Summary
Viene presentato un protocollo per la creazione di un modello di topi geneticamente modificato del cancro del colon-retto mediante infezione adenocarica segmentale e la sua sorveglianza mediante colonscopia ad alta risoluzione.
Abstract
Nonostante i vantaggi di una facile applicabilità e di un rapporto costo-efficacia, i modelli del topo tumorale colorato a base di iniezione di cellule tumorali hanno gravi limitazioni e non simulano accuratamente la biologia tumorale e la diffusione delle cellule tumorali. I modelli del mouse geneticamente modificati sono stati introdotti per superare questi limiti; Tuttavia, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, specialmente in grandi organi come il colon in cui è desiderato un solo tumore.
Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di topo immunocompetente, geneticamente modificato del cancro del colon-retto, che sviluppa tumori altamente uniformi e può essere utilizzato per studi di biologia tumorale, nonché studi terapeutici. Lo sviluppo del tumore è iniziato dall'infezione chirurgica, segmentale del colon distale con virus adeno-cre in topi condizionati condizionatamente mutanti. I tumori possono essere facilmente rilevati e monitorati tramite colonscopia. Qui descriviamo la tecnica chirurgica dell'infezione segmentale di adeno-creIl colon, la sorveglianza del tumore mediante colonscopia ad alta risoluzione e presentare i tumori colorettali risultanti.
Introduction
Il cancro del colon-retto (CRC) continua ad essere una delle cause principali della morte correlata ai tumori nei paesi occidentali. 1 Mentre la prognosi dei pazienti con malattia precoce è buona, molti tumori vengono diagnosticati in fasi successive in cui, nonostante numerose opzioni di trattamento, la prognosi è limitata. 2 , 3 , 4 , 5
La maggior parte dei modelli di mouse correnti del CRC si basa sull'impianto di cellule tumorali derivate da linee cellulari o tumori del paziente in topi immunodeficienti. 6 , 7 , 8 Questo porta a locali e, a seconda del sito di iniezione e delle cellule tumorali utilizzate per l'iniezione, a volte tumori metastatici. 9 , 10 Tuttavia, i modelli risultanti di xenograft hanno majoR limitazioni. Devono essere stabiliti in topi immunodeficienti, eliminando così l'interazione complessa tra il tumore e il sistema immunitario ospitante. Inoltre, poiché lo stroma tumorale è derivato da cellule ospitanti, l'interazione tra parenchima tumorale umana e stroma murina è difettosa e quindi non rappresentativa della malattia. Queste carenze possono essere evitate con l'uso di linee cellulari murine per l'iniezione. Tuttavia, solo alcune linee di cellule CRC murine sono disponibili e, simili alla maggior parte delle linee cellulari CRC umane disponibili, sono monoclonali e altamente anaplatiche. 11 In sintesi, la maggior parte dei modelli CRC attualmente disponibili sono altamente artificiali e non rappresentano pienamente rappresentativi della malattia umana.
I modelli di topi geneticamente modificati (GEMM) di CRC possono evitare questi inconvenienti in quanto presentano tumori di mouse genuini che vengono creati attraverso l'induzione di mutazioni chiave del CRC nel colon. 12 , 13 ,14 Ciò può essere ottenuto mediante l'attivazione di mutazioni della germinazione condizionale (floxed) mediante la ricombinasi all'interno della mucosa colorettale. Mentre in GEMM di molte altre entità del tumore si utilizza l'espressione germinale (inducibile) creata da promotori specifici del tessuto, la creazione di germline cre non può essere utilizzata nel colon come questo porta ad un gran numero di adenomi in tutto il colon causando la morte per carico tumorale benigno Un'età molto giovane. Pertanto, nel modello qui descritto, un virus adenovirale che esprime l'espressione cre è usato per infettare un segmento corto di due punti. Ciò porta all'induzione della tumorigenesi all'interno di questo segmento della mucosa in un punto temporale definito dall'individuo, con conseguente adenoma in ultima analisi che procede al carcinoma invasivo e metastatico. I tumori sono tumori genuini del topo, crescono in un microambiente intatto e quindi sono in grado di simulare l'intero oncogenesis del colon-retto, tra cui l'interazione tumor-host e la cascata metastatica. Questo modello èQuindi una piattaforma interessante per studi sulla biologia del cancro e sulle prove terapeutiche precliniche.
