Summary
ניתוח של הסרט מדמיע ציטוקינים מסייעת בלימוד עינית מחלות שונות. מבחני מולטיפלקס חרוז מבוסס הינם פשוטים רגיש ולאפשר בדיקה של מטרות מרובות בדגימות עם כמויות קטנות. כאן נתאר עבור מדמיע הסרט ציטוקין פרופיל של משתמש פרוטוקול חרוז מבוסס מולטיפלקס וזמינותו.
Abstract
הסרט דמעה הוא תערובת מורכבת של שומנים, חלבונים ומינרלים אשר מכסה על המשטח החיצוני של העין, ובכך מספק שימון, הזנה והגנה של התאים המשמשים כבסיס. ניתוח של דמעות הוא אזור המתעוררים לצורך זיהוי סמנים ביולוגיים עבור חיזוי, אבחון, הפרוגנוזה של מחלות שונות עינית. דמעות נגישים בקלות והוא באוסף שלהם לא פולשנית. לכן, לקידום טכנולוגיות הם צובר לגדולה עבור זיהוי של analytes מספר בדמעות ללמוד שינויים בהרכב חלבון או מטבוליט וכן את השיוך שלו עם מצבים פתולוגיים. דמעה ציטוקינים הם סמנים ביולוגיים אידיאלי ללמוד על פני השטח עינית הבריאות וגם לעזור בהבנת המנגנונים של הפרעות משטח עינית שונות כמו מחלת עין יבשה ואת האביב. חרוז המבוסס על מבחני מולטיפלקס יש את היכולת של גילוי analytes מרובים בכמות קטנה של הדגימה עם רגישות גבוהה יותר. כאן נתאר פרוטוקול מתוקננת של אוסף דגימה דמעה, חילוץ וניתוח של ציטוקין פרופיל משתמש חרוז מבוסס מולטיפלקס וזמינותו.
Introduction
דמעות מיוצרים על ידי בלוטת הדמעות ובלוטות אביזר, מעיל המשטח החיצוני של העין. דמעה הסרט מורכב רובד חיצוני השומנים ושכבה פנימית מימית הכוללת חלבונים מסיסים, mucins ממברנה שיאוגדו mucins. דמעות למנוע פלישה חיידקים, לספק חומרים מזינים וספק שימון השטח עינית. דמעות לפעול כממשק בין האוויר לבין רקמות עבור העברת החמצן בקרנית. 1 הסרט קרע מורכב של חלבונים, פחמימות, שומנים, אלקטרוליטים. הקשר בין דמעה חלבונים עם עינית ומחלות מערכתיות כמו גלאוקומה, מחלה עין יבשה, האביב, סוכרת, orbitopathy הקשורים בלוטת התריס וסרטן זוהתה במספר מחקרים. 2 , 3 , 4 דגימות מדמיע יכול להיות שנאספו על ידי צינורות microcapillary או דמעה זרימה רצועות (Schirmer רצועות). בנוסף, המבחן של Schirmer הוא נוהל שגרתי שבוצעה קרנית, ניתוח לתיקון הראייה בלייזר במרפאות, התוצאות אשר עשוי לשמש ציטוקין ניתוח מבחני. אוסף דגימה לא פולשנית, נגישות של הדגימה הביו והאגודה הקומפוזיציה מדמיע במגוון מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים להפוך קורעים סרט מקור פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים עבור כמה מחלות עינית ומערכתית. 4 , 5 , 6
דמעה ציטוקינים ממלא תפקיד חשוב ללמוד את עינית משטח ובריאות במצבים דלקתיים במחלות שונות עינית. 7 ריכוזים חריגים של ציטוקינים מספר הדגימות מדמיע דווחו להיות מזוהה עם מחלת עיניים יבשות, סולט לייק סיטי keratoconjunctivitis (VKC), keratoconjunctivitis אטופית (AKC), דלקת הלחמית אלרגית עונתית של uveitis. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 חלבונים מדמיע ניתן לנתח אותם באמצעות שיטות מסורתיות כמו ספקטרומטר מסה, סופג המערבי, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). 14 , 15 . עם זאת, המגבלות של שיטות אלה הן רגישות המסכן נפח גדול יותר של מדגם הנדרש לניתוח של ציטוקינים מדמיע מרובים של כל מטופל. 