Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.
Abstract
בהתחשב באופי מאוד לחיזוי ההתפתחות שלהם, העוברים תודרנית שימשו כמודל ללימודי של מורפוגנזה בצמחים. עם זאת, עוברים בשלב מוקדם של הצמח הבמה הם קטנים ומכילים כמה תאים, שהופך אותם קשה להתבונן ולנתח. שיטה מתואר כאן על אפיון הדפוס-צורה צמח העוברים תחת מיקרוסקופ באמצעות האורגניזם דגם תודרנית. בעקבות פינוי של טרי ovules באמצעות הפתרון של שותפה עסקית, יכול להיות שנצפו תא במספר של המורפולוגיה של העוברים ולאחר השלב ההתפתחותי שלהם יכול להיקבע על ידי התערבות דיפרנציאלית ניגודיות מיקרוסקופ באמצעות 100 X עדשה טבילה שמן. בנוסף, הביטוי של חלבונים ספציפיים סמן מתויג עם ירוק ניאון חלבון (GFP) נוטרה כדי להוסיף ביאורים תא מפרט זהות במהלך המתבנת העובר על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. לכן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לצפות דפוס-צורה פראי-סוג צמח עוברי ברמות תאית ומולקולרית, לאפיין את התפקיד של גנים ספציפיים בהמתבנת העובר על-ידי השוואת צורה דפוס העוברים בין פראי-סוג צמחים מוטנטים קטלניים העובר. לכן, השיטה ניתן לאפיין מופרה ב תודרנית.
Introduction
מופרה הוא האירוע המוקדם ביותר בהתפתחות הצמח גבוה יותר. טפסים העובר בוגר מ זיגוטה דרך חלוקת התא ובידול תחת בקרת גנטי קפדנית1,2. תודרנית העוברים הם מודל שימושי ללמוד את השליטה מורפוגנזה כי הרצף של חלוקות תאים במהלך מופרה עוקב אחר3,דפוס הצפויות4. אולם, העובר תודרנית המכיל מספר תאים אחד הוא קטן מדי כדי להיות שנצפו וניתח. בנוסף, המוטציה של גנים מסוימים יכולים לגרום העובר lethality5, המציינת את התפקיד של הגנים האלה ב מופרה. האפיון של דפוס-צורה מוטנטים קטלניים העובר מספק בסיס להבנת המנגנון המולקולרי לפיה גנים חיוניים לווסת את התפתחות העובר.
שיטה מפורטת מתואר כאן על האפיון של היווצרות העובר דפוס בצמח דגם תודרנית באמצעות התבוננות מיקרוסקופית ישירה. השיטה כוללת סיווג ביצית ואחריו התצפית מיקרוסקופיים של העובר. אפיון מוטנטים קטלניים העובר גם מתואר.
המורפולוגיה של עוברי בשלבים התפתחותיים שונים יכול להיקבע ישירות על ידי מיקרוסקופ באמצעות ovules זה נוקו עם שותפה עסקית של פתרון6,7. כזה ovules התערוכה של השבירה הגבוה במדד; לכן, זה ביצית ניקוי בשיטה הוא מועיל במיוחד דגימות שאינן יש להקפיד על ידי מיקרוסקופ ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית.
בנוסף, הגנים מבוטאים לתא מסוים או במספר מצומצם של תאים במהלך מופרה יכול לשמש סמנים לזיהוי תאי העובר. לכן, יכול להיות מבואר המפרט זהות תא במהלך מופרה על-ידי ניטור הביטוי של חלבונים מתויג GFP סמן באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. לעומת זאת, התבוננות למשמעות הביטוי גן פונקציונלי unknown -GFP פיוז'ן במהלך מופרה יכול מספקים קישור בין העובר המתבנת הביטוי של הגן הזה, להקל על זיהוי גנים חדשים הדרושים מופרה ב תודרנית.