Uno svantaggio maggiore dei modelli di topi geneticamente modificati del CRC è la loro complessità tecnica. La distribuzione locale cre crea con clistere rettale adeno-cre nei topi che trasportano alleli APc floccati è stata descritta prima; Tuttavia, l'incidenza, la molteplicità e l'ubicazione dei tumori intestinali possono essere molto variabili con questa tecnica. Pertanto, è stata sviluppata la tecnica di limitare l'infezione da adeno-cre mediante bloccaggio chirurgico del segmento da indurre. 13 Abbiamo modificato questa procedura per migliorare il benessere degli animali, ridurre la mortalità e il numero di tumori che ne derivano. Con questo protocollo, tutti i laboratori con esperienza in piccole chirurgia di roditori dovrebbero poter riprodurre il modello e produrre tumori altamente riproducibili e facilmente accessibili alla colonscopia. A seconda del condizionale mSi possono osservare utature utilizzate per tumorigenesi, l'intero spettro di adenoma, carcinoma invasivo e metastasi. Poiché i tumori si trovano nel colon distale, la valutazione endoscopica seriale è facilmente possibile in questo modello.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gli esperimenti animali qui presentati sono stati riesaminati e approvati in maniera indipendente da un comitato istituzionale e governativo per la cura degli animali e sono stati condotti secondo le linee guida dell'Associazione federale delle scienze animali animali (FELASA). Tutte le misure possibili sono state prese per ridurre al minimo la sofferenza, inclusa l'anestesia e l'analgesia o, se necessario, l'eutanasia precoce.
1. Induzione tumorale locale attraverso l' infezione da Adeno-crea chirurgica
- Preparazione degli animali per la chirurgia
NOTA: Virtualmente qualsiasi mutazione condizionale ("floccata") può essere indotta dal metodo qui descritto. Si raccomanda l'uso di mutazioni nei geni rilevanti nel cancro del colon-retto come ad esempio Apc, Kras o Tp53. L'efficienza della ricombinazione crea dipende dalla dimensione del costrutto da escludere. Le grandi sequenze floccate vengono escluse in modo meno efficiente. La ricombinazione di tutti gli alleli deve essere confermata nei tumori da parte del PCR.- Per lo sviluppo di tumori del colon-retto, utilizzare una croce dei seguenti alleli condizionali per un modello di base di CRC (numero di database MGI tra parentesi):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Se è richiesto un allele reporter di fluorescenza ( ad esempio , per rilevare micrometastasi), utilizzare il seguente allele:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
NOTA: Tutti i ceppi sopra sono disponibili tramite il repository NCI Mouse o il laboratorio di Jackson. Nessun digiuno è necessario perché tutta la materia fecale rimanente può essere svuotata prima dell'infezione adenovirale. Il digiuno preoperatorio conduce a una maggiore mortalità perioperatoria e costituisce un tremendo stress per i piccoli roditori. - Utilizzare sevoflurano a 3 - 3,5 vol% per l'anestesia generale. Una perdita di tIl suo toe ripiegamento pizzico indica un'anestesia sufficiente.
- Prima della prima incisione, iniettare 0.05 mg / kg di buprenorfina sottocutanea.
- Coprire gli occhi del mouse anestetizzato con unguento oculare per evitare la desquamazione della cornea.
- Posizionare il mouse in posizione supina su un piccolo tavolo. Utilizzare nastri adesivi non traumatici per trattenere il mouse.
- Rasare l'addome con un rasoio elettrico (crema depilatoria può essere usato alternativamente) e disinfettare con tamponi di alcol o iodio. Utilizzare il tempo di contatto raccomandato dal produttore.
- Coprire il campo chirurgico con tende sterili.
NOTA: l'uso di antibiotici perioperatori è facoltativo e soggetto a linee guida istituzionali. - Utilizzare sterili singoli usi o strumenti sterilizzati per tutte le procedure chirurgiche.
- Per lo sviluppo di tumori del colon-retto, utilizzare una croce dei seguenti alleli condizionali per un modello di base di CRC (numero di database MGI tra parentesi):
- Laparotomia midline e esposizione del colon
- Utilizzare forbici (possono essere usati alternativamente scalpelli) per eseguire un'incisione midline(~ 15 mm) della pelle sull'addome inferiore.
- Raccogliete la muscolatura della parete addominale con le pinze e incisi con cura con forbici, aprendo così la cavità addominale.
