Summary
Este protocolo descreve um método para observar a embriogênese em Arabidopsis através do apuramento ovule, seguido de inspeção de formação padrão de embrião sob um microscópio.
Abstract
Dada a natureza altamente previsível do seu desenvolvimento, embriões de Arabidopsis tem sido usados como um modelo para estudos da morfogênese em plantas. No entanto, embriões adiantados de planta de palco são pequenos e contêm poucas células, tornando-os difíceis de observar e analisar. Um método é descrito aqui para caracterizar a formação padrão em embriões de planta sob um microscópio usando o organismo modelo Arabidopsis. Após o afastamento de óvulos frescos usando solução de Hoyer, o número do celular na e morfologia de embriões podem ser observadas, e seu estágio desenvolvente poderia ser determinado por microscopia de contraste de interferência diferencial usando um 100 X lente de imersão de óleo. Além disso, a expressão de proteínas marcador específico marcados com proteína fluorescente verde (GFP) foi monitorada para anotar a especificação de identidade celular durante a padronização do embrião por laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. Assim, este método pode ser usado para observar a formação de padrão em embriões de planta selvagem-tipo a nível celular e molecular e caracterizar o papel de genes específicos na padronização do embrião, comparando a formação padrão em embriões de plantas de tipo selvagem e mutantes embrião letal. Portanto, o método pode ser usado para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis.
Introduction
Embriogénese é o evento mais antigo no maior desenvolvimento da planta. Um formas de embrião maduro de um zigoto através de divisão celular e diferenciação sob estrito controle genético1,2. Embriões de Arabidopsis são um modelo útil para estudar o controle da morfogênese, porque a sequência de divisões celulares durante a embriogênese segue um padrão esperado3,4. No entanto, um embrião de Arabidopsis contendo um para várias células é muito pequeno para ser observados e analisados. Além disso, a mutação de certos genes pode causar embrião letalidade5, indicando o papel chave daqueles genes na embriogênese. A caracterização da formação padrão nos mutantes embrião letal fornece uma base para a compreensão do mecanismo molecular pelo qual genes essenciais regulam o desenvolvimento do embrião.
Um método detalhado é descrito aqui para a caracterização da formação de embrião padrão na planta modelo Arabidopsis por observação microscópica directa. O método envolve afastamento ovule, seguido pela observação microscópica de um embrião. A caracterização de um embrião letal mutante também é descrita.
A morfologia dos embriões em diferentes estádios de desenvolvimento pode ser determinada diretamente pela microscopia usando os óvulos que tenham sido limpos com solução6,7 da Hoyer. Esses óvulos apresentam um elevado índice de refração; assim, esta ovule método de compensação é especialmente vantajoso para as amostras que devem ser observadas por microscopia de contraste (DIC) de interferência diferencial.
Além disso, os genes que são expressos em uma célula específica ou um número limitado de células durante a embriogênese podem ser utilizados como marcadores para identificar as células de um embrião. Portanto, a especificação de identidade de células durante a embriogênese pode ser anotada pelo monitoramento a expressão de proteínas GFP-etiquetado marcador usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. Por outro lado, observar o padrão de expressão de um gene funcional desconhecida -GFP fusão durante a embriogênese pode fornecer um link entre a padronização do embrião e a expressão do gene que e facilitar a identificação de novos genes que são necessários para embriogênese em Arabidopsis.
O método aqui descrito também pode ser usado para caracterizar o fenótipo de um embrião letal mutante e para determinar o impacto do gene afetado na embriogênese a nível celular. Além disso, em combinação com uma comparação do padrão de expressão de genes marcadores durante a embriogênese entre plantas tipo selvagem e mutantes, o método pode gerar pistas sobre os mecanismos moleculares e vias de sinalização envolvidas na embriogênese8,9. Com efeito, o método foi aplicado a naa10 plantas, e verificou-se que a divisão anormal da hipófise no mutante pode ser causada por uma alteração da distribuição da auxina durante a embriogênese5.
