Summary
描述了一系列基本方法来研究养殖在水族箱中的鱼类的生殖生态。这些是使用SCUBA收集鱼类，运送活鱼以及观察保持在水族箱中的野生捕捞鱼的繁殖行为的有用方案。
Abstract
当持续的实地调查是不可能的时候，养殖观察对于揭示鱼行为和生态学方面是有价值的。在这里，描述了一系列基本技术，以便观察野生捕获的小型鱼的生殖行为，作为模型，保存在水族箱中。该方法着重于三个步骤：收集，运输和观察底物spavner的生殖生态学。活鱼收集和运输的基本方面是（1）防止对鱼的伤害，（2）仔细适应水族馆。收集活鱼时，预防伤害如划痕或突然变化的水压是必不可少的，因为任何物理伤害可能会对鱼的生存和后期行为产生负面影响。仔细适应水族箱可降低发病死亡率，减轻运输冲击。饲养期间的观察包括（1）识别个人双鱼和（2）监测产卵，对鱼或鸡蛋没有负面影响，从而对研究种的生殖生态进行详细的调查。皮下注射可见植入弹性体（VIE）标签是用于随后鉴定个体鱼的精确方法，并且可以与大范围的鱼一起使用，对其生存和行为影响最小。如果研究物种是沉积粘蛋的底物，那么由聚氯乙烯（PVC）管道构建的人造巢场，加上可拆卸的防水片将有助于计数和监测鸡蛋，减少调查人员对巢穴的影响和鱼的保卫行为。虽然这种基本方法需要在研究文章中很少提及的技术，但它们是进行需要养殖野生鱼类的实验的基础。
Introduction
鱼类的形态学，生态学和行为学表现出明显的自适应进化1 。特别是与生殖相关的生态特征特别多样，其中大部分可以直接受个人健身的影响2 。为了深入了解导致不同鱼类独特特征演变的选择性压力，使用活鱼直接观察生殖和社会行为通常有助于证实理论假设。
然而，对鱼类的连续现场观察可能需要专门的难以维护的水下设备和设施。在这些情况下，野生捕捞的水族馆饲养的鱼的观察是有帮助3，4，5。此外，鱼类行为的有效观察，其他罕见或困难ULT在自然条件下，观察可以通过在水族箱6，7，8操纵实验成为可能。通过最大程度地减少人为压力和身体伤害，在良好条件下养鱼是准确生态调查的关键。
侏儒虾青y素总长 23-25毫米，分布在西太平洋，安静，庇护的海湾，深度9-26米9 。在这项工作中， T. marinae被用作一个模型，用于描述使用独立的水下呼吸器（SCUBA），鱼类运输和最终驯化鱼类进行直接观察的鱼类收集系列的基本技术的研究物种的生殖行为和生态学。
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Protocol
收集和运送活鱼
注意：本协议描述了如何从具有深度≥15米的气囊收集具有气囊的鱼。快速输送到表面会导致气囊膨胀，压力变化会严重危害或杀死鱼类。谨慎是必要的，因为在第一步中对鱼类造成的损害将对其生存和后期行为产生不利影响。
- 在与SCUBA潜水之前，请收集以下材料：适合捕获水下目标物种的手网;双重聚乙烯袋，足够大的鱼;橡胶带（ø80 mm x 6 mm）;用于在表面充气收集袋的氧气瓶;作为抗微生物剂的Elbagin包含10％的硝基苯乙烯钠;聚苯乙烯泡沫箱，其中放置收集袋;移液管;并且如有必要（参见步骤1.4），长度为的绳子相当于最大潜水深度，以及至少2公斤的重量。
- 潜水时用手网收集目标鱼类;同时仍然在水下，将捕获的鱼放在聚乙烯袋中，并用橡皮筋绑扎袋子的口。如果将鱼运送到水族馆需要≥1天的时间，还可以从其他袋子中的自然栖息地中保存水，以用于更新养鱼用水。
注意：为了安全起见，水下任务必须由至少两个人进行。 - 以不超过1米/分钟的速度从收集点收集鱼的表面：在10米或更深的深度处，每2米停止上升1 - 5分钟;并从10米的深度到每1米的表面停止1 - 5分钟。当捕获的鱼不能保持其在袋中的浮力（ 即 ，如果它们在膨胀的气体膀胱浮起来的同时仍然试图向底部游泳时），或者保持相同的深度1-5分钟或de更深一点到2米。一旦鱼似乎恢复了浮力，恢复上升到地面。
