Summary
इस प्रोटोकॉल में Arabidopsis embryogenesis बीजांड निकासी एक खुर्दबीन के नीचे भ्रूण पैटर्न गठन के निरीक्षण के बाद के माध्यम से देख के लिए एक विधि की रूपरेखा।
Abstract
उनके विकास की अत्यधिक उम्मीद के मुताबिक प्रकृति को देखते हुए Arabidopsis भ्रूण एक मॉडल के रूप में पौधों में morphogenesis के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, प्रारंभिक चरण संयंत्र भ्रूण छोटे हैं और कुछ कक्षों, उन्हें निरीक्षण और विश्लेषण करने के लिए मुश्किल बना रही हैं। एक विधि यहाँ पैटर्न गठन मॉडल जीव Arabidopsisका उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे संयंत्र भ्रूण में निस्र्पक के लिए वर्णन किया गया है। निकासी ताजा बीजाणु के Hoyer के समाधान का उपयोग कर के, बाद में सेल नंबर और भ्रूण की आकारिकी मनाया जा सकता है, और उनके विकास के चरण एक 100 X तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कर अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जा सका। इसके अलावा, विशिष्ट मार्कर प्रोटीन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP साथ) टैग की अभिव्यक्ति सेल पहचान विनिर्देश भ्रूण patterning के दौरान एनोटेट करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर द्वारा निगरानी की थी। इस प्रकार, इस विधि में जंगली-प्रकार संयंत्र भ्रूण सेलुलर और आणविक स्तरों पर पैटर्न गठन का निरीक्षण करने के लिए, और पैटर्न गठन जंगली प्रकार के पौधों और भ्रूण घातक म्यूटेंट से भ्रूण में तुलना करके भ्रूण patterning में विशिष्ट जीन की भूमिका विशेषताएँ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसलिए, विधि Arabidopsisमें embryogenesis विशेषताएँ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
Introduction
Embryogenesis उच्च संयंत्र विकास में जल्द से जल्द घटना है। एक परिपक्व भ्रूण रूपों एक युग्मनज कोशिका विभाजन और भेदभाव सख्त आनुवंशिक नियंत्रण1,2के माध्यम से। Arabidopsis भ्रूण morphogenesis के नियंत्रण क्योंकि एक उम्मीद पैटर्न3,4embryogenesis के दौरान सेल प्रभागों के अनुक्रम इस प्रकार अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल हैं। हालांकि, कई कक्षों के लिए एक युक्त एक Arabidopsis भ्रूण मनाया और विश्लेषण के लिए बहुत छोटी है। इसके अलावा, कुछ जीनों के उत्परिवर्तन भ्रूण मारक5embryogenesis में उन जीनों की महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत, हो सकता है। भ्रूण-घातक म्यूटेंट में पैटर्न गठन के लक्षण वर्णन जिसके तहत भ्रूण विकास आवश्यक जीनों को विनियमित आणविक तंत्र को समझने के लिए एक आधार प्रदान करता है।
एक विस्तृत विधि यहाँ मॉडल संयंत्र Arabidopsis में भ्रूण पैटर्न गठन के लक्षण वर्णन के लिए प्रत्यक्ष सूक्ष्म अवलोकन द्वारा वर्णित है। विधि एक भ्रूण का सूक्ष्म अवलोकन द्वारा पीछा किया बीजांड मंजूरी शामिल है। एक भ्रूण घातक उत्परिवर्ती के लक्षण वर्णन भी वर्णन किया गया है।
विभिन्न विकासात्मक चरणों पर भ्रूण के morphology सीधे माइक्रोस्कोपी Hoyer के समाधान6,7के साथ मंजूरी दे दी गई है बीजाणु के प्रयोग द्वारा निर्धारित किया जा सकता। ऐसे बीजाणु के एक उच्च अपवर्तक सूचकांक प्रदर्शन; इस प्रकार, इस विधि समाशोधन बीजांड नमूनों कि अंतर हस्तक्षेप (डीआइसी) के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाना चाहिए के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है।