השיטה המתוארת כאן יכול לשמש גם כדי לאפיין את פנוטיפ של מוטציה העובר-קטלני, וכדי לקבוע את ההשפעה של הגן המושפעים על מופרה ברמה התאית. יתר על כן, בשילוב עם השוואה של התבנית ביטוי של גנים סמן במהלך מופרה בין הצמחים פראי-סוג של מוטציה, השיטה ניתן תשואות רמזים אודות המנגנונים המולקולריים המעורבים מופרה8,9. אכן, השיטה היה מוחל על צמחים naa10 , התברר כי החלוקה לא נורמלי של hypophysis ב החשבונאי שעלול להיגרם שינוי בחלוקת אוקסין במהלך מופרה5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה יש שלושה חלקים: 1) התבוננות היווצרות תבנית בפראי-סוג תודרנית עוברי באמצעות מיקרוסקופ DIC; 2) אפיון של העובר דפוס היווצרות דרך התבוננות סמן ביטוי חלבון באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ; ו 3) קביעת התפקיד של גן מסוים ב מופרה (באמצעות המוטציה naa10 בתור דוגמה).
1. ביצית סליקה
- הכנת חומרים צמח
הערה: פרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה על איך לגדל צמחים בריאים; דרכים אחרות כדי לגדל צמחים בריאים גם לעבוד.- להוסיף זרעים 100 צינור 1.5 mL, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1.5% נתרן תת-כלורי (mix 15 מ"ל של 10% כלור עם 85 מ ל מים) כדי לחטא הזרעים במשך 5 דק ' היפוך ' ברכבת התחתית מספר פעמים כדי להבטיח כי הזרעים ואת הפתרון מעורבב היטב כדי לחטא את הזרעים משטח לחלוטין.
- לכפות את הזרעים לתחתית הצינור על ידי צנטריפוגה ב-30 s-g 1,200 x, להסיר את תגובת שיקוע, ולשטוף את הזרעים במים סטריליים ארבע פעמים על ספסל כדי להסיר שאריות נתרן תת-כלורי.
- להוסיף 4.4 g של Murashige ו- Skoog (MS) תערובת מלח הבזליים ו- 10 גר' סוכרוז 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. מערבבים את התערובת כדי להמיס את מלחי וסוכרוז. להתאים את פתרון ה-pH 5.8 עם 1 מ' KOH, להוסיף דור 3 של הסוכן ג'לי, כגון Phytagel, הפתרון MS-סוכרוז, לעקר את הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות להפוך MS בינוני.
- יוצקים 30 מ של המדיום MS לתוך תבשיל תרבות 12 ס מ כדי ליצור לוחות בינוני MS.
- מקם את הזרעים סטיריליים בצלחת MS. להעביר את הצלחת אל. התא צמיחה ולשמור את הצלחת בתנאים היום (22 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות האור, 18 ° C עבור 8 שעות בחושך) לאחר ריבוד זרע (3 ימים ב 4 ° C בחושך).
- לאחר 8 ימים של צמיחה, להעביר את הצמחים בקרקע (תערובת אדמה עשירות, ורמיקוליט ביחס של 1:1) מגש, מכסים את המגש עם מכסה לבן, שקוף 5 ימים למנוע אובדן מים, יש מספיק כדי להימנע ויטריפיקציה של הצמחים.
- הרם את המכסה המגש ולטפח את הצמחים בתוך תא ותא בתנאים יום ארוך (ראה 1.1.5). להדליק את האור בשעה 6 בבוקר לסירוגין בשעה 10 בערב. לאחר כ 20 ימים של גידול תא ותא, הצמחים פרחונית, המיוצר siliques.
- מארק פקעי עם חוט במיקום של הזרע עוקב אחרי ב התפרחת בשעה 8 בערב (אל תשתמש הראשון עד השלישי פקעי; siliques שנוצר מתוך אלה פרוח ניצנים בדרך כלל לפתח כמה זרעים מופלים, ואת זה עשוי לשנות את הפרופורציה של הנורמה כדי ovules לא תקין). הגדר תחילתו של האבקת להפרייה כמו ניצן מסומן נפתח פרח בשעה 8:00 בבוקר למחרת.