16 , 17 חרוז המבוסס על מבחני מולטיפלקס יש פותחה כדי לנתח analytes מרובים בדגימות תערובת מורכבת, הוחלו בהצלחה על דגימות מדמיע כדי לנתח ציטוקינים מרובים במחלות שונות. 6 , 18 א' שילוב של כריך אליסה וטכניקות cytometry זרימה מאפשרים אלה מבחני להיות רגיש יותר אליסה עבור כימות של analytes מרובים בדוגמה אחת. 19 בשיטה זו ניתן להחיל על מגוון של דוגמאות קליניות, supernatants התרבות תאים ומסייע במחקר של התגובות החיסון מספר תנאים הקשורים pathophysiological. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
ישנם מספר מחקרים בהשוואת מולטיפלקס חרוז המבוסס על מבחני עם אליסה, דיווחו על מתאם בין השיטות. חרוז. et al. בהשוואה loo מבוסס assay מולטיפלקס עם אליסה קונבנציונליים עבור הגילוי של אדיפונקטין, resistin, לפטין, גרלין בדגימות סרום או פלזמה האנושי ודיווח מתאם חזק (r > 0.9) בין מבחני. 25 דיווחו דופונט. et al. מתאם חזק בין מבחני מולטיפלקס חרוז מבוסס ואליסה איתור IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ ו- TNF-α phytohemagglutinin ו ליפופוליסכריד המרצת דם אסף מנשים הרות. 26 . פיקרינג et al. דיווח אחר מתאם חזק בין חרוז מבוסס assay מולטיפלקס ואליסה לאיתור נוגדנים בסרום Haemophilus שפעת סוג b רב-סוכר (r = 0.96), toxoids של Clostridium tetani (r = 0.96), ו- Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). 27 . Biagini et al. דיווח על מתאם חיובי גבוה (r = 0.852) בין חרוז מבוסס assay מולטיפלקס ואליסה גילוי של Bacillus anthracis אנטי-PA IgG בסרום הדגימות. 28 . וואנג et al. דיווח על מתאם בין חרוז מבוסס assay מולטיפלקס ואליסה איתור של מחלת אלצהיימר סמנים ביולוגיים עמילואיד-β 42 (r = 0.77), הכולל טאו (r = 0.94), טאו phosphorylated-חומצת אמינו 181 (r = 0.82) ב . דגימות נוזל מוחי שדרתי 29 מחקרים אלו הוכיחו שהישימות של חרוז סמך מבחני מולטיפלקס מגוון של דוגמאות קליניות, דרישות האחסון מדגם קטן יותר קשר עם אליסה סטנדרטי, ההופכים את מבחני מולטיפלקס חרוז המבוסס על התחלה מבטיחה. חלופה לשיטות אליסה מסורתי איתור analytes מרובים בסוג שונה של דוגמאות פנוטיפים מחלות שונות. כאן נתאר עבור assay מולטיפלקס חרוז המבוסס על ציטוקין פרופיל עבור analytes 41 מדמיע הדגימות שנאספו מן הנבדקים בריא באמצעות רצועות Schirmer פרוטוקול סטנדרטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בפרוטוקולים המשמשים במחקר זה אושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי של החולים סנג טוק טאן, סינגפור.
1-ניתוח ציטוקין לקרוע
- אוסף של דמעות:
- לשאול את הנושא כדי לשבת בנוחיות על כיסא הבדיקה מקום הראש כנגד משענת הראש.
- שאל את הנושא לחפש בקפידה לפתוח את רצועות Schirmer (עשוי נייר סינון וטמן מס 41), מקום סוף רצועת מעוגל על fornix נחות של העין, להורות את הנושא כדי לסגור את העיניים 5 דקות. בעת איסוף הדמעות. שמור על עצמך כדי למזער את עינית מהמטרה. 30
- לשאול את הנושא כדי לפתוח את העיניים שלו/שלה כדי להסיר רצועת ולמקם אותו צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי. מיד העברת הצינור מעבדה או חנות ב-80 o C עד בדיקת פרופיל ציטוקין.
