastalığını tam olarak tekrar edememektedir. Sonuç olarak GEMM'ler geliştirildi. İlk CRC GEMM, Apc geninde heterozigot boş bir mutasyona sahip Apc Min fare idi, bu nedenle insan kalıtsal hastalık ailevi adenomatöz polipozis (FAP) taklit eder. Bununla birlikte, Apc Min fare- lerinde her zaman kolond ile sınırlı olmayan çok sayıda bağırsak adenomu gelişir; Ayrıca, adenom oluşumunun zamanı ve kesin konumu rasgeledır ve adenomlar ilerlemeden önce fare iyi huylu tümör yükünden ölür olduğundan, tümörler nadiren malign lezyonlara dönüşür. Bu nedenle, Apc Min fare sporadik CRC değil FAP modelidir. Diğer modeller, DNA uyuşmazlığı onarım genlerinde mutasyonlar ortaya koymaktadır. 22 , 23 Bunların bazılarıFareler, kalıtsal gastrointestinal kanser için mükemmel modellerdir, sporadik kolorektal kanseri temsil etmezler.
Altta yatan genetik değişikliğin yanı sıra, sporadik ve sendroma bağlı kolorektal kanser modellerini belirleyen genetik lezyonun yeri de budur. Yukarıda belirtilen modellerin hepsi, kolondan veya hatta tüm gastrointestinal sistemi oluşturan aktif veya uyarılan mutasyonlar içerir. Bu, insan sporadik CRC'sini temsil etmeyen, kolonoskopi ile değerlendirilemeyecek çoklu adenomların oluşumuyla sonuçlanır ve ek olarak genellikle hayvanın geniş kapsamlı tümör yüküne yenik düşmeden gelişmesi için yeterli zaman bırakmaz. Bu nedenle, sporadik kolorektal kanser için bir fare modeli, kolorektal tümörojenezin lokal aktivasyonunu içermelidir.
Burada sunulan GEMM'de ortaya çıkan tümörler, cerrahi olarak kelepçelenmiş ve adeno-cre ile enfekte olmuş segmentle sınırlıdırIki nokta üstüste. Bu, kolonoskopi ile tespit ve gözlemlemeye kolayca erişilebilen tek bir tümörün oluşumuyla sonuçlanır. Buna ek olarak, distal konum, bağırsak tıkanıklığını tümör büyümesinin geç bir komplikasyonunu oluşturarak tümörlerin invaziv hale gelmesine ve genin tipine bağlı olarak metastatik karsinomanın ötanazi öncesi evlat edinmesini sağlar. Segmental cre enfeksiyonunun diğer bir avantajı etkilenmeyen ortamdır. Apc Min ve diğer kalıtsal fare modellerinde çevreleyen mukoza ve hatta stromal hücreler, tümörlerin genetik sapmalarına sahiptir; burada önerilen modeldeki tümörler normal kolonik epitel ve stromada gelişir. Bu, kısıtlamalar olmaksızın daha gerçekçi tümör-host etkileşimi ve moleküler çalışmaları sağlar. Dahası, bu modelde tümör indüksiyonunun zaman noktası iyi tanımlanmıştır. Apc Min fare iken, tümör, ikinci Apc alelinin "ikinci vuruş" sonrasında ortaya çıktığı sıradaRasgele bir zaman noktasında kaybedildiğinde, arzu edilen mutasyonlar burada tarif edilen modelde eşzamanlı olarak etkinleştirilir, böylece çok erken tanımlanmış lezyonların veya ardışık biyopsilerin araştırılmasına izin verilir.
Bununla birlikte, bu model de kısıtlamalarla birlikte gelir. Birden fazla alelin bir modele geçilmesi muazzam zaman ve kaynak gerektirir; Buna ek olarak, uygun olmayan bir genotip nedeniyle deneyler için çoğu zaman tüm yavrular kullanılamaz. İşlemin kendisi uygulama gerektirir ve zaman alıcıdır. Yeterince yüksek titerli ve büyük miktarlarda adeno-cre virüs süspansiyonunun üretimi maliyet açısından çoktur. Bu nedenle, bu model tüm diğer CRC fare modellerini değiştirmek için uygun değildir ve GEM modelleri üzerinde odaklanan laboratuvarlarla sınırlı olacaktır.