- הכנה של הפתרון של שותפה עסקית
- להוסיף 24 גר' קלוראל-הידרייט שפופרת 50-mL, לעטוף את הצינור לחלוטין עם רדיד אלומיניום (פתרונות של קלוראל-הידרייט אינם יציבים תחת אור).
- בשלב הבא, להוסיף 9 מ של מים הנדסה גנטית ו- 3 מ"ל של גליצרול הפתרון ומנערים את הצינור כדי להמיס את קלוראל-הידרייט. כדי להפוך את הפתרון של שותפה עסקית, תן את הצינור לעמוד במשך הלילה בטמפרטורת החדר לחסל בועות.
- סיווג והגליונות ביצית
- צרף פיסת סקוטש דו צדדי לשקופית זכוכית מיקרוסקופ. המקום של silique גדל במשך מספר ימים לאחר ההאבקה (DAP) על השקופית עם pseudoseptum בניצב למשטח; הרצוי זה יהיה קל. לפצל את carpels (דמויות 1A ו 1B).
- לפצל את carpels משני צידי pseudoseptum עם מחט מזרק ולצרף את carpels גזור שני לשקופית, כך ovules, silique גלויים תחת סטריאוסקופ (דמויות 1C וד' 1).
- לוותר על µL 70 בפתרון של שותפה עסקית על גבי השקופית זכוכית ולאחר מכן להרטיב את קצה זוג מלקחיים שקצהו בסדר עם הפתרון של שותפה עסקית על ידי טבילה. באמצעות את סטריאוסקופ, להזיז את ovules לתוך הפתרון של שותפה עסקית בשקופית עם הפינצטה לנקות את העוברים. להחיל את coverslip של השקופית בעדינות כדי למנוע יצירת בועות.
- לשים את השקופית סיים לתוך תיבת בחדר חשוך עבור h 2-12 (מפותח יותר ביצית הוא, יהיה צורך זמן רב יותר) בטמפרטורת החדר. יכול להיות שנצפו העוברים בשלב 2/4 תאים (1-2 DAP) ברמה המיקרוסקופית לאחר 2 h, בעוד העוברים בין octant לבין בשלבים המוקדמים הכדוריים (3 DAP) יכול להיות שנצפו לאחר 4 שעות. יכול להיות שנצפו עוברי בוגרים יותר (4-8 DAP) לאחר 12 שעות.
- לבחון את ovules שנוקה באמצעות הפונקציה DIC של מיקרוסקופ. לאתר את העוברים תחת שדה צריכת חשמל נמוכה (10 X) ולאחר מכן שנה לשדה ובעוצמת (100 X שמן טבילה עדשה) כדי לבחון את דפוס הסלולר של העוברים מפותחת.
- לבחון את העוברים בשלבים התפתחותיים שונים.
2. אפיון של העובר המתבנת וזהות התא באמצעות התבוננות סמן ביטוי חלבון
- הכנה של חומרים צמח
- שיבוט האמרגן וקידוד רצף של סמן גנטי או הורמון התגובה יסוד, ואז הפתיל זה עם חלבון פלואורסצנטי (כגון GFP); לאחר מכן, הכנס הבונה הווקטור בינארי (כגון pCambia1300). כאן, הרכיב התגובה אוקסין DR5 מוצג בדוגמה10.
- להציג את פלסמיד DR5-GFP שנוצר לתוך פראי-סוג הצמחים מאת Agrobacterium tumefaciens-מתווכת טרנספורמציה11. בחר את הצמחים T1 באמצעות MS צלחות בינוניות המכילים hygromycin (50 מ"ג/מ"ל של אמא ליקר, מדולל 1:1, 000). הצמחים הטרנסגניים התערוכה שורשים ארוכים וצור שני עלים רוזט לאחר 8 ימים של גידול בתנאים המתוארים 1.1.5.