- • תנאי מדגם דמעה דמעה זרימה מרצועת:
- לחתוך רצועת זרימה מדמיע באורך של 0.5 ס מ (לתקנן את הכמות של דמעות להיבדק) ולמקם אותו בצינור סטרילי mL 1.5 microcentrifuge.
- להוסיף 30 µL של assay מאגר, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ואחריו צריך שתוציאו את הצינור ב- g x 14,000 עבור מינימלית 1
- להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL עוד ולמחוק את הרצועה. הצב המדגם שמכילה את הצינורית על הקרח והשתמש המדגם מדמיע eluted מיד עבור פרופיל ציטוקין.
- הכנה של ריאגנטים:
הערה: analytes ארבעים ואחד להיבדק בכל מדגם ע י assay מולטיפלקס חרוז מבוסס הם אינטרלויקין (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, il-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, אינטרפרון-אלפא (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-גמא-inducible חלבון 10 (ה-IP-10, CXCL10), נגזר מקרופאג כימוקין (MDC), מקרופאג דלקתי חלבון (MIP)-1α ו MIP-1β, מונוציט חלבון chemotactic (MCP)-1, MCP-3, הגידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNF-α), TNF-β, מוסדר צמיחה אונקוגן (GRO), הגידול גורם הגדילה אלפא (TGF-α), כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF), גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), פיברובלסט פקטורי גדילה (FGF)-2, נגזר טסית דם גורם הגדילה (דם PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, גורם מגרה המושבה גרנולוציט (G-CSF), פקטור המושבה-מגרה גרנולוציט-מקרופאג (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, CD40 מסיסים ליגנד (sCD40L), כמו Fms טירוזין קינאז 3 ליגנד (Flt - 3L) מוסדר על ההפעלה, T-cell נורמלי הביע, מופרש החלבון (RANTES).- להביא הבקבוקונים פתרון (50 X) חרוז נוגדן בטמפרטורת החדר (20-25 o C) ו מערבולת הבקבוקונים עבור מינימלית 1
- לספור את מספר בארות הדרושות וזמינותו, לחשב את הכמות של נוגדן הכולל חרוז קוקטייל פתרון (25 µL לכל טוב) לכל פתרון חרוז נוגדנים (50 X) נדרש וזמינותו.
- להכין את הפתרון קוקטייל על-ידי הוספת הסכום המחושב של כל נוגדן חרוז פתרון ומילוי האחסון הסופי הרצוי על-ידי הוספת את הסכום הנותר חרוז diluent. ודא כי הריכוז הסופי של כל נוגדן בהקוקטייל 1 X. תמיד הכינו לפחות 20% יותר נפח של קוקטייל פתרון במקרה של שגיאות pipetting.
הערה: לדוגמה, עבור assay 96-ובכן להכין 3000 µL של נוגדן חרוז פתרון קוקטייל. הכמות הנדרשת של כל פתרון חרוז נוגדן = 3000/מניות ריכוז של כל פתרון חרוז נוגדן; 3000/50 = 60 µL של כל פתרון חרוז נוגדן- להוסיף 60 µL של כל אחד הפתרונות חרוז נוגדן 41 (60 X 41 = 2460 µL) לתוך קוקטייל בבקבוק ולהוסיף µL 540 של פתרון diluent חרוז לתערובת חרוז נוגדנים כדי להפוך 3000 µL של סופי הפתרון עובד (1 X).
- לפני השימוש, מערבבים את הפתרון קוקטייל חרוז כראוי. לאחר וזמינותו לאחסן את אמצעי האחסון הנותרת ב- 2-8 o C עד 30 ימים.
- להכין את הפקדים איכות (QC) על ידי הוספת מים µL יונים 250 קיו סי 1 ו- QC 2 מניות.
- מערבבים היטב על ידי היפוך הבקבוקים מספר פעמים ו מערבולת להעברת ס' 10 הפתרון מתויג כהלכה צינורות פוליפרופילן microcentrifuge ולאחסן את הפתרון הנותרים ב-20 ° C, אשר יכול לשמש עד 30 ימים.
