Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att observera embryogenes i Arabidopsis via fröämnet clearance följt av inspektion av embryo mönster bildas under ett mikroskop.
Abstract
Mycket förutsägbar med tanke på deras utveckling, har Arabidopsis embryon använts som modell för studier av morfogenes i växter. Dock tidigt skede växt embryon är små och innehåller några celler, vilket gör dem svåra att observera och analysera. En metod är beskrivs här karaktärisera mönster bildas i växten embryon under ett Mikroskop med modell organismen Arabidopsis. Efter avslutande av färska fröämnen Hoyers lösning, cell nummer i och morfologi av embryon kunde observeras, och deras utvecklingsstadier kunde fastställas med hjälp av differentiell störningar kontrast mikroskopi med hjälp av en 100 X olja nedsänkning linsen. Dessutom var uttrycket av specifika proteiner taggade med grönt fluorescerande Protein (GFP) övervakas för att kommentera cellen identitet specifikation under embryo mallning av confocal microscopy för laserscanning. Således kan denna metod användas att observera mönster bildas i vildtyp växt embryon på cellulär och molekylär nivå, och att karaktärisera rollen av specifika gener i embryo mönster genom att jämföra mönster bildas i embryon från vilda växter och embryo-dödliga mutanter. Metoden kan därför användas för att karaktärisera embryogenes i Arabidopsis.
Introduction
Embryogenes är den tidigaste händelsen i högre växt utveckling. En mogen embryo former från en zygot genom celldelning och celldifferentiering enligt strikt genetisk kontroll1,2. Arabidopsis embryon är en användbar modell för att studera kontroll av morfogenes eftersom sekvensen av celldelningar under embryogenes följer en förväntade mönster3,4. Ett Arabidopsis embryo som innehåller en till flera celler är dock för liten för att observeras och analyseras. Mutationen av vissa gener kan dessutom orsaka embryo dödlighet5, som anger nyckelroll som dessa gener i embryogenes. Karakterisering av mönster bildas i embryo-dödliga mutanter ger en grund för att förstå den molekylära mekanism varigenom viktiga gener reglerar embryots utveckling.
En detaljerad metod beskrivs här för karakterisering av embryo mönster bildas i modell växten Arabidopsis av direkt mikroskopisk observation. Metoden innebär fröämnet clearance följt av mikroskopisk observation av ett embryo. Karakterisering av ett embryo lethal mutant beskrivs också.
Morfologi av embryon i olika utvecklingsstadier kan bestämmas direkt genom mikroskopi med de fröämnen som har rensats med Hoyers lösning6,7. Sådan fröämnen uppvisar en hög brytningsindex; Detta fröämnet clearing metod är således särskilt fördelaktiga för exemplar som ska följas av differentiell störningar kontrast (DIC) mikroskopi.
De gener som uttrycks i en viss cell eller ett begränsat antal celler under embryogenes kan dessutom användas som markörer för att identifiera cellerna i ett embryo. Därför kan specifikationen cell identitet under embryogenes förses genom att övervaka uttrycket av GFP-märkta markör proteiner med confocal microscopy för laserscanning. Omvänt, observerar uttrycksmönstret av en okänd funktionell gen -GFP fusion under embryogenes kan ge en länk mellan embryo mallning och uttryck av denna gen, och underlätta identifieringen av nya gener som krävs för embryogenes i Arabidopsis.
Den metod som beskrivs här kan också användas att karakterisera fenotypen av ett embryo lethal mutant, och att fastställa påverkan av drabbade genen på embryogenes på cellnivå. Dessutom i kombination med en jämförelse av det uttryck pattern av markörgener under embryogenes mellan vildtyp och muterade växter, kan metoden ge ledtrådar om molekylära mekanismer och signalvägar involverade i embryogenes8,9. Faktiskt, metoden tillämpades på naa10 växter, och det konstaterades att onormala uppdelningen av hypofysen i mutant kan orsakas av en förändring i auxin fördelningen under embryogenes5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detta protokoll har tre delar: 1) att observera mönster bildandet i vildtyp Arabidopsis embryon använder DIC mikroskopi; (2) kännetecknar embryo mönster bildas via observation av markör proteinuttryck med confocal laserscanning mikroskopi; och 3) att fastställa rollen av en specifik gen i embryogenes (med naa10 mutant som ett exempel).