注意：如果SCUBA罐中的空气有可能在上升时耗尽，则将绳索固定在聚乙烯袋上，并附加≥2kg的重量;在水下操作者安全上升之后，以与上述相同的速度将其拉到表面。 - 在海滩或船上，表面处理后，每个聚乙烯袋的水中溶解10 ppm的Elbagin。
注意：虽然一些鱼可能在被带到地面之后可能无法保持其浮力，但大多数鱼可能会在一天之内恢复。 - 如果收集袋中的鱼的密度很高，则可以在多袋之间划分鱼，以防止在运输过程中彼此相互碰撞而彼此相互损害。如果鱼是侵略性物种，请将它们分开包裹。
- 使用氧气充气收集袋，并再次使用r密封袋的口ubberbands。当将氧气引入袋中时，将喷嘴降低到袋子的水中以增加溶解氧含量;完全膨胀的袋子应该是1/4满水。
- 将收集袋放在聚苯乙烯泡沫箱中，以保持水温稳定，并在黑暗条件下降低鱼的压力。
- 如果将鱼运送到水族馆需要≥1天的时间，每天一次可以在每个养鱼袋中换入1/4至1/3的水分，使用从栖息地保留的水加入10 ppm Elbagin ，并用氧气重新包装。每天用手网或移液管清除底部的死鱼和排泄物。
注意：如果涉及飞机运输，在运输之前等待至少1天将鱼适应到表面的空气压力，因为在短期内两步压力变化（从水下到地面，表面到上部空气）可能会产生负面影响鱼的生存。 我>
将鱼适应水族馆
- 将含有鱼的袋子在水族箱中漂浮30分钟以平衡水温。
- 在10分钟的时间内，用水族箱水逐渐更换袋子水，以避免水分化学（ 例如 ，pH，盐度）突然变化引起的冲击。
注意：由于水分化学差异太大而引起震惊的鱼可能会显示身体颜色和/或行为的异常变化。适应期间仔细监测。 - 将10 ppm Elbagin溶解在水族馆水中。
- 此后，每天一次，持续3天，更新1/3的水族馆水，将10ppm的Elbagin添加到更换的水中。
- 最后，通过一天一次交换一半的水族馆水，直到颜色消失，开始消除Elbagin。
3.注射可见植入弹性体（VIE）标签以识别个体鱼
T“>注：在这项工作中，个别鱼使用VIE标签标识;对于示例，请参阅弗雷德里克·10，奥尔森和Vøllestad11，和勒布朗和诺克斯12此外，如果研究的物种是足够大的手握住，步骤3.2中使用的手术台将不是必需的。- 确定每个人的注射位置和标签颜色。最安全的选择是在身体的厚背部或尾部部位选择一个注射点，并避免将其注射到可能刺穿内部器官的腹部。
注意： 图1中描述了编号系统：如果研究物种足够大以注入8个可能的位置，则该系统将允许使用单一颜色识别154个个体。 VIE标签的十种颜色可商购。根据鱼的身体颜色选择可区分的颜色。 - <强>对于小于可以握在手中的鱼，准备如下的外科手术台（也参见Kinkel 等人 13 ）（ 图2 ）。
- 切出5厘米长×5厘米宽的软海绵，比培养皿的高度至少低5-10毫米。
- 在大约5 - 10 mm深度的海绵上切割一个凹槽，并将其宽度调整为鱼的近似身体宽度。将聚氯乙烯（PVC）板（0.3mm厚）切割成5cm×1.5cm宽，并将其弯曲成谷形折叠（或M形）。
- 将开槽的PVC板放在开槽的海绵上，然后将海绵放入培养皿（ø160 mm，30 mm深）。使用回收罐的水填充培养皿，直到PVC板充分浸泡。
- 根据VIE标签手册准备VIE标签。混合弹性体材料，并将混合物加入到3-mL syri中配备29号针头，包含在套件中。
- 在执行标签注射时准备使用两个水箱：一个用于麻醉，一个用于恢复;调整这些的温度和盐度浓度以匹配饲养水族馆的水。使用带有空气石头的空气泵将回水罐中的水温和循环。
- 通过将2-甲基喹啉与等体积的99.5％乙醇混合来制备麻醉液;将其加入麻醉罐中以达到18ppm的浓度。
