Summary
É apresentado um protocolo para o estabelecimento de um modelo de ratinho geneticamente modificado de câncer colorretal por infecção segmentar adeno-cre e sua vigilância através de colonoscopia de alta resolução.
Abstract
Apesar das vantagens da aplicabilidade e da relação custo-eficácia, os modelos de ratos de câncer colorretal baseados na injeção de células tumorais apresentam limitações severas e não simulam com precisão a biologia do tumor e a disseminação de células tumorais. Modelos de mouse geneticamente modificados foram introduzidos para superar essas limitações; No entanto, esses modelos são tecnicamente exigentes, especialmente em órgãos grandes, como o cólon, no qual apenas um único tumor é desejado.
Como resultado, desenvolveu-se um modelo de câncer colorretal imunocompetente, geneticamente modificado, que desenvolve tumores altamente uniformes e pode ser utilizado para estudos de biologia tumoral, bem como ensaios terapêuticos. O desenvolvimento de tumores é iniciado por infecção cirúrgica segmentar do cólon distal com vírus adeno-cri em murganhos condicionalmente mutantes compostos. Os tumores podem ser facilmente detectados e monitorados via colonoscopia. Aqui descrevemos a técnica cirúrgica da infecção segmentar de adeno-creO cólon, a vigilância do tumor através de colonoscopia de alta resolução e apresentar os tumores colorretais resultantes.
Introduction
O câncer colorretal (CRC) continua a ser uma das principais causas de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais. 1 Embora o prognóstico de pacientes com doença em estágio inicial seja bom, muitos tumores são diagnosticados em estágios posteriores em que, apesar das numerosas opções de tratamento, o prognóstico é limitado. 2 , 3 , 4 , 5
A maioria dos modelos de ratos atuais de CRC baseia-se na implantação de células tumorais derivadas de linhas celulares ou tumores de pacientes em camundongos imunodeficientes. 6 , 7 , 8 Isso leva ao local e, dependendo do local da injeção e das células tumorais usadas para injeção, às vezes tumores metastáticos. 9 , 10 No entanto, os modelos de xenoenxerto resultantes têm majoLimitações. Eles devem ser estabelecidos em camundongos imunodeficientes, eliminando assim a interação complexa entre o tumor e o sistema imune do hospedeiro. Além disso, como o estroma do tumor é derivado de células hospedeiras, a interação entre o parênquima do tumor humano eo estroma murino é defeituosa e, portanto, não é representativa da doença. Essas deficiências podem ser evitadas pelo uso de linhas celulares murinas para injeção. No entanto, apenas algumas linhas celulares CRC murinas estão disponíveis e, semelhantes às linhas celulares humanas de CRC, são monoclonais e altamente anaplásticas. 11 Em resumo, a maioria dos modelos de ratos CRC actualmente disponíveis são altamente artificiais e não são totalmente representativos da doença humana.
Os modelos de mouse geneticamente modificados (GEMMs) do CRC podem evitar essas desvantagens, pois apresentam tumores de mouse genuínos que são criados através da indução de mutações-chave do CRC no cólon. 12 , 13 ,14 Isso pode ser conseguido pela ativação de mutações germinais condicionais (floxed) pela recombinase cre dentro da mucosa colorretal. Enquanto em GEMMs de muitas outras entidades tumorais, a expressão de cremes germinativas (indutíveis) conduzida por promotores específicos de tecidos é usada, o credo germinal não pode ser usado no cólon, pois isso leva a um grande número de adenomas em todo o cólon causando a morte por carga tumoral benigna em Uma idade muito jovem. Portanto, no modelo descrito aqui, um credo que expressa o vetor adenoviral é usado para infectar um curto segmento do cólon. Isso leva à indução de tumorigênese dentro deste segmento da mucosa em um ponto de tempo definido pelo investigador, resultando em adenomas em última instância, progredindo em carcinoma invasivo e metastático. Os tumores são tumores de ratos genuínos, crescem em um microambiente intacto e, portanto, são capazes de simular a totalidade da oncogênese colorretal, incluindo a interação tumor-hospedeiro e a cascata metastática. Este modelo éPortanto, uma plataforma atraente para estudos de biologia do câncer e ensaios terapêuticos pré-clínicos.