- Identificare il colon distale, toccarla solo con pinze atraumatiche. Morsetti il colon con un morsetto delicato ( ad es . Un morsetto vascolare Micro Serrefine) circa 15 mm in prossimità dell'ano.
NOTA: prestare particolare attenzione alla vulnerabilità del colon in ogni momento. La perforazione porta inevitabilmente alla peritonite e alla sepsi e richiede l'eutanasia dell'animale.
- Infezione segmentale del colon con virus Adeno-cre
- Inserire un tubo flessibile di Teflon in modo transanale e accuratamente avanzarlo fino a raggiungere l'occlusione del lumen raggiunta dal morsetto precedentemente posizionato a 15 mm dall'orlo anale. Non utilizzare una forza eccessiva in quanto ciò può portare alla perforazione.
- Canottare il tubo con una cannula da 30G, collegare una siringa standard da 1 ml e scuotere il coloN con normale soluzione salina per evacuare la restante materia fecale. Ciò può richiedere diversi ml di soluzione salina.
- Una volta che il colon distale è vuoto togliere il tubo e sostituirlo con un nuovo tubo in teflon e posizionarlo nuovamente distalmente al morsetto come sopra descritto.
- Collocare il colon con un secondo morsetto distanziato di circa 3 mm dal morsetto prossimale ( cioè sopra il tubo inserito, ~ 12 mm dal bordo anale), con conseguente infezione di un segmento isolato da 3 mm.
NOTA: per l'occlusione distale del segmento Le clip di arterie coronarie di Fogarty si sono dimostrate più idonee in quanto sono gommate, portando ad una occlusione stretta del colon nonostante il tubo intralumino tra i rami del morsetto. - Usare una seconda siringa (standard 1 mL con una cannula da 30G) per iniettare con cura 50-80 μL di 0,25% di Trypsin-EDTA nel segmento del colon bloccato e incubare per 10 minuti. Lasciare la cannula e la siringa attaccata al tubo in teflon per evitare che il liquido venisse ripreso.
- Primo rimuovere il morsetto distale e poi il tubo di tripsina.
- Spurgare il colon distale con ~ 500 μl di soluzione salina normale per rimuovere la restante tripsina.
- Inserire un nuovo tubo di Teflon, mettere il morsetto distale in posizione e gonfiare il segmento del colon con 50-80 μL di soluzione adenovirale (10 11 unità di formazione di placche (PFU) / mL in soluzione salina fosfata) e incubare per 30 min Figura 2A ).
NOTA: Non versare la soluzione virale come contatto con adeno-cre può portare allo sviluppo del tumore in qualsiasi tessuto di topi condizionatamente condizionati. - Rimuovere i morsetti e il tubo.
- Chiusura dell'addome e recupero postoperatorio
- Chiudere la parete addominale con 6-0 rapidamente assorbibili su su(Ad esempio , polidioxanone (PDS)).
- Chiudere la pelle con le ferite chirurgiche.
- Posizionare il mouse sul pannello di riscaldamento impostato a 38 ° C finché non sia completamente recuperato dall'anestesia.
- Amministrare un altro bollo di 0,05 mg / kg di buprenorfina ip 12 ore dopo l'intervento chirurgico, seguita da bolus addizionali di buprenorfina ogni 12 ore se necessario.
- Monitorare i topi almeno una volta al giorno per segni di sofferenza a causa della crescita del tumore.
2. Colonscopia
NOTA: A seconda delle mutazioni condizionali utilizzate, l'infezione adenovirale porta a tumori endoscopicamente visibili entro 2 - 4 settimane. Pertanto eseguire la prima colonscopia postoperatoria 2 settimane dopo l'induzione adenovirale e ripetere ogni 2 settimane. Si raccomanda un sistema commercialmente disponibile per la colonscopia murina. 20
- Preparazione degli animali per colonscopia
NOTA: nessun digiuno è richiestoed. La rimanente materia fecale è generalmente ben formata nel colon distale e può essere spinta al di là del tumore durante la colonscopia, rendendo così inutile il processo stressante del ripetuto digiuno.- Utilizzare sevoflurano a 3 - 3,5 vol% per l'anestesia generale. Una perdita del riflesso del pizzico del piede indica un'anestesia sufficiente.
- Coprire gli occhi dei topi anestetizzati con unguento oculare per evitare la desquamazione della cornea.
- Restringere i topi in posizione supina su un piccolo tavolo.