注意：麻醉液的最佳浓度将取决于个体的物种和体型。因此，提前检查研究物种的最佳浓度。 - 将各个鱼转移到麻醉池，让它们变得麻醉：就是说，当鱼缸外面被点击时，等待鱼不会被触动或水的振动反应。当身体颜色在麻醉时变化在许多鱼中，也仔细监测身体颜色，并判断鱼是否从其变化中麻醉。因为鱼有可能跳出麻醉罐，使用透明的亚克力板覆盖，至少直到鱼开始缓慢移动。
注意：根据研究种类及其体型，微调麻醉和/或调整麻醉液浓度所需的时间。如果手术运动被麻醉所阻止，那么鱼会死亡的风险很高。 - 如果身体变暖，鱼就会变弱，麻醉鱼时，手指会保持在比较冷的水中。
- 从麻醉坦克提起鱼，并快速测量或记录必要的数据（总长度，性别等 ）。如果鱼在测量过程中似乎恢复，请立即将其转移回麻醉池。
- 将鱼转移到手术台。将鱼腹侧放在t中他的PVC槽。如果体型非常小，则在注射时使用双目显微镜。如果研究种类足够大，可以握在手中，则在被保持时注入VIE标签。
- 将针的斜面朝向外部并指向鱼头。皮下注射针，或多或少地平行于身体，并尽可能靠近皮肤下方。根据鱼体尺寸和最终看到标签的容易程度调整插入深度。
- 在取针时注入VIE标签，并在针斜度到达针入口点之前停止注射（如果在相对较宽的区域注入标签，将很容易辨别）。
- 完成标签注射后，立即将鱼转移到回收罐。如果恢复看起来太慢，用手轻轻地循环水。
- 恢复后，将鱼返回饲养水族馆，并继续添加10 ppm Elbagin到水中3天。
注意：在VIE标签的低可见度条件下，UVA滤光灯将有助于识别标签。
4.计数脱胶胶鸡蛋
- 为了创建一个人造卵巢，鱼可以将粘合蛋沉积，将不透明的PVC管（ø5厘米，6厘米长）切成两半，垂直于直径。
注意：上述管道尺寸适用于产卵相对较小的虫虫T. marinae 。因此，调整适合研究种类的PVC管尺寸和形状。 - 在防水片上打印5 mm x 5 mm格栅，并将其切割成适合PVC管道的内部区域。
- 使用橡皮筋将防水片固定在PVC管的内部。
注意：如果女性难以在防水片上附上鸡蛋，并且鸡蛋从纸张上落下，则使纸张用砂纸进行纹理化。 - 用一层沙子覆盖水族馆底部，1- 厚2厘米。将大约三分之一的PVC管倾斜地插入砂中，将板材固定侧向下。
- 鱼成功产卵后，从PVC管中取出蛋块，将其放入带有水族馆水的培养皿中。将一张新的纸张固定在PVC管内，并将其放回水族箱的底部。最后，通过拍摄鸡蛋块来计数鸡蛋。
- 或者，如果在产卵后进行亲子蛋保育的观察，小心不要将鸡蛋从水中取出。相反，使用培养皿与水族馆水一起舀起鸡蛋和床单，快速拍摄鸡蛋质量，然后仔细地将鸡蛋块重新吸收到同一个PVC管中，然后将其全部恢复到原来的位置水族箱底部。最后，使用图片计数鸡蛋。
- 使用ImageJ计数鸡蛋（ 图3
- 否则，如果鸡蛋密集沉积，则通过计算面积密度比估计蛋数：打印5×5 mm 2网格中的鸡蛋计算鸡蛋密度，用ImageJ测量鸡蛋覆盖的表面积，并估算每单位和表面积以上密度的鸡蛋总数。以下解释了ImageJ的上述表面积测量方法：Set scale ...（Research Services Branch，https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html）;它解释了如何定义图像的空间尺度;使用ImageJ测量表面积（Keene州立大学，学术技术，https://dept.keene.edu/at/2011/04/15/by-matthew-ragan/）。
注意：如果鸡蛋是透明的，黑色防水片更适合自动计数方法，因为ImageJ可以单独识别鸡蛋的轮廓。
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Representative Results
按照上述方法，分别于2014年4月，2015年和2016年在日本鹿儿岛县Am美大岛境外收集了41，15和96个海棠的个体（ 表1 ）。在每种情况下，25（61％），14（93％）和91（95％）个人住在直到在水族馆里存放鸡蛋。福田等人报道3 ，在2014年观察期结束前只有一只鱼死亡，鱼类产卵否则在捕获后7天开始出现，表明个体在良好条件下饲养。