Uma grande desvantagem dos modelos de mouse geneticamente modificados da CRC é a sua complexidade técnica. A entrega de crema local usando enemas de adeno-creativo rectal em camundongos com alelos de Apc floxed foi descrita anteriormente; No entanto, a incidência, a multiplicidade ea localização dos tumores intestinais podem ser altamente variáveis com esta técnica. 15 Portanto, a técnica de confinamento da infecção adeno-creativa pelo aperto cirúrgico do segmento a induzir foi desenvolvida. 13 Alteramos este procedimento para melhorar o bem-estar dos animais, bem como reduzir a mortalidade e o número de tumores resultantes. Com este protocolo, todos os laboratórios com experiência em cirurgia de roedores pequenos devem poder reproduzir o modelo e produzir tumores altamente reprodutíveis e de fácil acesso à colonoscopia. Dependendo do condicional mUsos utilizados para a tumorigênese, o espectro completo de adenoma, carcinoma invasivo e metástases podem ser observados. À medida que os tumores estão localizados no cólon distal, a avaliação endoscópica em série é facilmente possível neste modelo.
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Protocol
Os experimentos com animais apresentados aqui foram revisados e aprovados de forma independente por um Comitê de Uso e Cuidados de Animais institucional e governamental e foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Federação de Associações de Ciências de Animais de Laboratório (FELASA). Todas as medidas possíveis foram tomadas para minimizar o sofrimento, incluindo anestesia e analgesia ou, se necessário, eutanásia prematura.
1. Indução local do tumor através da infecção cirúrgica Adeno-cre
- Preparação de animais para cirurgia
NOTA: Virtualmente qualquer mutação condicional ("floxed") pode ser induzida através do método aqui descrito. É recomendado o uso de mutações em genes relevantes em câncer colorretal, como Apc, Kras ou Tp53. A eficiência da recombinação do creme é dependente do tamanho da construção a ser excisada. As grandes sequências de floxed são excisadas de forma menos eficiente. A recombinação de todos os alelos deve ser confirmada nos tumores por PCR.- Para o desenvolvimento de tumores colorretais, use uma cruz dos seguintes alelos condicionais para um modelo básico de CRC (número de banco de dados MGI entre colchetes):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Se um alelo repórter de fluorescência for necessário ( por exemplo , para detectar micrometástases), use o seguinte alelo:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
NOTA: Todas as cepas acima estão disponíveis através do NCI Mouse Repository ou Jackson Laboratory. Não é necessário jejum, pois todas as matérias fecais remanescentes podem ser lavadas antes da infecção adenoviral. O jejum pré-operatório leva a maior mortalidade perioperatória e constitui um tremendo estresse para pequenos roedores. - Use sevoflurano com 3 a 3,5% vol para anestesia geral. Uma perda de tO reflexo de pitada do dedo do pé indica anestesia suficiente.
- Antes da primeira incisão, injete 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea.
- Cubra os olhos do mouse anestesiado com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
- Coloque o mouse em posição supina em uma pequena mesa. Use fitas adesivas não traumáticas para restringir o mouse.
- Raspar o abdômen com uma máquina de barbear elétrica (o creme depilatório pode ser usado alternativamente) e desinfetar com cotonete com álcool ou iodo. Use o tempo de contato recomendado pelo fabricante.
- Cubra o campo cirúrgico com cortinas estéreis.
NOTA: O uso de antibióticos perioperatórios é opcional e está sujeito a diretrizes institucionais. - Use instrumentos estéreis de uso único ou esterilizados para todos os procedimentos cirúrgicos.
- Para o desenvolvimento de tumores colorretais, use uma cruz dos seguintes alelos condicionais para um modelo básico de CRC (número de banco de dados MGI entre colchetes):
- Laparotomia da linha média e exposição do cólon
- Use tesoura (os escalpelos podem ser usados alternativamente) para fazer uma incisão na linha média(~ 15 mm) da pele no abdômen inferior.
- Pegue a musculatura da parede abdominal com fórceps e cuidadosamente o incise com uma tesoura, abrindo assim a cavidade abdominal.