1. fröämnet Clearing
- Plant material förberedelse
Obs: Det protokoll som beskrivs här är ett exempel på hur man odlar friska växter; andra sätt att växa friska växter fungerar också.- Lägga till 100 frön i en 1,5 mL tub, och tillsätt därefter 1 mL 1,5% natriumhypoklorit (mix 15 mL 10% klor med 85 mL vatten) för att sterilisera frön för 5 min. Vänd röret flera gånger så att frön och lösning är väl blandade att sterilisera ytan frön helt.
- Tvinga frön till botten av röret genom centrifugering för 30 s vid 1200 x g, avlägsna supernatanten och tvätta fröna med sterilt vatten fyra gånger vid en bänk bort de kvarvarande natriumhypoklorit.
- Lägga till 4,4 g Murashige och Skoog (MS) basala salt blandning och 10 g sackaros 1 L ultrarent vatten. Rör blandningen för att upplösa de salter och sackaros. Justera lösningen till pH 5.8 med 1 M KOH, tillsätt 3 g geleringsmedel, såsom Phytagel, till den MS-sackaroslösning och sterilisera lösningen vid 121 ° C i 15 min att göra MS medium.
- Häll en 12 cm kultur maträtt att generera MS medellång plattor 30 mL av MS medium.
- Placera steriliserade frön på MS plattan. Överföra plattan till en tillväxt kammare och hålla plattan under lång-dag förhållanden (22 ° C i 16 h i ljuset och 18 ° C i 8 h i mörkret) efter utsäde stratifiering (3 dagar vid 4 ° C i mörker).
- Efter 8 dagars tillväxt, överföra växterna till jord (mix näringsrika jord och vermikulit i förhållandet 1:1) i ett fack, täcka facket med vit, transparent lock i 5 dagar för att undvika vattenförlust och lämnar en lucka för att undvika förglasning av växterna.
- Ta av locket från facket och odla växterna i en walk-in kammare under lång-dag förhållanden (se 1.1.5). Tänd ljuset vid 06:00 och off kl 10:00. Efter ca 20 dagar av tillväxt i walk-in kammaren, har växterna blommat och producerade siliques.
- Markera blomknoppar med en tråd vid position av utsäde stjälkar i blomställningen kl 8:00 pm (Använd inte först till den tredje blomknoppar; de siliques som genereras från dessa blomknoppar brukar utveckla några avbrutna frön, och detta kan förändra andelen normalt att onormala fröämnen). Definiera början av pollinering av ägget som när den Markera knoppen öppnar blomma kl 8:00 nästa morgon.
- Beredning av Hoyers lösning
- Tillsätt 24 g chloral hydrat till en 50 mL tub och Linda röret helt med aluminiumfolie (lösningar av chloral hydrat inte är stabil under ljus).
- Därefter lägga till 9 mL ultrarent vatten och 3 mL glycerol i ovanstående lösning och skaka tuben för att upplösa chloral hydrat. Att göra Hoyers lösning, låt röret stå över natten i rumstemperatur att eliminera alla bubblor.
- Fröämnet separation och clearance
- Fäst en bit dubbelhäftande tejp på ett objektglas av glas. Placera en skida som odlas för önskat antal dagar efter pollinering (DAP) i bilden med pseudoseptum vinkelrätt mot ytan. Detta gör det enkelt att dela upp fruktblad (figurerna 1A och 1B).
- Dela fruktblad på båda sidor om pseudoseptum med en sprutans nål och fäst de två dissekerade fruktblad bilden så att fröämnen i skida är synliga under ett stereoskop (siffrorna 1 c och 1 D).