- Colonscopia
- Inserire il campo d'azione (diametro 1,9 mm, lunghezza 10 cm) nel tratto intestinale attraverso l'ano e con aria accuratamente insufflato sotto controllo visivo per distendere il colon. Non insufflate più aria di quanto richiesto per l'esame.
NOTA: per l'insufflazione dell'aria, può essere utilizzata la pompa dell'aria anti-nebbia del sistema di colonscopia. Se non è disponibile una pompa dell'aria anti-nebbia, è possibile utilizzare qualsiasi altro pompa ad aria con impostazioni di pressione molto basse o preAria compressa con una delicata valvola di riduzione della pressione. L'anidride carbonica (CO 2 ) porta facilmente all'acidosi nei piccoli roditori e deve quindi essere evitato. - Spingere con attenzione la portata in avanti fino a individuare una lesione mucosa nel distro distale ( Figura 1A - 1D ).
- Salva immagini endoscopiche per una valutazione successiva. Un sistema di punteggio endoscopico per tumori intraluminali è stato descritto in precedenza. 20
- Rimuovere attentamente la portata e posizionare il mouse sul pannello di riscaldamento impostato a 38 ° C finché non sia completamente recuperato dall'anestesia.
- Inserire il campo d'azione (diametro 1,9 mm, lunghezza 10 cm) nel tratto intestinale attraverso l'ano e con aria accuratamente insufflato sotto controllo visivo per distendere il colon. Non insufflate più aria di quanto richiesto per l'esame.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Se eseguita adeguatamente,> 85% degli animali sviluppa tumori. La mortalità della procedura chirurgica qui presentata è <5%, la mortalità della colonoscopia è praticamente inesistente. Nella maggior parte dei topi è stata individuata una singola lesione; In circa il 30% possono essere rilevati 2 - 3 piccoli adenomi che si fondono di solito in un unico tumore entro 2-3 settimane dall'insorgenza del tumore.
Il fenotipo e il comportamento biologico dei tumori risultanti sono fortemente dipendenti dalle mutazioni condizionali degli animali. Il colpo di origine mediato di Apc è sufficiente a indurre la tumorigenesi e conduce inizialmente ad adenoma, che può essere rilevato 2 - 4 settimane dopo l'infezione adenovirale e che avanza fino ad un adenocarcinoma invasivo entro 12-16 settimane. Questo processo può essere accelerato aggiungendo una condizione oncogenica Kras mutazione (Kras G12D), i tumori risultanti rapidamente avanzare a invasivoadenocarcinoma. Dopo l'aggiunta di Tp53 R172H oncogenici i tumori avanzano rapidamente a carcinoma invasivo e metastatico. La sopravvivenza dipende fortemente dal genotipo dei tumori; La sopravvivenza mediana è di solito circa 80 - 200 giorni dopo l'induzione del tumore. La causa della morte nella grande maggioranza dei casi è l'ostruzione dell'intestino di grandi dimensioni a seconda della crescita tumorale.
I tumori possono essere facilmente e ripetutamente monitorati tramite colonscopia ( Figura 1 ) senza stress importante per gli animali.
Le manifestazioni della malattia sono molto simili ai CRC umani. Gli animali sviluppano adenomi e, infine, adenocarcinomi del colon distale ( figure 2B, 2C, 2F ). A seconda del genotipo condizionale dei topi, i tumori metastasizzano anche il peritoneo ( Figura 2D ) i fegati ( Figura 2E ) e rari I polmoni (non mostrati). Se si utilizza un allele reporter ( es . ZSGreen 19 ), tutte le manifestazioni tumorali possono essere facilmente identificate. L'allele reporter ZSGreen presenta un'espressione proteica fluorescente abbastanza luminosa da essere visibile alla luce del giorno ( Figura 1B , Figura 2C ).
Istologicamente, il 95% dei tumori in via di sviluppo sono adenocarcinomi. Circa il 5% dei tumori è di origine mesenchimale, ad es . Fibrosarcoma o leiomyosarcoma, presumibilmente sviluppando da cellule stromali che sono state infettate accidentalmente con adeno-cre. La histomorfologia degli adenocarcinomi somiglia molto a CRC umano, che caratterizza l'intero spettro da un adenoma non invasivo all'adenocarcinoma che invade le strutture circostanti ( Figura 3A - 3C ).
File / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
Figura 1. Immagini colonscopiche dei tumori del colon-retto (Alleles condizionale dell'animale in parentesi).