- להעביר את הצמחים הטרנסגניים אדמה ולטפח אותם כמצוין 1.1.6 ו 1.1.7.
- לאסוף את הזרעים T2 הקווים T1 עצמאית. לזרוע את הזרעים על צלחות MS-hygromycin, בחר את הצמחים נושאת עותק אחד של ההכנסה DR5-GFP (היחס בין צמחים עמידים צמחים רגישים יהיו בערך 3:1) ולאחר להעביר אותם באדמה.
- לטפח את הצמחים T2 כמצוין 1.1.6 ו 1.1.7.
- לאסוף את הזרעים T3 הצמחים T2. לזרוע את הזרעים על צלחות MS-hygromycin, בחר את הצמחים הטרנסגניים homozygous (כל הצמחים מקו אחד תערוכת hygromycin ההתנגדות) ולאחר להעביר אותם באדמה.
- סמן את ניצני פרחים וצמחים T3 homozygous כפי שמעידה 1.1.8.
- GFP אות התצפית
- מערבבים 3 מ"ל של גליצרול עם 47 מ ל מים הנדסה גנטית כדי ליצור פתרון גליצרול 6%.
- צרף פיסת סקוטש דו צדדי לשקופית מיקרוסקופ זכוכית ולתקן silique כפי שמעידה 1.3.1.
- לפצל את carpels משני צידי pseudoseptum עם מחט מזרק, לצרף את carpels גזור שני השקופית תחת סטריאוסקופ כפי שמעידה 1.3.2.
- לוותר על 30 µL של 6% גליצרול אותן לשקופית זכוכית ומניחים כולן ovules מן carpels גזור לתוך הפתרון באמצעות פינצטה שקצהו פיין. במקום של coverslip על השקופית בעדינות.
- כמו המעיל הזרע ואת האנדוספרם של כל ביצית יכול למנוע את ההתבוננות GFP אותות של העובר, לחלץ את העובר להפרייה. הקש על השקופית במהירות ובעדינות כדי הבלטת העובר מתוך ביצית (מפותח יותר ביצית היא, הכוח פחות צריך להיות מוחל על השקופית).
- לבחון את השקופית עבור זריחה GFP באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. למצוא את העוברים מבודד תחת שדה צריכת חשמל נמוכה (10 X), להקליט את מיקומם ולאחר מכן לשנות שדה ובעוצמת (100 X שמן טבילה עדשה) כדי לצפות DR5-GFP ביטוי העוברים על-ידי הגדרת מקור האור עירור 488 ננומטר לגילוי של אות ה-GFP.
- לזהות את הביטוי GFP העוברים כדי לבחור את שורת T3 מתאימים לצורך ניתוח נוסף.
3. אפיון של העובר דפוס-צורה מוטציה קטלני העובר דרך סיווג ביצית והתבוננות החלבון הסמן: Naa10 כדוגמה
- העובר המתבנת בצמחים מוטציה naa10
- הכנת החומרים צמח כמצוין ב- 1.1.1-1.1.7.
- לזהות את naa10+ − צמחים על-ידי ה-PCR באמצעות גנים ספציפיים תחל5ולאחר מכן מארק פקעי של לאמילי10+ − צמחים כפי שמעידה 1.1.8.
- ביצית אישור לבצע בבדיקה מיקרוסקופית של לאמילי10+ − עוברי כמצוין ב- 1.2, 1.3.
- סמן חלבון ניתוח באמצעות naa10 עוברי
- להשיג מתאימים DR5-GFP הטרנסגניים קווים באמצעות ההליך שמתואר 2.1-2.2.