इसके अलावा, जीन है कि embryogenesis के दौरान व्यक्त किया जाता है एक विशेष कक्ष या कक्षों की एक सीमित संख्या में मार्कर के रूप में एक भ्रूण में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसलिए, कक्ष पहचान विनिर्देश embryogenesis दौरान confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर का उपयोग मार्कर GFP-टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति निगरानी द्वारा एनोटेट कर सकते हैं। इसके विपरीत, अभिव्यक्ति के पैटर्न के एक अज्ञात कार्यात्मक जीन -GFP फ्यूजन embryogenesis के दौरान देख सकते हैं भ्रूण patterning और उस जीन की अभिव्यक्ति के बीच एक लिंक उपलब्ध कराने, और Arabidopsisमें embryogenesis के लिए आवश्यक हैं नए जीनों की पहचान की सुविधा।
यहाँ वर्णित विधि भी एक भ्रूण घातक उत्परिवर्ती के phenotype विशेषताएँ करने के लिए, और सेलुलर स्तर पर embryogenesis पर प्रभावित जीन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसके अलावा, मार्कर जीन की अभिव्यक्ति पद्धति के साथ संयोजन में एक तुलना जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती पौधों के बीच embryogenesis के दौरान, आणविक तंत्र और संकेतन पथ embryogenesis8,9में शामिल बारे में सुराग विधि उपज कर सकते हैं। दरअसल, विधि naa10 पौधों के लिए लागू किया गया था, और यह पाया गया कि hypophysis में उत्परिवर्ती का असामान्य विभाजन embryogenesis5के दौरान ऒक्झिन्स के वितरण में परिवर्तन के द्वारा कारण हो सकता है।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल को तीन भागों है: 1) पैटर्न गठन डीआइसी माइक्रोस्कोपी; का उपयोग जंगली-प्रकार Arabidopsis भ्रूण में देख 2) भ्रूण पैटर्न गठन के जरिए confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर का उपयोग मार्कर प्रोटीन अभिव्यक्ति का अवलोकन निस्र्पक; और 3) embryogenesis (एक उदाहरण के रूप में naa10 उत्परिवर्ती का उपयोग करके) में एक विशेष जीन की भूमिका का निर्धारण।
1. बीजांड समाशोधन
- संयंत्र सामग्री तैयारी
नोट: यहाँ वर्णित इस प्रोटोकॉल पर स्वस्थ पौधों को विकसित करने के लिए कैसे एक उदाहरण है; स्वस्थ पौधों को विकसित करने के लिए अन्य तरीके भी काम करते हैं।- 100 बीज एक 1.5 mL ट्यूब करने के लिए जोड़ें, और तब कि बीज और समाधान पूरी तरह से सतह बीज बाँझ के लिए अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए कई बार ट्यूब 5 मि. पलटें के लिए बीज बाँझ के लिए 1.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट (10% क्लोरीन के 15 मिलीलीटर पानी की 85 मिलीलीटर के साथ मिश्रण) की 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- बीज होते हैं 30 के लिए द्वारा ट्यूब के नीचे करने के लिए बाध्य s 1,200 x जी, पर तैरनेवाला निकालें, और अवशिष्ट सोडियम हाइपोक्लोराइट को निकालने के लिए एक बेंच पर चार बार बीज बाँझ पानी के साथ धो लें।
- 4.4 जी के Murashige और Skoog (एमएस) बेसल नमक मिश्रण और 10 ग्राम sucrose के ultrapure पानी का 1 L के लिए जोड़ें। लवण और sucrose भंग करने के लिए मिश्रण हिलाओ। समाधान पीएच 5.8 1 M कोह, के साथ करने के लिए समायोजित करें 3 जी के बीच बढ़िया तालमेल है एजेंट, Phytagel, जैसे MS-sucrose, समाधान जोड़ें, और MS माध्यम बनाने के लिए 15 मिनट के लिए 121 ° C पर समाधान बाँझ।
- MS माध्यम के 30 एमएल MS माध्यम प्लेट जनरेट करने के लिए एक 12 सेमी संस्कृति पकवान में डालो।