- Identifique o cólon distal, toque-o apenas com fórceps atraumáticos. Aperte o cólon com um grampo delicado ( por exemplo , uma braçadeira vascular Micro Serrefine) aproximadamente 15 mm proximalmente do ânus.
NOTA: Dê especial atenção à vulnerabilidade do cólon em todos os momentos. A perfuração leva inevitavelmente a peritonite e sepse e requer eutanásia do animal.
- Infecção do cólon segmentar com o vírus Adeno-cre
- Insira um tubo de Teflon flexível de forma transanal e avançar cuidadosamente até atingir a oclusão do lúmen alcançada pela braçadeira previamente colocada a 15 mm da largura anal. Não use força excessiva, pois isso pode levar a perfuração.
- Cannule o tubo com uma cânula 30G, conecte uma seringa padrão de 1 mL e elimine o coloN com solução salina normal para evacuar a matéria fecal restante. Isso pode exigir vários mL de solução salina.
- Uma vez que o cólon distal está vazio, remova o tubo e substitua-o por um tubo de Teflon fresco e novamente posicione-o diretamente distal ao grampo como descrito acima.
- Ocultar o cólon com uma segunda braçadeira ~ 3 mm distal ao grampo proximal ( ou seja , sobre o tubo inserido, ~ 12 mm da largura anal), resultando em um segmento isolado de 3 mm para ser infectado.
NOTA: Para a oclusão distal do segmento, os clipes de artéria coronária de Fogarty se mostraram mais adequados, pois são borrachas, levando a oclusão apertada do cólon, apesar do tubo intraluminal entre os ramos da braçadeira. - Use uma segunda seringa (1 mL padrão com uma cânula 30G) para injetar cuidadosamente 50 - 80 μL de tripsina-EDTA a 0,25% no segmento do cólon apertado e incubar durante 10 min. Deixe a cânula e a seringa ligadas ao tubo de Teflon para evitar que o fluido fique para trás.
- Primeiro remova a braçadeira distal e, em seguida, o tubo de tripsina.
- Lavar o cólon distal com ~ 500 μL de solução salina normal para remover a tripsina remanescente.
- Insira um novo tubo de Teflon, coloque a braçadeira distal no local e infle o segmento do cólon com 50 a 80 μL de solução adenoviral (10 11 unidades formadoras de placa (PFU) / mL em solução salina tamponada com fosfato) e incube durante 30 min ( Figura 2A ).
NOTA: Não derrame a solução viral, pois o contato com adeno-cre pode levar ao desenvolvimento de tumores em qualquer tecido de camundongos condicionalmente mutantes. - Remova as braçadeiras e o tubo.
- Encerramento do abdômen e recuperação pós-operatória
- Feche a parede abdominal com 6-0 de absorção rápida(Por exemplo , polidioxanona (PDS)).
- Feche a pele com os clipes da ferida cirúrgica.
- Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento ajustada para 38 ° C até se recuperar completamente da anestesia.
- Administrar outro bolus de 0,05 mg / kg de buprenorfina ip 12 h após a cirurgia, seguido de bolos de buprenorfina adicionais a cada 12 h, se necessário.
- Monitore os ratos pelo menos uma vez por dia para detectar sinais de angústia devido ao crescimento do tumor.
2. Colonoscopia
NOTA: Dependendo das mutações condicionais utilizadas, a infecção adenoviral leva a tumores endoscopicamente visíveis dentro de 2 a 4 semanas. Portanto, realize a primeira colonoscopia pós-operatória 2 semanas após a indução adenoviral e repita a cada 2 semanas. Um sistema comercialmente disponível é recomendado para colonoscopia murina. 20
- Preparação de animais para colonoscopia
NOTA: Não é necessário jejumEd. A matéria fecal restante geralmente está bem formada no cólon distal e pode ser empurrada para além do tumor durante a colonoscopia, tornando desnecessário o processo estressante do jejum repetido.- Use sevoflurano com 3 a 3,5% vol para anestesia geral. Uma perda do reflexo de pinça do dedo do pé indica anestesia suficiente.
- Cubra os olhos dos ratos anestesiados com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
- Limite os camundongos em posição supina numa mesa pequena.
- Colonoscopia
- Insira o escopo (diâmetro 1,9 mm, comprimento 10 cm) no trato intestinal através do ânus e cuidadosamente insufa ar sob controle visual para distender o cólon. Não insufie mais ar do que o necessário para o exame.