- Dispensera 70 µL av Hoyers lösning in i glas-bilden och sedan Fukta spetsen på ett par spetsig pincett med Hoyers lösning genom att doppa. Använder stereoskop, flytta fröämnen till den Hoyers lösning på bilden med pincetten att rengöra embryon. Lägg på ett täckglas till bild försiktigt för att undvika att eventuella bubblor.
- Placera den färdiga bilden till en ruta i ett mörkt rum för 2-12 h (ju mer mogen en fröämnet är, desto mer tid kommer att behövas) vid rumstemperatur. Embryon i 2/4-cellstadie (1-2 DAP) kan observeras microscopically efter 2 h, medan embryon mellan Oktanten och globulära tidigt (3 DAP) kan observeras efter 4 h. Mer mogen embryon (4-8 DAP) kan observeras efter 12 h.
- Undersöka de rensade fröämnen DIC funktionen av ett mikroskop. Leta upp embryon under en lågenergi-fältet (10 X) och sedan ändra till en högeffekts fält (100 X olja nedsänkning lins) att observera cellulära mönstret i utvecklade embryon.
- Undersöka embryona i olika utvecklingsstadier.
2. karakterisering av Embryo mallning och Cell identitet via Observation av markör proteinuttryck
- Beredning av växtmaterial
- Klona arrangören och kodande sekvens av elementet markör gen eller hormon svar och sedan säkring det med ett fluorescerande protein (till exempel GFP); Nästa, infoga konstruktionen i binärt vektorn (t.ex. pCambia1300). Elementet auxin svar presenteras här, DR5 som ett exempel10.
- Införa den resulterande DR5-GFP -plasmiden i de vilda växterna av Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation11. Välj T1 växterna använder MS medellång plåtar som innehåller hygromycin (50 mg/mL av mor sprit, utspädd 1:1, 000). Transgena växter kommer uppvisar långa rötter och generera två rosetter blad efter 8 dagars tillväxt under de förhållanden som beskrivs i 1.1.5.
- Överföra de transgena växterna till marken och odlar dem som anges i 1.1.6 och 1.1.7.
- Samla in T2 frön från de oberoende T1-linjerna. Så frön på MS-hygromycin tallrikar, Välj de växter som bär en kopia av DR5-GFP insättningspunkten (förhållandet mellan resistenta växter till känsliga växter blir ungefär 3:1) och överföra dem till jord.
- Odla växterna T2 som anges i 1.1.6 och 1.1.7.
- Samla in T3 frön från T2 växterna. Så frön på MS-hygromycin tallrikar, Välj de homozygota transgena växter (alla växter från en enda rad ställer ut hygromycin motstånd) och överföra dem till jord.
- Markera blomknoppar av homozygot T3 växter som anges i punkt 1.1.8.
- GFP signal observation
- Blanda 3 mL glycerol med 47 mL ultrarent vatten för att generera en 6% glycerol lösning.
- Bifoga en bit dubbelhäftande tejp till ett glas objektglas och fixa en skida som anges i 1.3.1.
- Dela fruktblad på båda sidor om pseudoseptum med en sprutans nål och fäst de två dissekerade fruktblad i bilden under ett stereoskop som anges i 1.3.2.
- Dispensera 30 µL 6% glycerol in i glas bilden och placera alla fröämnen från de dissekerade fruktblad i lösningen med spetsig pincett. Placera ett täckglas på bilden försiktigt.
- Som den utsäde coat och frövitan i varje fröämnet kan förhindra observationen av GFP signaler i embryot, extrahera embryot från ägget. Tryck på bilden snabbt och skonsamt att extrudera embryot från ägget (ju mer mogen en fröämnet är den mindre kraften appliceras på bilden).
- Granska bilden för god Jordbrukarsed fluorescens med confocal microscopy för laserscanning. Hitta de isolera embryona under en lågenergi-fältet (10 X) och registrera deras läge, sedan ändra till en högeffekts fält (100 X olja nedsänkning lins) att observera DR5-GFP uttryck i embryon genom att ange excitation ljuskällan till 488 nm för detektion av GFP signalen.