- निष्फल बीज MS प्लेट पर रखें। थाली करने के लिए एक विकास कक्ष हस्तांतरण और बीज स्तरीकरण (अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों) के बाद लंबे समय-दिन शर्तों (16 ज और 18 डिग्री सेल्सियस से 8 घंटे तक अंधेरे में प्रकाश के लिए 22 ° C) के तहत थाली रखें।
- 8 दिनों के बाद विकास, पौधों एक ट्रे में मिट्टी (मिश्रण पोषक तत्व युक्त मिट्टी और एक 1:1 के अनुपात में vermiculite) करने के लिए स्थानांतरण, ट्रे पानी के नुकसान से बचने के लिए 5 दिनों के लिए एक सफेद, पारदर्शी ढक्कन के साथ कवर, और पौधों के vitrification से बचने के लिए एक अंतर को छोड़।
- ट्रे बंद ढक्कन ले लो और लंबे समय-दिन (1.1.5 देखें) की शर्तों के तहत एक वॉक-इन चैंबर में पौधों पर खेती। 6:00 पर रोशनी स्विच और बंद को 10:00 बजे। वॉक-इन चैंबर में विकास के बारे में 20 दिनों के बाद, पौधों फूल जाएगा और siliques का उत्पादन किया।
- बीज की स्थिति पर एक थ्रेड के साथ फूलों की कलियों डांठ लिया पुष्पक्रम में 8:00 पर मार्क (का उपयोग नहीं पहले तीसरा फूल कलियों के लिए करते; आम तौर पर इन फूल कलियों से उत्पन्न siliques कुछ रोके गए बीज विकसित करने, और यह असामान्य बीजाणु के लिए सामान्य के अनुपात को बदल सकता)। 8:00 पर अगली सुबह फूल करने के लिए चिह्नित कली खोलता है, जब रूप में बीजाणु के परागण की शुरुआत परिभाषित करें।
- Hoyer के समाधान की तैयारी
- क्लोराल हाइड्रेट की 24 ग्राम जोड़ें करने के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और ट्यूब (समाधान क्लोराल हाइड्रेट के तहत प्रकाश स्थिर नहीं हैं) पूरी तरह से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटो।
- अगले, इसके बाद के संस्करण समाधान के लिए ultrapure पानी की और ग्लिसरॉल के 3 एमएल 9 मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब क्लोराल हाइड्रेट को भंग करने के लिए हिला। Hoyer के समाधान बनाने के लिए, ट्यूब कमरे के किसी भी बुलबुले को खत्म करने के लिए तापमान में रात भर खड़े चलो।
- बीजांड जुदाई और निकासी
- डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप का एक टुकड़ा एक खुर्दबीन कांच स्लाइड करने के लिए अनुलग्न करें। जगह एक silique सतह को सीधा pseudoseptum के साथ स्लाइड पर परागण (डीएपी) के बाद दिनों की इच्छित संख्या के लिए बड़ा हो गया; यह अंडप (आंकड़े 1A और 1B) को विभाजित करने के लिए आसान कर देगा।
- Pseudoseptum के दोनों किनारों पर अंडप एक सिरिंज सुई के साथ विभाजित और बीजाणु के silique में एक त्रिविमेक्ष (आंकड़े c 1को इंगित और 1 D) के तहत दिखाई दे रहे हैं ताकि दो जांचा अंडप स्लाइड करने के लिए अनुलग्न करें।
- 70 µL कांच स्लाइड पर Hoyer के समाधान के बग़ैर, और उसके बाद Hoyer के समाधान के साथ ललित इत्तला दे दी चिमटी की एक जोड़ी की नोक की सूई द्वारा गीला करना। त्रिविमेक्ष का उपयोग कर, बीजाणु के Hoyer के समाधान में स्लाइड पर भ्रूण को साफ करने के लिए चिमटी के साथ ले जाएँ। एक coverslip धीरे से किसी भी बुलबुले पैदा करने से बचने के लिए स्लाइड करने के लिए लागू होते हैं।
- 2-12 एच के लिए एक अंधेरे कमरे में एक बॉक्स में समाप्त स्लाइड (अधिक परिपक्व एक बीजांड, अधिक समय की आवश्यकता होगी) कमरे के तापमान पर डाल दिया है। जबकि भ्रूण octant और प्रारंभिक गोलाकार अवस्था (3 डीएपी) के बीच मनाया जा सकता है के बाद 4 एच 2/4-सेल स्टेज (1-2 डीएपी) पर भ्रूण microscopically 2 एच के बाद, मनाया जा सकता है। अधिक परिपक्व भ्रूण (4-8 डीएपी) के बाद 12 ज मनाया जा सकता है।