NOTA: Para a insuflação de ar, a bomba de ar anti-nevoeiro do sistema de colonoscopia pode ser utilizada. Se nenhuma bomba de ar anti-neblina estiver disponível, qualquer outra bomba de ar com configurações de pressão muito baixa pode ser usada, ou préAr ssurizado com uma delicada válvula de redução de pressão. O dióxido de carbono (CO 2 ) facilmente conduz a acidose em pequenos roedores e, portanto, deve ser evitado. - Pressione cuidadosamente o escopo até que uma lesão da mucosa no cólon distal possa ser identificada ( Figura 1A - 1D ).
- Salve imagens endoscópicas para avaliação posterior. Um sistema endoscópico de pontuação para tumores intraluminais já foi descrito anteriormente. 20
- Remova cuidadosamente o escopo e coloque o mouse na almofada de aquecimento ajustada para 38 ° C até que ele tenha sido totalmente recuperado da anestesia.
- Insira o escopo (diâmetro 1,9 mm, comprimento 10 cm) no trato intestinal através do ânus e cuidadosamente insufa ar sob controle visual para distender o cólon. Não insufie mais ar do que o necessário para o exame.
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Representative Results
Se for realizado adequadamente,> 85% dos animais desenvolvem tumores. A mortalidade do procedimento cirúrgico aqui apresentado é <5%, a mortalidade da colonoscopia é praticamente inexistente. Na maioria dos ratos, uma única lesão é detectada; Em cerca de 30% 2 - 3 pequenos adenomas podem ser detectados, que geralmente se fundem em um único tumor dentro de 2 a 3 semanas após a indução do tumor.
O fenótipo eo comportamento biológico dos tumores resultantes são altamente dependentes das mutações condicionais dos animais. O knockout de Apc, criado localmente, é suficiente para induzir a tumorigênese e, inicialmente, leva ao adenoma, que pode ser detectado 2 a 4 semanas após a infecção adenoviral e que avança para o adenocarcinoma invasivo dentro de 12 a 16 semanas. Este processo pode ser acelerado pela adição de uma mutação Kras oncogênica condicional (Kras G12D), os tumores resultantes progridem rapidamente para invasoresAdenocarcinoma. Após a adição de Tp53 R172H oncogênico, os tumores evoluem rapidamente para o carcinoma invasivo e metastático. A sobrevivência depende fortemente do genótipo dos tumores; A sobrevivência mediana geralmente é de cerca de 80 a 200 dias após a indução do tumor. A causa da morte na grande maioria dos casos é a obstrução do intestino grosso secundária ao crescimento tumoral.
Os tumores podem ser controlados facilmente e repetidamente através de colonoscopia ( Figura 1 ) sem maior estresse para os animais.
As manifestações da doença são muito semelhantes ao CRC humano. Os animais desenvolvem adenomas e, finalmente, adenocarcinomas do cólon distal ( Figuras 2B, 2C, 2F ). Dependendo do genótipo condicional dos camundongos, os tumores também metástase para o peritoneu ( Figura 2D ), os fígados ( Figura 2E ) e raros Os pulmões (não mostrados). Se for utilizado um aleatório repontório cre ( por exemplo , ZSGreen 19 ), todas as manifestações tumorais podem ser facilmente identificadas. O aleatório do repórter ZSGreen apresenta uma expressão de proteína fluorescente suficientemente brilhante para ser visível à luz do dia ( Figura 1B , Figura 2C ).
Histologicamente, 95% dos tumores em desenvolvimento são adenocarcinomas. Cerca de 5% dos tumores são de origem mesenquimatosa, por exemplo , fibrossarcoma ou leiomiossarcoma, presumivelmente desenvolvendo a partir de células estromas que foram acidentalmente infectadas com adeno-cre. A histomorfologia dos adenocarcinomas se assemelha bastante ao CRC humano, apresentando todo o espectro do adenoma não invasivo ao adenocarcinoma que invade as estruturas circundantes ( Figura 3A-3C ).
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Figura 1. Imagens colonoscópicas de tumores colorretais (Alleles Condicionais do Animal Dado em Brackets).