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Protocol
Nota: Este protocolo tem três partes: 1) observando a formação de padrão em embriões de Arabidopsis do selvagem-tipo usando microscopia DIC; 2) caracterizando o embrião padrão formação através da observação da expressão da proteína de marcador usando laser confocal, microscopia; e 3) determinar a função de um gene específico na embriogênese (usando o mutante naa10 por exemplo).
1. ovule clareira
- Preparação de material de planta
Nota: O protocolo descrito aqui é um exemplo sobre como cultivar plantas saudáveis; outras maneiras de crescer plantas saudáveis também funcionam.- Adicionar 100 sementes a um tubo de 1,5 mL e em seguida, adicione 1 mL de 1,5% de hipoclorito de sódio (mistura de 15 mL de 10% de cloro com 85 mL de água) para esterilizar as sementes por 5 min. inverter o tubo várias vezes para garantir que a solução e as sementes são bem misturados para esterilizar as sementes superfície completamente.
- Forçar as sementes para o fundo do tubo por centrifugação por 30 s a x 1.200 g, remover o sobrenadante e lavar as sementes com água estéril quatro vezes em um banco para remover o hipoclorito de sódio residual.
- Adicione 4,4 g de mistura de sal basal de Murashige e Skoog (MS) e 10 g de sacarose a 1 L de água ultrapura. Agite a mistura para dissolver os sais e sacarose. Ajustar a solução pH 5,8 com 1m KOH, adicionar 3 g de agente de coagulação, tais como Phytagel, para a solução de sacarose-MS e esterilizar a solução a 121 ° C por 15 min fazer meio MS.
- Despeje numa placa de cultura de 12 cm para gerar MS médio chapas 30 mL do meio MS.
- Coloque as sementes esterilizadas na placa do MS. Transferir a placa para uma câmara de crescimento e manter a placa sob condições de dias longos (22 ° C durante 16 h na luz e 18 ° C para 8 h no escuro) após a estratificação de sementes (3 dias a 4 ° C, no escuro).
- Após 8 dias de crescimento, transferir as plantas para solo (solo rico em nutrientes de mistura e vermiculita na proporção de 1:1) em uma bandeja, cubra a bandeja com uma tampa transparente, branca por 5 dias evitar a perda de água e deixar um espaço para evitar a vitrificação das plantas.
- Tirar a tampa da bandeja e cultivar as plantas em uma Walk-in câmara sob condições de dias longos (ver 1.1.5). Ligue a luz às 06:00 e desligado às 22:00. Após cerca de 20 dias de crescimento na câmara de walk-in, as plantas floresceram e produzido siliques.
- Mark, os botões da flor com um segmento na posição da semente segue na inflorescência às 20:00 (não utilize o primeiro para os botões da flor terceiros; os siliques gerados a partir destes botões de flores geralmente desenvolvem algumas sementes abortadas, e isso pode alterar a proporção de normal para anormais óvulos). Defina o início da polinização do óvulo como quando o botão marcado abre a flor às 08:00 da manhã seguinte.
- Preparação da solução do Hoyer
- Adicionar 24 g de hidrato de cloral a um tubo de 50 mL e enrolar o tubo completamente com papel de alumínio (soluções de hidrato de cloral não são estáveis sob a luz).
- Em seguida, adicionar 9 mL de água ultrapura e 3 mL de glicerol para a solução acima e agitar o tubo para dissolver o hidrato de cloral. Para tornar a solução do Hoyer, deixe o tubo durante a noite em temperatura ambiente para eliminar quaisquer bolhas.
- Afastamento e separação do óvulo
- Prenda um pedaço de fita adesiva dupla-face para uma lâmina de vidro de microscópio. Coloque uma síliqua crescida para o número desejado de dias após a polinização (DAP) no slide com o pseudoseptum perpendicular à superfície; Isto tornará fácil para dividir os carpelos (Figuras 1A e 1B).
- Dividir os carpelos em ambos os lados da pseudoseptum com uma agulha de seringa e anexar os dois carpelos dissecados para o slide para que os óvulos na síliqua são visíveis sob um estereoscópio (figuras 1 e 1 D).