VIE标签是可见的，并允许识别个体，即使在这种小型鱼类中（ 图4A ， 4B ）。沉积在防水片上的鸡蛋的照片如图4C所示，证明了这一点它们足够可见，被视为不可数。取出并拍照后，将纸张返回到水族馆的原处，并且嵌套的男性立即继续进行父亲关怀（ 图4D ）。
这些技术在一起可以用于实验，旨在记录所有个体鱼类的社会互动和生殖成功。具体来说，福田等人 3使用上述方法研究了水牛座中马铃薯的生殖生态。结果表明，女性生殖力与女性体型呈正相关（ 图5 ），而不同大小男性的生殖成功率则无差异（ 图6 ）。而且， 海棠倾向于建立连续的生殖对，大多数产卵发生在这些对对（ 表2 ）。观察到只有雄性的海棠可以进行父母的蛋保育。个人之间的积极互动表明，一夫一妻制交配系统可能主要由女性伴侣保护而产生。
| 收集日 | 收集深度 | 收集方法 | 收集个人数 | 保持持续时间 | 运输当天 | 死亡人数 | 存活率 | ||
| 堆焊 | 运输 | 驯化 | |||||||
| 15 April 2014 | - 21米 | 表面用鱼直到表面。 | 41 | 过夜 | 2014年4月16日 | 16 | 0 | 0 | 61％ |
| 2015年4月23日 | - 19米 | 表面用鱼直到12米深，用绳索拉直至表面。 | 15 | 1天 | 2015年4月25日 | 1 | 0 | 0 | 93％ |
| 2016年4月26日 | - 21米 | 表面用鱼直到15米深，用绳索拉直至表面。 | 96 | 1天 | 2016年4月28日 | 4 | 1 | 0 | 95％ |
表1：收集条件和鱼类生存率。死亡人数表示何时以及有多少个鱼死亡。
表2：饲养实验期间产卵对。 男 ，个人身份（ID）男性; F ，女性ID 下划线的ID ，一个产卵的女性; ID ，一个与男性交配的女性，虽然他们没有建立连续的对。这些结果表明， 马尾藻倾向于建立连续生殖对作为一夫一妻制交配系统的一部分。这张表已经从福田等人修改了3 请点击这里下载此表。
图1： VIE标签位置的布置。 （ A ）每个数字显示number对应于注射位置。通过匹配标签的位置来确定单个鱼的身份号码。 （ B ）第93号鱼的例子。
图2： 说明手术台的视图。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3： 使用ImageJ的手动和自动蛋计数。 （ A ）使用Cell Counter插件进行手动计数。这个插件可以计数一些细分的蛋。这是蛋的例子s分为四组进行计数。 （ B ）自动蛋计数。 （ C ）合并自动蛋计数图像和原始图片的图像。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4： 使用VIE标签 注射 水母的 代表性个体识别 ，并使用防水片计数存放在人工产卵 场上的 蛋。 （ A ）由粉红色VIE标签识别的个人1号; 白色箭头表示注入的VIE标签。 （ B ）由两个绿色VIE标签识别的第11号个人; 白色箭头表示注入VIE标签。 （ C ）在防水片上产卵。 （ D ）鸡蛋复盖后，男性恢复了父母的照顾，拍下照片，然后放回水族馆。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5. 离合器尺寸与女性身材尺寸（总长度）之间的 关系 。使用广义线性混合效应模型获得每个大小的女性群体的实曲线 ，估计生殖力。这些结果表明，女性生殖成功率随体重增加而增加（Pearson相关系数r = 0.56， P <0.05， n = 1 6）。这个数字已经从福田等人修改了3 请点击此处查看此图的较大版本。