A. Colon distale normale. B. Adenoma precoce 2 settimane dopo l'infezione adeno-cre. Nota il colore verde dovuto ad un allele reporter GFP in questo mouse. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Adenoma tardiva (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Adenocarcinoma colorettale (come diagnosticato da patologia dopo le immagini di colonscopia; Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2.jpg "/>
Figura 2. A. Situs intraoperatorio . Si noti la grande clip gommata Fogarty in basso e il tubo transanalmente inserito per l'iniezione adeno-cre (freccia rossa). B. Tumore del colon-retto (freccia bianca) con ostruzione consecutiva di grandi intestini 8 settimane dopo l'infezione da adeno-cre (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Tumore del colon-retto (freccia bianca) 10 settimane dopo l'infezione da adeno-cre (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Si noti il colore verdolino dovuto a un allele reporter di proteine fluorescenti verdi (GFP) in questo mouse. D. Carcinosi peritoneale (frecce nere) nel GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Il fegato e l'intestino sono stati rimossi per esporre i reni e il diaframma. E. Metastasi epatiche lombali nel GEMM 12 settimane dopo l'adeno-cre(Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colon con tumore dopo la rimozione dall'animale raffigurato in Figura 2C . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Hematoxylin / Eosin (H / E) Parti macchiate di tumori colorettali dal GEMM.
A. Zona transitoria dalla mucosa normale all'adenocarcinoma con infiltrazione di mucosa, mucosa subacusa e muscolare (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Zona transitoria dalla normale mucosa del colon all'adenocarcinoma invasivo (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Adenocarcinoma ad alto grado con infiltrazione del tessuto circostante (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mentre sono generalmente facili da generare e mantenere, i modelli classici di CRC basati sull'iniezione della linea cellulare sono artificiali e non sono in grado di ricapitolare completamente la malattia umana. Di conseguenza, i GEMM sono stati sviluppati. Il primo GEMM CRC era il mouse Apc Min , che ospita una mutazione null eterozigote nel gene Apc, quindi imitando la poliposi adenomatica familiare familiare (FAP) della malattia ereditaria umana. Tuttavia, i topi Apc Min sviluppano invariabilmente più adenomi intestinali multipli che non sono limitati al colon; Inoltre, il tempo e l'esatta posizione di formazione dell'adenoma sono casuali e i tumori si sviluppano raramente in lesioni maligne poichè il mouse muore di carico tumorale benigno prima che gli adenomi possano progredire. Pertanto, il mouse Apc Min è un modello di FAP, non sporadico CRC. Altri modelli presentano mutazioni nei geni di riparazione del mismatch del DNA. 22 , 23 Anche se alcuni di questiI topi sono modelli eccellenti per il cancro ereditario gastrointestinale, non rappresentano il cancro colorettale sporadico.
A parte l'alterazione genetica sottostante, è la posizione della lesione genetica che distingue i modelli di cancro colorettale sporadico e sindrome. Tutti i modelli sopra menzionati mostrano mutazioni che sono costitutivamente attive o indotte in tutto il colon o addirittura l'intero tratto gastrointestinale. Ciò si traduce nella formazione di adenomi multipli, che non sono rappresentativi di CRC sporadici umani, è difficilmente valutabile dalla colonscopia e, inoltre, di solito non lascia i tumori abbastanza tempo per svilupparsi prima che l'animale subiscano al carico tumorale esteso. Pertanto, un modello del mouse per il cancro colorettale sporadico deve incorporare l'attivazione locale della tumorigenesi del colon-retto.
I tumori che emergono nel GEMM presentato qui sono strettamente limitati al segmento chirurgicamente bloccato e adeno-cre-infettoDel colon. Ciò comporta la formazione di un singolo tumore facilmente accessibile alla rilevazione e alla sorveglianza mediante colonscopia. Inoltre, la posizione distale rende l'ostruzione intestinale una complicazione tardiva della crescita tumorale, consentendo ai tumori di svilupparsi in invasiva e, a seconda del genotipo, il carcinoma metastatico prima che l'animale richiede eutanasia. Un altro vantaggio dell'infezione segmentale è l'ambiente non influenzato. Mentre in Apc Min e in altri modelli di topi ereditari, la mucosa circostante e persino le cellule stromali subiscono le stesse aberrazioni genetiche dei tumori, i tumori del modello proposto qui si sviluppano all'interno del normale epitelio colonico e dello stroma. Ciò consente un'interazione più realistica del tumore e degli studi molecolari senza restrizioni. Inoltre, il punto di tempo dell'induzione del tumore è ben definito in questo modello. Mentre nel mouse Apc Min , i tumori si sviluppano dopo il "secondo colpo", durante il quale il secondo allele Apc è stocasticoPerso in un punto temporale casuale, tutte le mutazioni desiderate vengono attivate simultaneamente nel modello qui descritto, consentendo così studi di lesioni molto precoci o biopsie consecutive in modo ben definito.