- Dispense a 70 µ l da solução do Hoyer a lâmina de vidro e em seguida, umedeça a ponta de um par de pinças de ponta fina com solução do Hoyer mergulhando. Usando o estereoscópio, mova os óvulos em solução do Hoyer no slide com a pinça para limpar os embriões. Uma lamela para o deslize suavemente para evitar a geração de quaisquer bolhas.
- Coloque o slide terminado dentro de uma caixa em um quarto escuro para 2-12 h (quanto mais maduro um ovule é, quanto mais tempo será necessário) à temperatura ambiente. Embriões no estágio de 2/4-cell (DAP de 1-2) podem ser observados microscopicamente após 2 h, enquanto os embriões entre o compasso e estágios iniciais globulares (DAP 3) podem ser observados após 4 h. Os embriões mais maduros (DAP de 4-8) podem ser observados após 12 h.
- Examine os óvulos limpos usando a função DIC de um microscópio. Localize os embriões sob um campo de baixa potência (10 X) e depois mude para um campo de alta potência (100 X lente de imersão de óleo) para observar o padrão celular nos embriões desenvolvidos.
- Examine os embriões em diferentes estádios de desenvolvimento.
2. caracterização do embrião padronização e identidade da célula através da observação da expressão da proteína de marcador
- Preparação dos materiais de planta
- Clonar o promotor e sequência de elemento de resposta de gene ou hormônio o marcador de código e depois fundi-la com uma proteína fluorescente (como as boas práticas agrícolas); em seguida, insira a construção do vetor binário (como pCambia1300). Aqui, o elemento de resposta de auxina DR5 é apresentado como um exemplo10.
- Introduzir o plasmídeo DR5-GFP resultante nas selvagem-tipo plantas por Agrobacterium tumefaciens-mediado transformação11. Selecione as plantas T1 usando MS médio chapas contendo hptII (50 mg/mL de licor de mãe, diluído 1:1, 000). As plantas transgénicas irão exibir longas raízes e gerar duas folhas Roseta após 8 dias de crescimento nas condições descritas no 1.1.5.
- Transferir as plantas transgénicas para solo e cultivá-los conforme indicado na 1.1.6 e 1.1.7.
- Colete as sementes T2 das linhas T1 independentes. Semear as sementes em placas de MS-hptII, selecione as plantas carregando uma cópia da inserção do DR5-GFP (a proporção de plantas resistentes às plantas sensíveis será aproximadamente 3:1) e transferi-los para o solo.
- Cultive as plantas de T2, conforme indicado na 1.1.6 e 1.1.7.
- Recolha as sementes T3 T2 plantas. Semear as sementes em placas de MS-hptII, selecione as plantas transgénicas homozigotos (todas as plantas de uma única linha irão expor hptII resistência) e transferi-los para o solo.
- Marca os botões florais das plantas T3 homozigotos como indicado no 1.1.8.
- Observação do sinal GFP
- Misture 3 mL de glicerol com 47 mL de água ultrapura para gerar uma solução de glicerol de 6%.
- Prenda um pedaço de fita adesiva dupla-face para uma lâmina de vidro de microscópio e corrigir uma síliqua conforme indicado em 1.3.1.
- Dividir os carpelos em ambos os lados da pseudoseptum com uma agulha de seringa e prenda os dois carpelos dissecados o slide em um estereoscópio como indicado no 1.3.2.
- Dispense a 30 µ l de 6% de glicerol a lâmina de vidro e coloque todos os óvulos dos carpelos dissecados na solução usando uma pinça de ponta fina. Coloque uma lamela sobre o slide suavemente.
- Como o revestimento de semente e endosperma em cada óvulo podem impedir a observação de sinais GFP no embrião, extrai o embrião do óvulo. Toque o slide rapidamente e suavemente para expulsar o embrião do óvulo (quanto mais maduro um ovule é, a menos força deve ser aplicada para o slide).