- הכנת המאגר שטיפת על-ידי הוספת יונים 270 מ"ל מים 30 מ של 10 X לשטוף בופר ומערבבים היטב (לפני דילול, להביא את המאגר X 10 בטמפרטורת החדר ו להמיס כל פוחת משקעים מלח על ידי ערבוב). לאחסן מאגר שטיפת שאינם בשימוש (1 X) ב 2-8 ° C אשר יכול לשמש עד 30 ימים.
- להכין ציטוקין אנושי רגיל המניה (10,000 pg/mL של כל analytes) על-ידי הוספת מים µL יונים 250 המבחנה מניות. לערבב היטב על ידי היפוך מספר פעמים, מערבולת המבחנה 10 ס לאפשר לו לעמוד 10 דקות ולהעביר את הפתרון מניות מתויג כהלכה צינורות פוליפרופילן microcentrifuge. לאחר וזמינותו, לאחסן את הפתרון הנותרים ב-20 ° C, אשר יכול לשמש עד 30 ימים.
- להכין את הסטנדרטים ציטוקין האנושי עובד על ידי דילולים טורי 5-fold (50 µL - > 200 µL) עם מאגר assay להשיג 2000, 400, 80, 16, ו 3.2 pg/mL.
- לאחר הכנה רגיל, להשתמש בסטנדרטים לעבוד בתוך 60 דקות ולהשתמש המאגר assay כרקע/ריק (-pg/mL).
- ציטוקין פרופיל מאת חרוז מבוסס assay מולטיפלקס:
- להביא כל ריאגנטים בטמפרטורת החדר ו מערבולת למשך 5-10 שניות לפני שאתה מוסיף אותם לצלחת microtiter 96-ובכן. אם הקרע eluted דגימות מאוחסנים ב-80 o C לפני וזמינותו, להפשיר את תמציות מדמיע קפוא בקרח ו צנטריפוגה ב 1000 X g עבור 5 דק
- להכין גיליון עבודה assay בתצורה אנכיים לעבודה סטנדרטים אנושיים ציטוקין [0 (ריק), 3.2, 16, 80, 400, 2000, ו 10,000 pg/mL], QC1, QC2 ודוגמאות.
- להוסיף 200 µL 1 X שטיפת מאגר לכל אחד טוב של הצלחת, לאטום אותו עם צלחת סילר לאיטום ולשמור אותו על צלחת מטרף בטמפרטורת החדר (20-25 o C) במשך 10 דקות
- Decant המאגר שטיפת X 1 על-ידי היפוך את הצלחת והקש על זה על גבי מגבות סופגות מספר פעמים כדי להסיר את כל כמות שיורית של שטיפת מאגר הבארות.
- להוסיף 25 µL של כל עבודה אנושית ציטוקין סטנדרטי, QC1, QC2, ריק (מאגר assay) ודוגמאות לתוך הבארות המתאים.
- להוסיף 25 µL assay מאגר לבאר כל.
- µL להוסיף 25 1 X נוגדן חרוז פתרון קוקטייל כל טוב. כמו הפתרון חרוז נוגדן רגיש אור, לאטום את הצלחת עם סילר לאיטום צלחת ומכסים אותו ברדיד אלומיניום, כדי להגן עליה מפני אור במהלך וזמינותו.
- דגירה את הצלחת בבית 4 o C בן לילה על מטרף.
- למקם את הצלחת על המדף צלחת של דסקית צלחת מגנטית אוטומטית. . תן לזה לנוח במשך 1 דקה ליישב את החרוזים המגנטי בתחתית הבאר, וארוקן את תוכן טוב. להוסיף 200 µL שטיפת מאגר לכל טוב ולתת לו לשבת על 1 דקות, ואז וארוקן את תוכן טוב. חזור שוב בכביסה (צלחת כביסה, בצע את היצרן ערכת ' s הוראות).
- להוסיף 25 µL של זיהוי נוגדנים פתרון לתוך כל. לאטום את הצלחת לכסות אותו ברדיד אלומיניום, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות ב מטרף.
- להוסיף 25 µL של Streptavidin-Phycoerythrin פתרון טוב לכל, לאטום את הצלחת לכסות אותו ברדיד אלומיניום, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על מטרף.