- साफ़ किए गए बीजाणु के एक खुर्दबीन के डीआइसी समारोह का उपयोग कर की जाँच करें। एक कम-पावर फ़ील्ड (10 X) के अंतर्गत भ्रूण की स्थिति जानें और उसके बाद विकसित भ्रूण में सेलुलर पैटर्न का पालन करने के लिए एक उच्च शक्ति क्षेत्र (100 X तेल विसर्जन लेंस) करने के लिए परिवर्तित करें।
- भ्रूण में विभिन्न विकासात्मक चरणों की जाँच करें।
2. भ्रूण Patterning और मार्कर प्रोटीन अभिव्यक्ति के अवलोकन के माध्यम से सेल पहचान के लक्षण वर्णन
- संयंत्र सामग्री की तैयारी
- प्रमोटर और मार्कर जीन या हार्मोन प्रतिक्रिया तत्व के अनुक्रम कोडन क्लोन और उसके बाद यह एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे GFP); साथ फ्यूज अगला, निर्माण बाइनरी वेक्टर (pCambia1300) के रूप में सम्मिलित करें। यहाँ, ऒक्झिन्स प्रतिक्रिया तत्व DR5 एक उदाहरण10के रूप में प्रस्तुत किया गया है।
- परिणामी DR5-GFP प्लाज्मिड Agrobacterium tumefaciensद्वारा जंगली-प्रकार पौधों में परिचय-परिवर्तन11मध्यस्थता। Hygromycin युक्त MS मध्यम प्लेटों का उपयोग T1 पौधों का चयन करें (50 मिलीग्राम/एमएल माँ शराब, पतला 1:1, 000)। ट्रांसजेनिक पौधों लंबी जड़ें प्रदर्शन और दो थाली पत्ते 1.1.5 में वर्णित शर्तों के तहत विकास के 8 दिन बाद उत्पन्न होगा।
- ट्रांसजेनिक पौधों के लिए मिट्टी हस्तांतरण और उन्हें 1.1.6 और 1.1.7 में दर्शाई के रूप में खेती।
- टी 2 बीज स्वतंत्र T1 लाइनों से इकट्ठा। MS-hygromycin प्लेटों पर बीज बोना, DR5-GFP सम्मिलन (प्रति संवेदनशील संयंत्रों के लिए प्रतिरोधी पौधों का अनुपात मोटे तौर पर 3:1 हो जाएगा) की एक प्रति ले जाने पौधों का चयन करें, और उन्हें मिट्टी के लिए स्थानांतरण।
- टी 2 पौधों 1.1.6 और 1.1.7 में दर्शाई के रूप में खेती।
- T3 बीज T2 पौधों से इकट्ठा। MS-hygromycin प्लेटों पर बीज बोना, homozygous ट्रांसजेनिक पौधों (सभी एक एकल पंक्ति से पौधों के hygromycin प्रतिरोध प्रदर्शन करेंगे) का चयन करें, और उन्हें मिट्टी के लिए स्थानांतरण।
- Homozygous T3 पौधों के फूलों की कलियों में 1.1.8 संकेत के रूप में चिह्नित करें।
- GFP सिग्नल अवलोकन
- 3 एमएल ग्लिसरॉल के एक 6% ग्लिसरॉल समाधान उत्पन्न करने के लिए ultrapure पानी के 47 मिलीलीटर के साथ मिश्रण।
- डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप का एक टुकड़ा एक ग्लास खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए संलग्न है और एक silique 1.3.1 में दर्शाई के रूप में ठीक।
- Pseudoseptum के दोनों किनारों पर अंडप एक सिरिंज सुई के साथ विभाजित और 1.3.2 में दर्शाई के रूप में एक त्रिविमेक्ष के तहत स्लाइड करने के लिए दो जांचा अंडप अनुलग्न करें।
- 30 µL कांच स्लाइड पर 6% ग्लिसरॉल के बग़ैर और जांचा अंडप से बीजाणु के सभी ललित इत्तला दे दी चिमटी का उपयोग कर समाधान में जगह है। एक coverslip धीरे स्लाइड पर जगह।
- बीज कोट और endosperm प्रत्येक बीजांड में भ्रूण में GFP संकेतों का अवलोकन को रोकने कर सकते हैं के रूप में, भ्रूण बीजाणु से निकालें। स्लाइड को जल्दी से और धीरे से टैप करें (अधिक परिपक्व एक बीजांड है, कम बल स्लाइड करने के लिए लागू किया जा चाहिए) भ्रूण बीजाणु से बाहर निकालना करने के लिए।
- GFP प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग confocal लेजर का उपयोग के लिए स्लाइड की जाँच करें। एक कम-पावर क्षेत्र (10 X) के अंतर्गत पृथक भ्रूण खोजने और उनके स्थान रिकॉर्ड, तो भ्रूण में DR5-GFP अभिव्यक्ति के लिए 488 उत्तेजना प्रकाश स्रोत की स्थापना के द्वारा निरीक्षण करने के लिए एक उच्च शक्ति क्षेत्र (100 X तेल विसर्जन लेंस) के लिए बदल GFP संकेत का पता लगाने के लिए nm.