Tuttavia, questo modello è dotato di limitazioni. L'attraversamento di più alleli in un modello richiede tempi e risorse enormi; Inoltre, spesso non tutte le prole possono essere utilizzate per gli esperimenti a causa di un genotipo non idoneo. La procedura stessa richiede pratica e richiede tempo. La produzione di sospensione adeno-cre virale con titoli sufficientemente elevati e in grandi quantità è costosa. Pertanto, questo modello non è adatto per sostituire tutti gli altri modelli di mouse CRC e sarà limitato a laboratori con una particolare attenzione sui modelli GEM.
Il protocollo stesso è tecnicamente impegnativo, ma con qualche addestramento non chirurgico può eseguire le procedure in modo adeguato. Il passo critico durante l'adeno-cre iLa nfection è l'inflazione del segmento intestinale intasato - l'eccesso di pressione intraluminale porta alla perforazione, la pressione insufficiente riduce la velocità di infezione. Questo passaggio richiede una formazione.
Un protocollo per l'infezione adenovirale del colon distale è stato pubblicato da Hung et al. prima. 13 Il protocollo qui presentato differisce dal protocollo sopra menzionato in diversi aspetti chiave. Poiché spesso causa la perforazione intestinale in mani inesperte, l'abrasione meccanica della mucosa prima dell'incubazione adeno-crea viene ignorata nel presente protocollo. Ciò comporta una riduzione della percentuale di tumore, che però può essere contrastata da aumentati titoli virali. In questo modo, la velocità dei tumori mesenchimali può essere ridotta anche in quanto, senza l'abrasione della mucosa, meno cellule mesenchimali all'interno della parete intestinale sono esposte all'adeno-cre.
Inoltre, al contrario del precedente protocollo 13 quiIl protocollo descritto non raccomanda il digiuno durante la notte prima di chirurgia o colonscopia. Invece, la rottura dell'intestino o, in caso di colonscopia, una semplice manipolazione meccanica viene usata per rimuovere la rimanente materia fecale. Questa raffinatezza del protocollo migliora drasticamente il benessere degli animali. Il digiuno durante la notte è una procedura altamente stressante per i piccoli roditori e conosciuta per influenzare fortemente il metabolismo murino, quindi influenzando anche i risultati sperimentali. 24 , 25 Questi effetti indesiderati del digiuno durante la notte possono essere evitati nel manoscritto presentato qui.
Un'altra importante differenza tra il protocollo qui presentato e il protocollo di Hung et al. È la lunghezza del segmento bloccato (e quindi infetto). Mentre il protocollo qui descritto consiglia una breve lunghezza (~ 3 mm), Hung et al. Consigliamo di infettare 20 mm del colon distale. La lunghezza del segmento più corta è stata scelta per ridurre il numeroDelle cripte ricombinate e quindi dei tumori che ne derivano. Poiché la maggioranza dei pazienti con CRC sporadico sviluppa un singolo tumore anziché tumori multipli, questa misura aumenta la rilevanza clinica del modello. Il tasso di formazione del tumore non sembra influenzato dalla ridotta superficie del colon infetto.
Le applicazioni future di questa tecnica includono tutti i protocolli che richiedono cre-ricombinazione locale all'interno della mucosa del colon. La maggior parte delle applicazioni nella ricerca sul cancro includerà oncogeni condizionali, che portano alla formazione di tumori colorettali; Tuttavia, tutte le altre applicazioni, come l'innesco di costruttori reporter all'interno della mucosa del colon, possono essere raggiunti anche con il protocollo qui presentato.
In conclusione, la combinazione qui presentata di un modello di topi geneticamente modificato altamente sofisticato del cancro del colon-retto con l'opzione di colonscopia ad alta risoluzione per la rilevazione e la sorveglianza dei tumori in via di sviluppo fornisconoÈ un ottimo ambiente per studiare la biologia e il trattamento del CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è dedicato alla memoria del professor Moritz Koch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F.