- לחצות קו homozygous DR5-GFP הטרנסגניים עם לאמילי10+ − המפעל להשיג לאמילי10/ − צמחים נמצאים homozygous של דה מרקר פלורסצנטיות GFP הדור F2 (המזוהה על ידי גנים ספציפיים PCR) כדי לאפיין naa10+ / −5 ולבחון את האות ה-GFP תחת מיקרוסקופ באמצעות קו DR5-GFP homozygous.
- לסמן את ניצני פרחים של לאמילי10+ − צמחים homozygous עבור DR5-GFP כפי שמעידה 2.1.7.
- לחפש האות ה-GFP ב עוברי naa10 כי הם homozygous על DR5-GFP כמצוין ב- 2.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה המתוארת במאמר זה יכול לשמש כדי להתבונן מופרה ישירות תחת מיקרוסקופ, ביאור המפרט את הזהות תא במהלך מופרה עם סמנים ספציפי לאפיין את התפקיד של גן מסוים במהלך מופרה.
נציג תוצאות הניתוח של העובר תכנים (החל משלב זיגוטה מוארך לבמה מקל ההליכה בוגרת) פראי-סוג תודרנית מוצגים באיור2. לאחר אישור ביצית, העוברים בשלבים התפתחותיים שונים יכולה להיות מאופיינת DIC מיקרוסקופ (איור 2). הדפוס הביטוי של DR5-GFP הוקלט במהלך מופרה תחת סריקת מיקרוסקופ (איור 3) לקבוע את ההתפלגות של אוקסין ב העובר ולבחון את התפקיד הפוטנציאלי של אוקסין במהלך מופרה ב תודרניתלייזר קונפוקלי.
פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לאפיין את התפקידים של גנים ספציפיים במהלך מופרה. . הנה, התפקיד של Naa10 במהלך מופרה ב תודרנית נבחנה כדוגמה. חריג חלוקת hypophysis נצפתה (אסקיו ואנכי חלוקת hypophysis ב Naa10 לעומת חלוקה סימטרית רוחבי של hypophysis בצמחים פראי-סוג, איור 4). ההתפלגות של אוקסין בשלב הכדוריים כמעט אחיד רוב העוברים Naa10 , נשמר אות רחבה יותר של hypophysis, לעומת העוברים פראי סוג (איור 5). תוצאות אלו מצביעות על Naa10 נדרש עבור מופרה, כי זה עשויים להיות מעורבים מופרה דרך אוקסין איתות ב תודרנית.
איור 1: תרשים סכמטי עבור ניתוח תודרנית Silique. (א) silique מצורף בשקופית זכוכית הודבק עם חתיכת דבק דו צדדי. (B) תמונה מוגדלת של תיבת בא שני הקווים הדמיוניים ייצג את המיקום לפיצול. (ג) תמונה מוגדלת של silique פיצול בתיבה ד (יח) הדימוי של silique פיצול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: בחינת מופרה בפראי-סוג (Col-0) תודרנית על ידי מיקרוסקופ DIC. (א) Elongated זיגוטה. שלב 1-תא (B) של העובר ב- 1 DAP. (ג) א 2/4 תאים בשלב העובר ב- 2 DAP. (ד) העובר בשלב octant ב-3 DAP. (E) A dermatogen עובר שלב ב- 3 DAP. DAP (נ) העובר הכדוריים בשלב מוקדם בגיל 4. (G) של העובר הכדוריים שלב מאוחר ב- 5 DAP. (ח) A לב העובר שלב ב- 6 DAP. (אני) העובר בשלב טורפדו-7 DAP. (J) מקל ההליכה בשלב העובר ב- 8 DAP. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הדפוס הביטוי של DR5 , העוברים תודרנית פראי-סוג (Col-0). ( - d) אותות ה-GFP. (י-ם) התמונות הממוזגות עם תמונות שדה בהיר. DR5 היה ביטוי הקוטב השורש של פראי-סוג שלב הכדוריים( וא, 4 DAP) ואת הלב הבמה (b ו- B, 6 DAP) העוברים. DR5 היה גם הביע את העצות cotyledon עובריים (c ו- C, 7 DAP), את להערכת העובר פראי-סוג בוגרת (d ו- D, 8 DAP). גודל ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אפיון התפקיד של Naa10 במהלך מופרה ב תודרנית. נורמלי חלוקת hypophysis של צמח פראי-סוג (A). חריג חלוקת hypophysis של צמחים מוטנטים Naa10 מסומן עם פס לבן (B) (אסקיו חלוקת hypophysis), (ג) (אנכי חלוקת hypophysis). גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: התבנית DR5 ביטוי הבמה הכדוריים פראי-סוג (Col-0) תודרנית ואת עוברי Naa10 . ( ו- b) GFP אותות. (A ו- B) התמונות הממוזגות עם תמונות שדה בהיר. DR5 היה ביטוי הקוטב השורש של העובר בשלב הכדוריים פראי-סוג ( ו- A). DR5 בא לידי כמעט אחיד העובר Naa10 הבמה הכדוריים, שמרו את האות רחבה ב hypophysis לעומת הסוג הפרוע (b ו- B). גודל ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סיווג ביצית היא שיטה שימושית עבור חלוקת התאים ולהתאושש להערכת המורפולוגיה במהלך מופרה ב תודרנית; בעזרת טכניקה זו, העוברים יכול להיות שנצפו ישירות מתחת DIC מיקרוסקופ5,12. השלב הקריטי לאישור ביצית היא צעד 1.3.4. הזמן הנדרש לאישור ביצית בשלב 1.3.4 הוא משתנה. העוברים בשלב 2/4 תאים ניתן בבירור לראות לאחר 2 h בפתרון של שותפה עסקית, ואילו הם נראים לא ברור לאחר 12 שעות. לכן, מפותח יותר ביצית הוא, ככל הזמן הנדרש לאישור.
בשלב 2.2.5, לבודד את העובר מן ביצית, כמות כוח להחיל שקופית היא קריטית. עוברי יכול להימחץ אם מוחל בכוח; עם זאת, העובר לא יכול להיות extruded של ביצית אם שימוש בכוח קטן מדי. מניסיוננו, מפותח יותר ביצית, הכוח פחות נחוצה. טורפדו הבמה ואת עוברי בוגר יכול להיות מבודדים ישירות על-ידי פילינג הפתוחה ביצית באמצעות מחט מזרק. כמו חלק המתיחות תאים ייתכן ונהרס ב העובר מבודדת במהלך תהליך בידוד פלורסצנטיות האיתות המתיחות ייתכן שאבדו או לא שלם. הגבלה נוספת של שיטה זו הוא כי העוברים לפני השלב 4 תאים היו קשה למצוא מן העוברים עם הבלטה כפי שהן מחוברות על ידי ביצית פרגמנט וקטנים מדי.
שלב התפתחותי של מורפולוגיה של העובר יכול להיות מושפע המוטציה של גנים מסוימים; ניתן להדגים תופעות כאלה על ידי מיקרוסקופ בעקבות אישור ביצית. גישה זו יסייעו בהבנה של מנגנון מולקולרי על ידי התחלקות מופרה5אילו גנים ספציפיים. התבוננות למשמעות הביטוי גן פונקציונלי unknown -GFP פיוז'ן במהלך מופרה יכול לספק קישור בין המתבנת העובר את הביטוי של הגן הזה, וכדי להקל על זיהוי גנים חדשים הדרושים מופרה תודרנית13. לפיכך, פרוטוקול המתוארים כאן מספק שיטה בסיסית עבור אפיון מופרה ב תודרנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר ג ' סיקה Habashi על קריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים דוקטור שנג Xianyong של מרכז הדמיה, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת הון (בייג'ינג, סין), על ביצוע הלוקליזציה של DR5-GFP וזמינותו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של קרן המדע בייג'ינג הממשל העירוני (CIT & TCD20150102) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין וממנה (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