- GFP अभिव्यक्ति और विश्लेषण के लिए उपयुक्त T3 पंक्ति का चयन करने के लिए भ्रूण का पता लगाने।
3. बीजांड निकासी और मार्कर प्रोटीन प्रेक्षण के माध्यम से एक भ्रूण घातक उत्परिवर्ती में भ्रूण पैटर्न गठन के लक्षण वर्णन: Naa10 एक उदाहरण के रूप में
- भ्रूण patterning naa10 उत्परिवर्ती पौधों में
- 1.1.1-1.1.7 में दर्शाई के रूप में संयंत्र सामग्री तैयार करते हैं।
- Naa10की पहचान+ − जीन-विशिष्ट प्राइमरों5, और उसके बाद चिह्न का उपयोग कर पीसीआर द्वारा पौधों का फूल कलियों के ना10+ − पौधों में 1.1.8 संकेत के रूप में।
- बीजांड निकासी और ना10 की सूक्ष्म परीक्षा करते+ − 1.2 और 1.3 में दर्शाई के रूप में भ्रूण।
- Naa10 भ्रूण का उपयोग मार्कर प्रोटीन विश्लेषण
- 2.1-2.2 में दिए गए कार्यविधि का उपयोग कर उपयुक्त DR5-GFP ट्रांसजेनिक लाइनें प्राप्त करें।
- एक ना10 के साथ एक homozygous DR5-GFP ट्रांसजेनिक लाइन पार+ − ना10 प्राप्त करने के लिए संयंत्र+ − पौधों कि F2 पीढ़ी (जीन-विशिष्ट पीसीआर द्वारा की पहचान की) में naa10विशेषताएँ GFP प्रतिदीप्ति मार्कर के लिए homozygous हैं+ −5 और GFP संकेत एक homozygous DR5-GFP लाइन का उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे निरीक्षण करते।
- फूल कलियों ना10 के मार्क+ − पौधों कि homozygous 2.1.7 में दर्शाई के रूप में DR5-GFP के लिए कर रहे हैं।
- 2.2 में दर्शाई के रूप में DR5-GFP के लिए homozygous हैं naa10 भ्रूण में GFP संकेत के लिए खोज।
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Representative Results
इस पत्र में वर्णित विधि एक खुर्दबीन के नीचे सीधे embryogenesis पर गौर करें, कक्ष पहचान विनिर्देश embryogenesis के दौरान विशिष्ट मार्कर के साथ एनोटेट और embryogenesis के दौरान एक विशेष जीन की भूमिका विशेषताएँ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
भ्रूण (से लम्बी युग्मनज चरण परिपक्व-चिपका चलना चरण) में जंगली-प्रकार Arabidopsis patterning के विश्लेषण से प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2में दिखाए जाते हैं। बीजांड निकासी करने के बाद, विभिन्न विकासात्मक चरणों पर भ्रूण डीआइसी माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। DR5-GFP की अभिव्यक्ति पद्धति confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (भ्रूण में ऒक्झिन्स के वितरण का निर्धारण और Arabidopsisमें embryogenesis के दौरान ऒक्झिन्स की संभावित भूमिका की जांच करने के लिएचित्र 3) के तहत embryogenesis के दौरान दर्ज किया गया था।
इस प्रोटोकॉल भी विशिष्ट जीन की भूमिका के दौरान embryogenesis विशेषताएँ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। यहाँ, एक उदाहरण के रूप में Arabidopsis में embryogenesis के दौरान Naa10 की भूमिका की जांच की थी। Hypophysis के असामान्य प्रभाग (अनुप्रस्थ असममित प्रभाग जंगली प्रकार के पौधों, चित्रा 4में hypophysis के साथ की तुलना में Naa10 में hypophysis का तिरछा और अनुलंब विभाजन) मनाया गया। ऒक्झिन्स का वितरण गोलाकार मंच पर सबसे Naa10 भ्रूण में लगभग एक समान था और जंगली प्रकार भ्रूण (चित्र 5) की तुलना में hypophysis में एक व्यापक संकेत बनाए रखा। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि Naa10 embryogenesis के लिए आवश्यक है, और कि यह ऒक्झिन्स मार्ग Arabidopsisमें संकेतन के माध्यम से embryogenesis में शामिल हो सकते हैं।