- במקום את הצלחת על דסקית צלחת מגנטית. לתת לבאלגן עבור 1 דקות ואז וארוקן את תוכן טוב. להוסיף 200 µL שטיפת מאגר לכל טוב. לתת לבאלגן עבור 1 דקות ואז וארוקן את תוכן טוב. חזור שוב על לשטוף את.
- להוסיף 150 µL של נוזל הנרתיק כדי אחד טוב ומניחים את הצלחת על מטרף למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי resuspend את החרוזים נוגדן.
- לקרוא הצלחת מיידי באמצעות החרוז assay מולטיפלקס צלחת reader מבוסס ולנתח את ריכוזי ציטוקין שימוש באלגוריתם פריסטלטיות 5-פרמטר. תרשים זרימה כללי של דמעה ציטוקין פרופיל מוצג באיור 1.
- קורא את צלחת assay (כלי להגדיר) וניתוח נתונים:
- לעבור על החרוז המבוסס על הקורא assay מולטיפלקס וחמים קדם ללייזר במשך 30 דקות
- להפעיל את התוכנה assay מולטיפלקס חרוז מבוסס. תחת ' אוטומטי תחזוקה ' בכרטיסיה, בחר ' כיול-אימות ' אפשרות. מערבולת ריאגנט כל בקבוקון של חרוזים כיול ואימות עבור 30 ס' המקום 5 טיפות כל ריאגנט לתוך הבארות המיועד. למלא את המאגרים המיועד יונים אתנול מים ו- 70%-
- יצירת פרוטוקול חדש
- לפתוח ' פרוטוקולים ' דף ולאחר מכן ' פרוטוקולים ' טאב לחץ " ProtocolŔ חדש ליצור ' הגדרות ' tab יפתח.
- , ' שם ', הקלד את השם של הפרוטוקול.
- הקלד תיאור בתיבה מימין ' שם ' תיבת.
- , ' גירסה ', הקלד את גירסת הפרוטוקול.
- , ' יצרן ', הקלד את פרטי היצרן עבור הפרוטוקול.
- להגדיר בהגדרות ' רכישת הגדרות ' סעיף כדלקמן. הגדר ' נפח ': 100 µL, ' פסק זמן ': 60 s; ' DD Gating ': 8,000 עד 15,000; ' הגברה לכתב ': PMT רגיל; ' חרוז סוג ': חרוז מגנטי.
- להגדיר בהגדרות ' ניתוח ההגדרות ' סעיף, בחירת ' כמותי ' כסוג ניתוח. הגדר ' מספר תקנים ': 6; ' מספר פקדים ': 0; שנתות ' מתכוון של משכפל ' תיבה;
שנתות ' לנתח את התוצאות תוך השגת דגימות ' תיבת. - לחץ על " NextŔ ' Analytes ' טאב נפתח, לחץ על analytes הרצוי (חרוז ID) ברשת ממוספרות analyte.
- לחץ והקלד analyte המתאים שם, ' שם ' עמודה מימין של רשת analyte (analytes ' להתכנסויות האזור המקביל שלהם חרוז הוזכרו טבלה 1).
- לחץ והקלד את יחידת המידה (קרי pg/mL) הרצויה ' יחידות ' בתיבה משמאל ' להחיל כל ' לחצן. לאחר מכן לחץ על " להחיל את כל ".
- לחץ והקלד החרוז הרצוי שווה כל analyte (דהיינו 50) ב ' ספירת ' התיבה. לחץ על " את כל ".
- לחץ " NextŔ בכרטיסיה פריסה צלחת נפתח. לסמן את הבארות סטנדרטים, בחר " 2 " תחת לשכפל את ספירת ולחץ על " S " לחצן לא סטנדרטיים. חזור על שלב זה עבור הרקע " B " ודוגמאות " U " וולס.
- לחץ על " להציל ".
- ליצור הרבה סטנדרטים/פקד חדש
- פתח ' פרוטוקולים ' בעמוד, ולאחר מכן ' סטנדרטים & פקדים ' בכרטיסיית לחץ " ליצור הרבה תקן/פקד חדש ".
- פתח ' בחר בפרוטוקול ' תיבת. בחר את הפרוטוקול שנוצר בשלב 1.5.3.