A. Cólon distal normal. B. Adenoma precoce 2 semanas após a infecção adeno-cre. Observe a cor verde devido a um aleatório do repórter GFP neste mouse. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Adenoma tardio (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Adenocarcinoma colorrectal (como diagnosticado por patologia após a obtenção das imagens de colonoscopia, Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Figura 2. A. Situs intra-operatório . Observe o grande grampo de borracha Fogarty na parte inferior e o tubo inserido de forma transanal para injeção adeno-cre (seta vermelha). B. Tumor colorretal (flecha branca) com obstrução intestinal consecutiva 8 semanas após a infecção adeno-cre (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Tumor colorretal (seta branca) 10 semanas após a infecção adeno-cre (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Observe a cor esverdeada devido a um alelo repórter de proteína fluorescente verde (GFP) neste mouse. D. Carcinose peritoneal (setas negras) no GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Fígado e intestino foram removidos para expor os rins e o diafragma. E. Metástases hepáticas brutas no GEMM 12 semanas após adeno-creFection (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colon com tumor após remoção do animal representado na Figura 2C . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3. Seções manchadas de tumores colorretais de hematoxilina / Eosina (H / E) do GEMM.
A. Zona de transição da mucosa normal para adenocarcinoma com infiltração de mucosa, submucosa e muscularis mucosae (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Zona de transição da mucosa colônica normal ao adenocarcinoma invasivo (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Adenocarcinoma de alto grau com infiltração do tecido circundante (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
Embora geralmente sejam fáceis de gerar e manter, os modelos clássicos de ratos CRC baseados na injeção de linha celular são artificiais e não são capazes de recapitular completamente a doença humana. Como conseqüência, os GEMMs foram desenvolvidos. O primeiro CRC GEMM foi o mouse Apc Min , que abriga uma mutação nula heterozigótica no gene Apc, imitando a polipose adenomatosa familiar (FAP) da doença hereditária humana. 21 Contudo, os ratos Apc Min invariavelmente desenvolvem adenomas intestinais múltiplos não limitados ao cólon; Além disso, o tempo e a localização exata da formação de adenoma são aleatórios e os tumores raramente se desenvolvem em lesões malignas à medida que o mouse morre de carga tumoral benigna antes que os adenomas possam progredir. Portanto, o mouse Apc Min é um modelo de FAP, não CRC esporádico. Outros modelos apresentam mutações nos genes de reparação de falta de DNA. 22 , 23 Embora alguns dessesOs ratos são modelos excelentes para o câncer gastrointestinal hereditário, eles não representam câncer colorretal esporádico.
Além da alteração genética subjacente, é a localização da lesão genética que separa os modelos de câncer colorretal esporádico e sindrômico. Todos os modelos acima mencionados apresentam mutações que são constitutivamente ativas ou induzidas ao longo do cólon ou mesmo todo o trato gastrointestinal. Isso resulta na formação de múltiplos adenomas, que não é representativo da CRC esporádica humana, dificilmente é avaliável pela colonoscopia e, além disso, geralmente não deixa os tumores tempo suficiente para se desenvolver antes de o animal sucumbir à extensa carga tumoral. Portanto, um modelo de mouse para câncer colorretal esporádico deve incorporar a ativação local da tumorigênese colorretal.
Os tumores que surgem no aqui apresentado GEMM são estritamente confinados ao segmento cirurgicamente apertado e adeno-cre-infectadoDo cólon. Isso resulta na formação de um único tumor que é facilmente acessível para detecção e vigilância por colonoscopia. Além disso, a localização distal torna a obstrução intestinal uma complicação tardia do crescimento do tumor, permitindo que os tumores se desenvolvam em carcinoma invasivo e, dependendo do genótipo, metastático antes do animal requerem eutanásia. Outra vantagem da infecção por segmentos é o ambiente não afetado. Enquanto no Apc Min e outros modelos de ratos hereditários, a mucosa circundante e até mesmo as células do estroma sofrem as mesmas aberrações genéticas que os tumores, os tumores no modelo aqui proposto se desenvolvem dentro do epitélio e estroma colônico normais. Isso permite uma interação tumor-hospedeiro mais realista e estudos moleculares sem restrições. Além disso, o ponto de tempo da indução tumoral é bem definido neste modelo. Enquanto no mouse Apc Min , os tumores se desenvolvem após o "segundo golpe", durante o qual o segundo alelo Apc é stochastPerda em um ponto de tempo aleatório, todas as mutações desejadas são ativadas simultaneamente no modelo descrito aqui, permitindo estudos de lesões muito precoces ou biópsias consecutivas de maneira muito definida.