图6. 预测交配成功与男性体型（总长度）之间的 关系 。每个数据项目根据男性的繁殖频率和估计的女性繁殖力估算。这些结果表明，无论身体大小如何，雄性都是繁殖成功的（Pearson相关性， r =˗0.51， P > 0.05， n = 8）。这个数字已经从福田等人修改了3_upload / 55964 / 55964fig6large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
许多鱼类的生殖生态常常通过实验饲养来揭示。特别是，变性6，8，14，择偶15,16和种内竞争7,17一直使用水族馆保持鱼类详细调查的频繁的话题。此外，在水族箱观察到一些结果已经在后面的字段8，18证实。这些结果支持水产养殖中野生捕捞鱼饲养实验的效用和可信度。此外，通过饲养实验来模拟可能自然发生但在野生条件下很少发生的情况的操作是值得的，作为大规模现场调查的初步阶段。
亲tocol描述了适用于沉积粘合蛋的小尺寸底物spawner的方法。鱼类保养鱼类的最佳条件可能会有很大变化，因此需要对协议的某些点进行调整。特别是，在对特定研究物种进行初步评估后，应考虑议定书的五点进行调整：（1）在方案1.4中花费的时间; （2）在注射VIE标签之前麻醉液的浓度和麻醉时间分别为3.1.3和3.1.5; （3）将VIE标签注入鱼类时的针头插入深度，方案3.1.8; （4）用作人造巢场的PVC管的尺寸和形式，方案3.2.1;和（5）使用三个蛋计数方法，方案4.6：手动计数（准确但需要时间和精力），自动计数和面密密度比估计（高效但粗糙）。当时鸡蛋很少，或者当需要通过某些细分进行计数（如死亡或活着，基于发育阶段的分类等）时，推荐使用手动计数方法。当有大量鸡蛋时，ImageJ可以分别分辨每个鸡蛋，自动计数方法可能是合适的。面积密度比估计是有效的，当有很多，密集的鸡蛋和ImageJ不能区分每个鸡蛋单独。
许多鱼类在被带到地面之后可能不会完全保持其浮力。然而，根据本协议的仔细表面处理可能允许大多数鱼在一天之内恢复。如果发现鱼在堆放后立即在收集袋中上下颠倒，等待至少一天之前鱼是否死亡，然后再取出。如果鱼被带到地面后不久就会死亡，或者如果需要一天以上的时间才能恢复，表面会变得更慢或延伸在随后的收集过程中的表面处理时间间隔。
除了VIE标签，还有其他方法来识别各种鱼类：彩色外部塑料拖缆，尼龙锚定标签，翅片夹和无源集成应答器（PIT）标签等 。然而，特别是在收集小鱼时，其中一些技术可能会增加死亡率，阻碍生长，或不能在原位可见。 10此外，如最外部变量从鱼本体突出，标签可以限制物种的一些行为，居住打洞，窄裂缝或致密海藻床。相比之下，小鱼的许多研究发现，VIE标记对死亡率和生长10，11没有大的负面影响。 VIE标签也可以忽略不计地影响鱼的行为，因为皮下标签不会突出，但是鱼很小，使其成为特别适合的小型物种行为观察识别方法10 。根据此前的一些研究中，丙烯颜料也可以以同样的方式作为VIE标签19，20。
人工产卵巢通常用于调查产生底泥粘蛋的鱼的繁殖。以前的研究使用由不同种类的材料制成的人造巢，例如赤陶瓦屋顶瓦21 ，瓷砖22 ，壳23 ，PVC箱24 等 。这些人工产卵巢可能对许多基底产卵有用。这些研究表明，鱼类人造巢的可用性，如形状和/或尺寸，比其制作更重要。由于PVC管是容易获得和加工的材料，本文使用PVC管作为产卵巢。
通过圈养观察获得的生态信息的极限值应受到好评。不出意料的是，与物种的自然环境相比，养殖水族箱限制了水生栖息地的各种生态条件（ 例如 ，水的物理和化学特征，食物生态学，内部和内部特异性相互作用的机会，栖息地范围，和人口密度）。它可能导致个人展示与其自然不同的特定行为。因此，实地调查应补充饲养观察资料，为推测鱼类繁殖行为的适应性演变提供最佳背景。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