- מפתח את המידע תקנים בהתאם: Std/Ctrl קיט, Std/Ctrl שם קיט, תפוגה ומספר היצרן.
- מפתח בערך ברמה הגבוהה ביותר עבור כל analyte (דהיינו 10000 pg/mL). מפתח 5 תחת דילול ולאחר מכן לחץ על " להחיל כל " כדי להפיק באופן אוטומטי הריכוזים הצפוי להמשך הסטנדרטים.
- לחץ על " להציל ".
- ליצור אוסף חדש של פרוטוקול הקיימים
- פתח ' אצוות ' הדף ולחץ על " ליצור כרטיסיה חדשה אצווה של פרוטוקול הקיים ".
- להקליד את השם אצווה ' אצווה בשם ' בתיבה, הקלד תיאור אודות האצווה ב ' הזן תיאור אופציונלי ' תיבת.
- לחץ על פרוטוקול שנוצרו בעבר (בשלב 1.5.3).
- לחץ על " NextŔ הכרטיסייה הבא שנפתח הוא ' מחלות מין & Ctrls ' בכרטיסיית להציג את הפרטים של סטנדרטים assay ובחר " הבאה ".
- -' פריסת לוח ' טאב, להקצות פקודות טוב עבור אצווה זו, לחץ על " להציל " כדי לשמור מידע אצווה ' אצווה ממתינה ' רשימת.
- לטעון את הצלחת לקורא צלחת assay מולטיפלקס חרוז מבוסס, לנער את זה במשך 5 דקות ולהפעיל את האצווה מתוך רשימת אצווה ממתינה. הנתונים רכשה יישמרו בתבנית הקובץ. csv.
- ניתוח נתונים
- להמיר את הקובץ. csv שנוצר מתוך התוכנה assay מולטיפלקס חרוז מבוסס לתבנית הקובץ (קובץ נתונים תוצאות) .rbx שימוש בתוכנת המרה rbx. להפעיל את תוכנת ההמרה, בחר את הקובץ. csv תחת xPONENT בחר קבצים, לחץ על " ליצור " כפתור; .rbx הקובץ יישמרו בתיקיה הפלט שנבחר.
- להפעיל את תוכנת ניתוח ופתח את הקובץ .rbx.
- לייעל את עקומות רגיל באמצעות עקומת 4PL/5PL מתאים.
- בחר את הפעולות הבאות לפי ' עיקול רגיל ' טאב: ' סוג רגרסיה ': ' לוגיסטיים-5PLƆ ' ציר טרנספורמציה ': ' Log(x) - ליניארי (y) Ɔ שנתות ' הצג קווי טווח ריכוז או משחק ' תיבת; לתקתק ' להראות לא ידוע דוגמאות ' התיבה; שנתות ' להראות דוגמאות שליטה ' התיבה; שנתות ' החל על פני כל analytes ' התיבה; שנתות ' להציג דוח לאחר אופטימיזציה ' תיבת.
- לחץ " מטב " כפתור auto-אופטימיזציה.
- לתייג את הזהויות הדגימה תחת ' להזין פרטי מדגם ' בכרטיסיית
- להשיג את ריכוזים נצפתה ב ' דוח טבלת ' טאב ולאחר מכן לחץ על " לייצא דוח טבלת " כדי ליצור את הנתונים בקובץ הגיליון האלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דמעה דגימות נאספו מעיני 8 4 נושאים בריא באמצעות רצועות זרימה דמעה, רמות ציטוקינים נותחו באמצעות פרוטוקול שהוזכרו לעיל. כל הנבדקים היו זכר והיה הגיל של הנושאים ארבע שנים 36, 42, 44, 52 בהתאמה. עין יבשה ובריאות משטח עינית המחלה הוערך על ידי מבחנים קליניים (מדמיע מעבר הסרט את הזמן, של Schirmer מבחן, מכתים הקרנית, צביעת conjunctival, המכסה/meibomian בלוטת בדיקה, מדמיע הקרנית סימנים חזותיים וסימנים) על פי הסדנה עין יבשה הבינלאומית, 2007 הנחיות ואף אחד הנושאים הראה כל סימנים ותסמינים של מחלת עיניים יבשות. 31