चित्रा 1: योजनाबद्ध आरेख Arabidopsis Silique के विच्छेदन के लिए। (A) कांच स्लाइड पर संलग्न silique डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप का एक टुकड़ा के साथ चिपकाया था। (B) ए में बॉक्स के बढ़े हुए छवि दो काल्पनिक रेखाओं को विभाजित किया जा करने के लिए स्थान का प्रतिनिधित्व किया। (C) बॉक्स में d. (D) विभाजन silique की छवि में विभाजन silique के बढ़े हुए छवि। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: डीआइसी माइक्रोस्कोपी द्वारा जंगली-प्रकार (कर्नल-0) Arabidopsis में Embryogenesis की परीक्षा। (A) लंबी युग्मनज। (B) 1-कोशिका चरण भ्रूण 1 डीएपी पर। (C) A 2/4-कोशिका चरण भ्रूण 2 डीएपी पर। (D) एक octant चरण भ्रूण 3 पर डीएपी। (E) A dermatogen चरण भ्रूण 3 डीएपी पर। (F) 4 पर एक प्रारंभिक गोलाकार मंच भ्रूण डीएपी। (G) A 5 डीएपी पर देर से गोलाकार मंच भ्रूण। (ज) A दिल चरण भ्रूण 6 डीएपी पर। (मैं) एक टारपीडो चरण भ्रूण 7 डीएपी पर। (J) पर 8 डीएपी एक-चिपका चलना चरण भ्रूण। सलाखों के पैमाने पर 10 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: जंगली-प्रकार (कर्नल-0) Arabidopsis भ्रूण में DR5 की अभिव्यक्ति पैटर्न। (एक - d) GFP संकेत। (A-D) मर्ज किए गए छवियों उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के साथ। DR5 जंगली-प्रकार गोलाकार मंच (एक और एक, 4 डीएपी) और हृदय (बी और बी, 6 डीएपी) चरण भ्रूण के रूट ध्रुव में व्यक्त की गई थी। DR5 भी भ्रूण cotyledon युक्तियाँ (सी और सी, 7 डीएपी) और परिपक्व जंगली-प्रकार भ्रूण (d और D, 8 डीएपी) के vasculature में व्यक्त की गई थी। सलाखों के पैमाने पर 50 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: लक्षण वर्णन Naa10 की भूमिका के दौरान Arabidopsisमें Embryogenesis. एक जंगली-प्रकार संयंत्र (A) में hypophysis की सामान्य श्रेणी। असामान्य प्रभाग Naa10 उत्परिवर्ती पौधों में hypophysis के एक सफेद रेखा (B) (hypophysis के तिरछा प्रभाग) में और (C) (hypophysis के ऊर्ध्वाधर प्रभाग) के साथ के रूप में चिह्नित है। सलाखों के पैमाने पर 10 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: DR5 अभिव्यक्ति पैटर्न गोलाकार मंच जंगली-प्रकार (कर्नल-0) Arabidopsis और Naa10 भ्रूण में. (एक और ख) GFP का संकेत है। (A और B) मर्ज किए गए छवियों उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के साथ। DR5 (एक और A) एक जंगली-प्रकार गोलाकार मंच भ्रूण की जड़ ध्रुव में व्यक्त की गई थी। DR5 लगभग समान रूप से एक गोलाकार मंच Naa10 भ्रूण में व्यक्त की गई थी और जंगली प्रकार (बी और बी) की तुलना में hypophysis में व्यापक संकेत बनाए रखा। सलाखों के पैमाने पर 50 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