Protokolün kendisi teknik olarak talepkar, ancak bazı eğitimlerle cerrahi dışı personel prosedürleri yeterince uygulayabilir. Adeno-cre i sırasında kritik adımNfection, bağlanmış bağırsak segmentinin enflasyonudur - fazla intraluminal basınç delinmeye, yetersiz basınç başarılı enfeksiyon oranını azaltır. Bu adım eğitim gerektiriyor.
Distal kolonun adenoviral enfeksiyonu için bir protokol Hung ve ark. Tarafından yayınlanmıştır. önce. 13 Burada sunulan protokol, birkaç önemli açıdan yukarıda belirtilen protokolden farklıdır. Deneyimsiz ellerde sıklıkla bağırsak delinmesine neden olduğu için, adeno-cre inkübasyondan önce mukozanın mekanik aşınması bu protokolde atlanır. Bu, tümör oluşumunda azalma ile sonuçlanır, ancak artmış viral titrelerle karşılanabilir. Bu şekilde, mezenkimal tümörlerin oranı, mukozal aşınma olmaksızın, bağırsak duvarındaki mezenkimal hücrelerin adeno-cre'ye maruz kalması nedeniyle azaltılabilir.
Ayrıca, yukarıda belirtilen protokolün aksine 13 buradaTarif edilen protokol ameliyattan önce veya kolonoskopide gece oruç tutumunu önermemektedir. Bunun yerine, bağırsağın yıkanması ya da kolonoskopi durumunda, kalan fekal maddelerin çıkarılması için basit mekanik manipülasyon kullanılır. Protokolün bu şekilde arıtılması, hayvan refahını önemli ölçüde artırmaktadır. Gecelik oruç tutma, küçük kemirgenler için oldukça stresli bir işlemdir ve fare metabolizmasını kuvvetlice etkiler ve bu nedenle deneysel sonuçları da etkiler. 24 , 25 Gece oruç tutmanın bu istenmeyen etkileri burada sunulan el yazmasında önlenebilir.
Burada sunulan protokol ile Hung ve diğerlerinin protokolü arasındaki bir diğer önemli fark, Kelepçelenmiş (ve böylece enfekte olmuş) bölümün uzunluğudur. Burada açıklanan protokol kısa bir uzunluk (~ 3 mm) önermekle birlikte, Hung ve ark. Enfeksiyona maruz kalacak 20 mm distal kolonu önermek. Daha kısa segment uzunluğu, sayıyı azaltmak için seçildi.Rekombinant kriptlerin ve dolayısıyla tümörlerin oluşumu. Sporadik CRC'li hastaların çoğunda birden çok tümör olmaktan ziyade tek bir tümör geliştiğinden, bu önlem modelin klinik önemini arttırır. Tümör oluşum hızı, enfekte olmuş kolonun azalan yüzeyi tarafından etkilenmeyecek gibi görünmektedir.
Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları, kolon mukozasında yerel rekombinasyon gerektiren tüm protokolleri içerir. Kanser araştırmalarındaki çoğu uygulama, koşullu onkojenleri içerir; bu da kolorektal tümörlerin oluşumuna neden olur; Bununla birlikte, kolon mukozasında muhabir yapıları oluşturulması gibi diğer tüm uygulamalar burada sunulan protokol ile de başarılabilir.
Sonuç olarak, gelişmekte olan tümörlerin saptanması ve gözlemlenmesi için yüksek çözünürlüklü kolonoskopi seçeneğinin yanı sıra, son derece sofistike genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli kombinasyonu sunulmuştur.CRC'nin biyolojisini ve tedavisini incelemek için mükemmel bir ortam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu eser Prof. Moritz Koch'un anısına ithaf edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F.