- Upptäcka GFP uttrycket i embryon att välja lämplig T3 linjen för vidare analys.
3. karakterisering av Embryo mönster bildas i ett Embryo lethal Mutant via fröämnet Clearance och markör Protein Observation: Naa10 som exempel
- Embryo mönstring i naa10 muterade växter
- Förbered växtmaterial som anges i 1.1.1-1.1.7.
- Identifiera den naa10+/ − växter med PCR med gen-specifika primers5och sedan markera blomknoppar av den naa10+/ − växter som anges i punkt 1.1.8.
- Utföra fröämnet clearance och mikroskopisk undersökning av naa10+/ − embryon som anges i 1.2 och 1.3.
- Markör proteinanalys naa10 embryon
- Erhålla lämplig DR5-GFP transgena linjerna med hjälp av proceduren som beskrivs i 2.1-2.2.
- Korsa en homozygot DR5-GFP transgena linje med en naa10+/ − växt att erhålla naa10+/ − växter som är homozygota för god Jordbrukarsed fluorescens markören på den F2-generationen (identifieras av gen-specifika PCR) att karakterisera naa10+/ −5 och iaktta god Jordbrukarsed signalen under ett Mikroskop med en homozygot DR5-GFP -linje.
- Markera blomknoppar av naa10+/ − växter som är homozygota för DR5-GFP som anges i 2.1.7.
- Sök efter GFP signal i naa10 embryon som är homozygota för DR5-GFP som anges i 2.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metod som beskrivs i detta dokument kan användas för att följa embryogenes direkt i Mikroskop, kommentera specifikationen cell identitet under embryogenes med specifika markörer och karaktärisera rollen av en särskild gen under embryogenes.
Representativa resultat från analysen av embryo mönstring (från långsträckt zygot scenen till mogen käpp scenen) i den vildtyp Arabidopsis visas i figur 2. Efter fröämnet clearance, kan embryon i olika utvecklingsstadier särskiljas genom DIC mikroskopi (figur 2). Det uttryck pattern av DR5-GFP spelades in under embryogenes under confocal microscopy (figur 3) för att bestämma fördelningen av auxin i embryot och undersöka den potentiella rollen som auxin under embryogenes i Arabidopsisför laserscanning.
Detta protokoll kan också användas för att karaktärisera rollerna för specifika gener under embryogenes. Här, undersöktes Naa10 roll under embryogenes i Arabidopsis som ett exempel. Onormal uppdelning av hypofysen observerades (askew och vertikal uppdelning av hypofysen i Naa10 jämfört med tvärgående asymmetrisk fördelning av hypofysen i vilda växter, figur 4). Fördelningen av auxin i klotformiga skede var nästan enhetlig i de flesta Naa10 embryon och behöll en bredare signal i hypofysen, jämfört med vildtyp embryon (figur 5). Dessa resultat indikerar att Naa10 krävs för embryogenes, och att det kan vara inblandade i embryogenes via den auxin signalering utbildningsavsnitt i Arabidopsis.