מתוך 41 ציטוקינים מנותח, ציטוקינים 31 אותרו כל הדגימות דמעה, IL-17A, MIP-1β ו- TNF-α אותרו ב-7 עיניים של נושאים 4, IL-4 זוהה בעיניים 6 4 נושאים, IFN-γ זוהה בעיניים 6 3 נושאים, IL-1A זוהה בעיניים 5 של 3 subj ects, eotaxin ו- IL-9 אותרו בעיניים 3 נושאים 2, IL-3 זוהה 1 עין ו MIP-1α באף אחד של הדגימות. זאת אומרת ± SD הריכוזים של ציטוקינים 41 זוהה לנסיינים בריאים באמצעות חרוז מבוסס מולטיפלקס assay (איור 2) הוזכרו בטבלה מס ' 2. מתוך 41 ציטוקינים מנותח, IL-1ra היה למצוא להתבטא מאוד כל הדגימות עם זאת אומרת ± SD של 203.9 ± 52.6 ng/mL, והוא נע בין ננוגרם למ"ל 129.64 אל 271.7 ng/mL. ציטוקינים IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, IL-8, EGF, PDGF-BB, VEGF ו- G-CSF היו גם מאוד לידי (ng/mL כמויות) הדמעות של הנבדקים בריא והביע ציטוקינים הנותרים היו בכמויות pg/mL (טבלה 2). הריכוז נמדד הנמוך ביותר של ציטוקינים מדמיע TNF-α עם זאת אומרת ± SD של 27.25 ± 19.97 pg/mL, נע בין 10.75 pg/mL אל 56.02 pg/mL. ציטוקינים 31 אשר אותרו כל הדגימות, אף אחד לא הראו הבדל משמעותי סטטיסטית בריכוז (p> 0.05) בין העין ימינה ושמאלה על ידי t-test (איור 3).
איור 1: תרשים זרימה סכמטי של דמעה ציטוקין פרופיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לקרוע ציטוקין פרופילים של אנשים בריאים. נציג scatterplot מציג יומן זאת אומרת ± SD ריכוזים של ציטוקינים 41 ב לקרוע הדגימות שנאספו מן הנבדקים בריא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: פרופיל דמעה העין בין ציטוקינים הבדלים לנסיינים בריאים. נציג scatterplot מראה הבדל משמעותי סטטיסטית (p> 0.05) בריכוזים רשע הבין-עין של 31 לקרוע ציטוקינים במקצועות בריא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| ס מס | Analytes | אזור חרוז |
| 1 | EGF | 12 |
| 2 | FGF-2 | 13 |
| 3 | Eotaxin | 14 |
| 4 | TGF-Α | 15 |
| 5 | G-CSF | 18 |
| 6 | טיסה - 3L | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | Fractalkine | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | GRO | 26 |
| 12 | IL-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | IL - 12P 40 | 29 |
| 15 | טופ איט אפ | 30 |
| 16 | IL - 12P 70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17A | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1Α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1Β | 46 |
| 27 | IL-2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | IL-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | IL-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1Α | 72 |
| 37 | MIP-1Β | 73 |
| 38 | RANTES | 74 |
| 39 | TNFΑ | 75 |
| 40 | TNFΒ | 76 |
| 41 | VEGF | 78 |
טבלה 1: Analytes' שמות ופרטים האזור המקביל חרוז.