No entanto, esse modelo também vem com limitações. O cruzamento de múltiplos alelos em um modelo requer um tremendo tempo e recursos; Além disso, muitas vezes nem toda prole pode ser usada para as experiências devido a um genótipo inadequado. O procedimento em si exige prática e é demorado. A produção de suspensão de vírus adeno-cre com títulos suficientemente elevados e em grandes quantidades é intensiva em custos. Portanto, este modelo não é adequado para substituir todos os outros modelos de mouse CRC e será limitado a laboratórios com foco distinto nos modelos GEM.
O protocolo em si é tecnicamente exigente, mas com algum treinamento que o pessoal não cirúrgico pode realizar os procedimentos adequadamente. O passo crítico durante o adeno-cre iA infeção é a inflação do segmento do intestino apertado - o excesso de pressão intraluminal leva à perfuração, pressão insuficiente reduz a taxa de infecção bem sucedida. Este passo requer treinamento.
Um protocolo para a infecção adenoviral do cólon distal foi publicado por Hung et al. antes. 13 O protocolo aqui apresentado difere do protocolo acima mencionado em vários aspectos principais. Como freqüentemente causa perfuração intestinal em mãos inexperientes, a abrasão mecânica da mucosa antes da incubação adeno-creativa é ignorada no presente protocolo. Isso resulta em uma taxa reduzida de formação de tumor, que, no entanto, pode ser contrariada pelo aumento dos títulos virais. Desta forma, a taxa de tumores mesenquimatosos também pode ser reduzida, pois sem abrasão mucosa, menos células mesenquimatosas dentro da parede intestinal estão expostas a adeno-cre.
Além disso, em contraste com o protocolo acima mencionado 13, o aquiO protocolo descrito não recomenda jejum durante a noite antes da cirurgia ou colonoscopia. Em vez disso, lavagem do intestino ou, em caso de colonoscopia, manipulação mecânica simples é usada para remover a matéria fecal remanescente. Este aperfeiçoamento do protocolo melhora drasticamente o bem-estar dos animais. O jejum durante a noite é um procedimento altamente estressante para pequenos roedores e é conhecido por influenciar fortemente o metabolismo murino, portanto também influenciando os resultados experimentais. 24 , 25 Estes efeitos indesejáveis do jejum durante a noite podem ser evitados no manuscrito aqui apresentado.
Outra diferença importante entre o protocolo aqui apresentado e o protocolo de Hung et al. É o comprimento do segmento apertado (e, portanto, infectado). Enquanto o protocolo aqui descrito recomenda um comprimento curto (~ 3 mm), Hung et al. Recomendar 20 mm do cólon distal a ser infectado. O comprimento do segmento mais curto foi escolhido para reduzir o númeroDe criptas recombinadas e, assim, tumores resultantes. Como a maioria dos pacientes com CRC esporádica desenvolve um tumor único em vez de múltiplos tumores, esta medida aumenta a relevância clínica do modelo. A taxa de formação de tumor não parece ser afetada pela superfície reduzida do cólon infectado.
As aplicações futuras desta técnica incluem todos os protocolos que requerem recombinação de cretas locais dentro da mucosa do cólon. A maioria das aplicações na pesquisa sobre câncer incluirá oncogenes condicionais, levando à formação de tumores colorretais; No entanto, todas as outras aplicações, como a indução de construções repórter dentro da mucosa do cólon, podem ser alcançadas com o protocolo aqui apresentado.
Em conclusão, aqui apresentou a combinação de um modelo altamente sofisticado de mouse de câncer colorretal modificado por ratos, juntamente com a opção de colonoscopia de alta resolução para a detecção e vigilância dos tumores em desenvolvimento, fornecemÉ um excelente cenário para estudar a biologia e o tratamento da CRC.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é dedicado à memória do professor Moritz Koch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F.