बीजांड निकासी कोशिका विभाजन का पता लगाने और Arabidopsisमें embryogenesis के दौरान आकारिकी का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है; इस तकनीक का उपयोग कर, भ्रूण सीधे डीआइसी माइक्रोस्कोपी5,12के तहत मनाया जा सकता है। बीजांड क्लीयरेंस के लिए महत्वपूर्ण कदम कदम 1.3.4 है। चरण 1.3.4 बीजांड क्लीयरेंस के लिए आवश्यक समय चर रहा है। जबकि वे अस्पष्ट देखने के बाद 12 ज 2/4-सेल स्टेज में भ्रूण स्पष्ट रूप से Hoyer के समाधान, में 2 एच के बाद मनाया जा सकता है। इस प्रकार, और अधिक परिपक्व एक बीजांड, अब मंजूरी के लिए आवश्यक समय है।
2.2.5 चरण में, एक बीजांड, से एक भ्रूण को अलग करने के लिए स्लाइड पर लागू बल की मात्रा महत्वपूर्ण है। बहुत अधिक बल लागू किया जाता है, तो भ्रूण कुचल कर सकते हैं; बहुत कम ताकत का इस्तेमाल किया है, तो हालांकि, एक भ्रूण से बीजांड extruded हो नहीं कर सकता। हमारे अनुभव में, एक बीजांड अधिक परिपक्व है, कम बल की आवश्यकता है। टारपीडो अवस्था और परिपक्व भ्रूण सीधे एक बीजांड एक सिरिंज सुई का उपयोग कर खोलें छीलने से पृथक होना कर सकते हैं। के रूप में suspensor कोशिकाओं के कुछ अलगाव की प्रक्रिया के दौरान में अलग भ्रूण नष्ट हो सकता है, suspensor से प्रतिदीप्ति संकेत खो दिया है या अपूर्ण हो सकती है। इस विधि की एक और सीमा यह है कि 4-सेल स्टेज से पहले भ्रूण से extruded भ्रूण के रूप में वे भी छोटे और बीजांड अंश से shielded रहे हैं खोजने के लिए मुश्किल थे।
विकास के चरण और एक भ्रूण की आकारिकी कुछ जीनों के उत्परिवर्तन द्वारा प्रभावित हो सकते हैं; इस तरह प्रभाव बीजांड मंजूरी के बाद माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता। इस दृष्टिकोण द्वारा कौन सा विशिष्ट जीन मध्यस्थता embryogenesis5के आणविक तंत्र को समझने में सहायता करेगा। अभिव्यक्ति के पैटर्न के एक अज्ञात कार्यात्मक जीन -GFP फ्यूजन embryogenesis के दौरान देख सकते हैं भ्रूण patterning और उस जीन की अभिव्यक्ति के बीच एक लिंक उपलब्ध कराने, और Arabidopsis13में embryogenesis के लिए आवश्यक हैं नए जीनों की पहचान की सुविधा। इस प्रकार, Arabidopsisमें embryogenesis के लक्षण वर्णन के लिए एक बुनियादी विधि यहाँ वर्णित इस प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम dr. जेसिका उत्तर समीक्षकों की पांडुलिपि पढ़ने के लिए धन्यवाद। हम इमेजिंग सेंटर, जीवन विज्ञान, राजधानी नॉर्मल यूनिवर्सिटी (बीजिंग, चीन), कॉलेज के डॉ Xianyong शेंग DR5-GFP परख का स्थानीयकरण करने के लिए धन्यवाद। यह काम नगर निगम सरकार बीजिंग विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (सीआईटी & TCD20150102) और राष् ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के चीन से (31600248)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
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