- Examine o slide para fluorescência de GFP usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. Encontrar os embriões isolados sob um campo de baixa potência (10 X) e registrar sua localização e, em seguida, mudar para um campo de alta potência (100 X lente de imersão de óleo) para observar a expressão DR5-GFP nos embriões, definindo a fonte de luz de excitação para 488 nm para a deteção do sinal de GFP.
- Detecta a expressão de GFP em embriões a selecionar a linha T3 apropriada para uma análise mais aprofundada.
3. Caracterização da formação de padrão de embrião em um embrião letal mutante via Ovule apuramento e marcador proteína Observação: Naa10 como exemplo
- Padronização de embrião em plantas mutantes naa10
- Prepare os materiais de planta como indicado em 1.1.1-1.1.7.
- Identificar o naa10+ / − plantas por PCR utilizando primers específicos do gene5e depois marca os botões da flor do naa10+ − plantas conforme indicado em 1.1.8.
- Realizar a liberação do óvulo e o exame microscópico de naa10+ − embriões conforme indicado em 1.2 e 1.3.
- Análise de proteínas marcador usando embriões naa10
- Obter o apropriado linhas transgénicas DR5-GFP usando o procedimento descrito no ponto 2.1-2.2.
- Cruzar uma linha de transgénicos homozigota DR5-GFP com um naa10+ − planta para obter naa10+ − as plantas que são homozigotos para o marcador de fluorescência de GFP na geração F2 (identificada por PCR do gene-específico) caracterizar naa10+ / −5 e observar o sinal GFP sob um microscópio usando uma linha de DR5-GFP homozigota.
- Marcar os botões da flor de naa10+ − as plantas que são homozigotos para DR5-GFP como indicado em 2.1.7.
- Procurar o sinal GFP em embriões de naa10 que são homozigotos para DR5-GFP como indicado no ponto 2.2.
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Representative Results
O método descrito neste artigo pode ser usado para observar a embriogênese diretamente sob um microscópio, anotar a especificação de identidade de células durante a embriogênese, com marcadores específicos e caracterizar o papel de um determinado gene, durante a embriogênese.
Resultados representativos a partir da análise do embrião padronização (desde a fase de zigoto alongada à fase madura de vara), no selvagem-tipo Arabidopsis são mostrados na Figura 2. Após a liberação do óvulo, os embriões em diferentes estádios de desenvolvimento poderiam ser distinguidos pela microscopia DIC (Figura 2). O padrão de expressão de DR5-GFP foi gravado durante a embriogênese sob laser confocal, microscopia (Figura 3) para determinar a distribuição de auxina no embrião e examinar o papel potencial da auxina durante a embriogênese em Arabidopsis.
Este protocolo também pode ser usado para caracterizar as funções dos genes específicos durante a embriogênese. Aqui, o papel de Naa10 durante a embriogênese em Arabidopsis analisou-se como um exemplo. Divisão anormal da hipófise foi observada (divisão torto e vertical da hipófise em Naa10 comparado com divisão assimétrica transversal da hipófise em plantas de tipo selvagem, Figura 4). A distribuição da auxina na fase globular foi quase uniforme na maioria dos embriões Naa10 e manteve um sinal mais amplo na hipófise, em comparação com os embriões de tipo selvagem (Figura 5). Estes resultados indicam que a Naa10 é necessária para embriogênese, e que podem estar envolvido na embriogênese através da auxina sinalização via em Arabidopsis.