感谢S.Yokoyama协助收集鱼。我们也非常感谢瓦川村有关饲养方法的有用建议。本研究由日本科学促进会（KAKENHI）通过授予TS（24370006和16K07507）的资助
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hand net | Nisso | AQ-17 | Select for the target species size. |
| Polyethylene bag | San-U Fish Farm | 8194 | |
| Rubber band | ESCO Co. LTD. | 78-0420-64 | ø 80 mm x 6 mm |
| Oxygen cylinder | N/A | N/A | Oxgen cylinder for diving equipment suits. |
| Elbagin | Japan Pet Design Co. Ltd. | 75950 | Pafurazine F (provided from same company) is equivalent drug to Elbagin. |
| Polystyrene foam box | N/A | N/A | |
| Pipette | AS ONE | 1-8625-04 | |
| Rope | Mizukami Kinzoku Co. LTD. | 95301601 | |
| Weight | N/A | N/A | Weight for diving equipment suits. |
| Water tank | N/A | N/A | |
| Air pump | KOTOBUKI | 4972814 062115 | |
| Air stone | KOTOBUKI | 4972814 232204 | |
| 2-Methylquinoline | Wako | 170-00376 | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 057-00456 | |
| Visible implant elastomer tag kit | Northwest Marine Technology | N/A | http://www.nmt.us/products/vie/vie.shtml |
| Soft sponge | N/A | N/A | |
| PVC board | N/A | N/A | 0.3 mm thickness is easy to use. |
| Petri dish | N/A | N/A | A large one, such as ø 160 mm and 30 mm depth, is convenient for the injection of the VIE tag. |
| Transparent acrylic board | N/A | N/A | |
| UVA filtered light | N/A | N/A | |
| PVC pipe | N/A | N/A | ø 5 cm |
| Waterproof sheet | SOMAR Corp. | 3EKW03 | The film for the plain copier. |
| Sand | N/A | N/A | |
| Stereo microscope | N/A | N/A | |
| Camera | N/A | N/A |
References
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