Figur 1: Schematisk bild för dissektion av Arabidopsis skida. (A) den skida som bifogas i glas bilden var klistras in med en bit dubbelhäftande tejp. (B) den förstorade bilden i rutan i A. De två imaginära linjerna representerade platsen delas. (C) den förstorade bilden av den split skida i rutan i D. (D), bilden av den split skida. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Undersökning av embryogenes i Wild-type (Col-0) Arabidopsis av DIC mikroskopi. (A) Elongated zygot. (B), en 1-cellstadie embryo på 1 DAP. (C), en 2/4-cellstadie embryo på 2 DAP. (D) ett Oktanten scenen embryo på 3 DAP. (E) A dermatogen skede embryo på 3 DAP. (F), embryots tidiga klotformiga scenen på 4 DAP. (G), A sen klotformiga scenen embryo på 5 DAP. (H) A hjärtat scenen embryo på 6 DAP. (jag) en torped scenen embryo på 7 DAP. (J) en käpp scenen embryo på 8 DAP. Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Uttrycksmönstret av DR5 i Wild-type (Col-0) Arabidopsis embryon. (en - d) GFP signaler. (A-D) Sammanslagna bilder med ljusa fält bilder. DR5 uttrycktes i den rot pol vildtyp klotformiga scenen (en och en, 4 DAP) och hjärtat scenen (b och B, 6 DAP) embryon. DR5 uttrycktes också i embryonala cotyledon tips (c och C, 7 DAP) och i vaskulatur mogen vildtyp embryon (d och D, 8 DAP). Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Karakterisering av Naa10 roll under embryogenes i Arabidopsis. Normal uppdelning av hypofysen i en vildtyp växt (A). Onormal uppdelning av hypofysen i Naa10 muterade växter markeras med en vit linje i (B), (askew uppdelning av hypofysen) och (C), (vertikal uppdelning av hypofysen). Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: DR5 uttrycksmönstret i klotformiga scenen vildtyp (Col-0) Arabidopsis och Naa10 embryon. (och b) GFP signaler. (A och B) Sammanslagna bilder med ljusa fält bilder. DR5 uttrycktes i den rot pol en vildtyp klotformiga scenen embryo (en och en). DR5 uttrycktes nästan jämnt i en klotformig scenen Naa10 embryo och behållit den breda signalen i hypophysis jämfört med den vilda typen (b och B). Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fröämnet clearance är en användbar metod för att upptäcka celldelning och utvärdera morfologi under embryogenes i Arabidopsis; med denna teknik, kan embryon observeras direkt under DIC mikroskopi5,12. Det kritiska steget för fröämnet clearance är steg 1.3.4. Den tid som krävs för fröämnet clearance i steg 1.3.4 är variabel. Embryon i 2/4-cellstadie kan tydligt observeras efter 2 h i den Hoyers lösning, medan de ser otydligt efter 12 h. Således, ju mer mogen en fröämnet är, ju längre den tid som krävs för clearance.
I steget 2.2.5 för att isolera ett embryo från en fröämnet, är mängden kraft som anbringas på bilden kritiska. Embryon kan krossas om alltför mycket kraft appliceras; dock kan inte ett embryo vara pressad från ägget om för lite kraft används. Vår erfarenhet, ju mer mogen en fröämnet är, den mindre kraften behövs. Torped scenen och mogen embryon kan isoleras direkt av peeling öppna en fröämnet använder en sprutans nål. Som några av suspensor celler kan förstöras i isolerade embryot under processen isolering, kan fluorescens signalen från suspensor vara förlorad eller ofullständig. En annan begränsning med denna metod är att embryon innan i 4-cellstadie var svårt att hitta från extruderad embryon som de är för liten och skärmade av fröämnet fragment.
De utvecklingsstadier och morfologi av ett embryo kan påverkas av mutationen av vissa gener; sådana effekter kan påvisas genom mikroskopi efter fröämnet clearance. Detta tillvägagångssätt kommer att hjälpa i överenskommelsen av den molekylära mekanismen av vilka specifika gener medla embryogenes5. Observerar uttrycksmönstret av en okänd funktionell gen -GFP fusion under embryogenes kan ge en länk mellan det embryo mönstringen och uttryck av denna gen, och underlätta identifieringen av nya gener som krävs för embryogenes i Arabidopsis13. Protokollet beskrivs här föreskrivs således en grundläggande metod för karakterisering av embryogenes i Arabidopsis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Jessica Habashi för att kritiskt läsa manuskriptet. Vi tackar Dr. Xianyong Sheng av Imaging Center, College of life Sciences, Capital Normal University (Beijing, Kina), för att utföra localizationen av DR5-GFP assay. Detta arbete stöds av bidrag från Beijing Municipal regeringen Science Foundation (CIT & TCD20150102) och från National Natural Science Foundation i Kina (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W.
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