Figura 1: Diagrama esquemático para a dissecação de Arabidopsis síliqua. (A) a síliqua ligada a lâmina de vidro foi colado com um pedaço de fita adesiva dupla-face. (B) a imagem ampliada da caixa a. As duas linhas imaginárias representaram o local a ser dividida. (C) a imagem ampliada da síliqua split na caixa d. (D) a imagem de síliqua a divisão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise da embriogênese em selvagem-tipo (Col-0) Arabidopsis por microscopia de DIC. Alongado (A) zigoto. (B), um embrião de estágio 1-célula no 1 DAP. (C), um embrião de fase 2/4-cell no DAP 2. (D), um embrião de palco de compasso em 3 DAP. (E) A dermatogen fase embrião DAP 3. (F), um embrião de estágio globular em 4 DAP. (G), uma tarde embrião estágio globular no DAP 5. (H) A coração palco embrião 6 DAP. (eu) um embrião de estágio de torpedo no DAP 7. (J) um embrião de palco de bengala no DAP 8. Barras de escala = 10 µm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O padrão de expressão de DR5 em embriões de Arabidopsis do selvagem-tipo (Col-0). (um - d) sinais GFP. (A-D) Imagens mescladas com imagens de campo brilhante. DR5 foi expressa no polo de raiz do selvagem-tipo estágio globular (a e A, 4 DAP) e embriões de estágio (b e B, 6 DAP) do coração. DR5 também foi expressa em dicas embrionárias cotilédone (c e C, DAP 7) e na vasculatura de embriões maduros do selvagem-tipo (d e D, 8 DAP). Barras de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização do papel dos Naa10 durante a embriogênese em Arabidopsis. Divisão normal da hipófise em uma planta selvagem-tipo (A). Divisão anormal da hipófise em plantas mutantes Naa10 é marcado com uma linha branca em (B) (divisão torto da hipófise) e (C) (divisão vertical da hipófise). Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O padrão de expressão de DR5 em estágio Globular selvagem-tipo (Col-0) Arabidopsis e embriões Naa10 . (a e b) Sinais GFP. (A e B) Imagens mescladas com imagens de campo brilhante. DR5 foi expressa no polo de raiz de um embrião de estágio globular selvagem-tipo (um e um). DR5 quase uniformemente foi expressa em um embrião de Naa10 de estágio globular e manteve o sinal mais amplo na hipófise, em comparação com o tipo selvagem (b e B). Barras de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Afastamento do ovule é um método útil para a detecção de divisão celular e avaliar morfologia durante a embriogênese em Arabidopsis; usando esta técnica, embriões podem ser observados diretamente sob microscopia DIC5,12. O passo fundamental para a liberação do óvulo é passo 1.3.4. O tempo necessário para o apuramento do ovule na etapa 1.3.4 é variável. Embriões no estágio de 2/4-cell podem ser observados claramente após 2 h na solução do Hoyer, Considerando que eles parecem indistintos após 12 h. Assim, quanto mais maduro um ovule é, quanto mais o tempo necessário para o apuramento.
Na etapa 2.2.5, para isolar um embrião de um óvulo, a quantidade de força aplicada ao slide é crítica. Embriões podem ser esmagados se aplicar demasiada força; no entanto, um embrião não pode ser expulsado do óvulo se força muito pouco é usada. Em nossa experiência, quanto mais maduro um ovule, a menos força é necessária. Estágio de torpedo e embriões maduros podem ser isolados diretamente por peeling aberto um ovule usando uma agulha de seringa. Como algumas células suspensor podem ser destruídas no embrião isolado durante o processo de isolamento, o sinal de fluorescência do suspensor pode ser perdida ou incompleta. Outra limitação desse método é que os embriões antes do estágio de 4 células eram difíceis de encontrar de embriões extrudados como eles são muito pequenos e blindado por fragmento do ovule.
O grau de desenvolvimento e morfologia do embrião podem ser afetados pela mutação de certos genes; tais efeitos podem ser demonstrados por microscopia após a liberação do óvulo. Esta abordagem ajudará na compreensão do mecanismo molecular por quais genes específicos embriogênese mediato5. Observar o padrão de expressão de um gene funcional desconhecida -GFP fusão durante a embriogênese pode fornecer um link entre a padronização do embrião e a expressão desse gene e facilitar a identificação de novos genes que são necessários para embriogênese em Arabidopsis13. Assim, o protocolo descrito aqui fornece um método básico para a caracterização da embriogênese em Arabidopsis.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Jessica Habashi pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos o Dr. Xianyong Sheng do centro de imagiologia, faculdade de ciências biológicas, Universidade Normal de Capital (Pequim, China), para realizar a localização do ensaio DR5-GFP . Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Municipal de ciência governo de Pequim (CIT & TCD20150102) e da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
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