| ס מס | ציטוקין | מספר העיניים | מספר נושאים | זאת אומרת ריכוזים | SD |
| 1 | EGF | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | Eotaxin | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | FGF-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | טיסה - 3L | 8 | 4 | 475.4 | 133.6 |
| 5 | Fractalkine | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | G-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28.1 |
| 8 | GRO | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641.4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76.6 | 42.81 |
| 11 | IL-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41.52 |
| 12 | IL-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | IL-12 |
בטבלה 2: דמעה ציטוקין פרופילים במקצועות בריא. מתכוון ± SD ריכוזים של ציטוקינים 41 זוהה לנסיינים בריאים שימוש assay מולטיפלקס חרוז מבוסס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ציטוקינים הם החלבונים המופרש קטנה חזק מאפננים המערכת החיסונית ויסות תגובות מערכת החיסון. 32 את פרופילי ביטוי של ציטוקינים שונים בדמעה דגימות קשורות לתנאים פתולוגיים שונים של העין, מחקרים על ציטוקין פרופילים לעזור להבין את מנגנוני פתוגנזה המחלה, לקבוע את המצב של בריאות עינית, חומרת המחלה, האבחון והתקדמות. 2 , ריכוז חלבון נמוך יותר 5 כרכים מדגם קטן האתגרים העיקריים של שיטות מסורתיות, הגבלת השימוש של מבחני כמו אליסה לניתוח של דמעה ציטוקין פרופילים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. 33 מבחני מולטיפלקס חרוז מבוסס הם immunoassays, אשר יש יתרונות ברורים על פני אליסה. מבחני מולטיפלקס חרוז מבוססת דורשים אחסון מדגם קטן יותר לניתוח של analytes מרובות, רגישה מאוד, מסוגל מזהה picogram ריכוזי חלבונים נוזלים ביולוגיים. 34
כאן אנחנו מדווחים על פרוטוקול סטנדרטיים לניתוח כמותי של ציטוקינים מדמיע 41 בקרב אנשים בריאים שימוש assay מולטיפלקס חרוז מבוסס. מתוך ציטוקינים 41 בלוח, חרוז מבוסס assay מולטיפלקס זוהה ציטוקינים 40 בדגימות דמעה, לא היתה אפשרות לזהות MIP-1α. תוצאה שלילית זו ייתכן כי היו רמות לא לגילוי של MIP-1α בדגימות מדמיע בריא או בשל אמצעי אחסון קטן יותר של דמעות. דוגמאות מדמיע נאסף באמצעות רצועות Schirmer יש יתרון על פני שיטות אחרות אוסף כמו צינור microcapillary וספוגים. למשל, מספר תנאים קליניים, נפח נוזלים מדמיע ניתן למדוד ע י רצועות Schirmer הקרע נוזל יכול להיות eluted מרצועת אותו לאחר מדידה ומשמש לניתוח ציטוקין. 35 למרות microcapillary צינורות משמשים באופן שגרתי כדי לאסוף דמעות לייצר פרופילים עקבית יותר מדמיע, ההליך לוקח יותר זמן מאשר בשיטת סטריפ, יותר מייגע, יכול להיות לא נוח לילדים, חולים אחרים. יתר על כן, שיטה זו עשויה גם זירוז ייצור רפלקס דמעה על-ידי נגיעה הלחמית, לתוצאות משתנה של פרופילים ציטוקין בהשוואה דמעות הבזליים, ובכך להשפיע על הפארמצבטית של וזמינותו. 36 בתנאים קליניים מסוימים כמו מחלת עיניים יבשות, אוסף דגימה דמעה על ידי רצועות Schirmer אמין לניתוח חלבון ומסייעת הזיהוי של סמנים ביולוגיים. 37 , 38
מבחני מולטיפלקס חרוז המבוסס על שילוב של cytometry זרימה, דיאגנוסטיקה מולטיפלקס שבו הם analytes במדגם דחוקה בין נוגדן ספציפי מצופה צבע מקודד beads מגנטי או נוגדן זיהוי microspheres ו- biotinylated. מכלולים אלה יכולים יזוהו על-ידי הוספת כתב Streptavidin-Phycoerythrin (PE) המולקולה המספר המשלים את וחשיפה עוקבות מערכת לייזר כפולה מכשיר מבוסס cytometry זרימה ששונה. 39 במערכת כפולה לייזר, לייזר אחד מלהיב את צבעי הפנים ומייצג את האות שלה מצופים נוגדן ספציפי. הלייזר השני מרגש דיווח את המספר מולקולה PE המשלים מאוגדים הנוגדן גילוי. מורכבים ולייצג עוצמת האותות הריכוז של analyte.
היכולת של microspheres להיות מקודד עם צבע של עוצמות שונות מאפשרות וזמינותו לזהות עד 100 analytes שונים באמצעי אחסון קטן מדגם לבאר בודדת. 39 למרות חרוז המבוסס על מבחני מולטיפלקס הם מהירה, הדירים להשוות מבחני אליסה סטנדרטי,34,40 שיטה זו דורשת כלים ייעודיים, הערכה של ערכות, סטנדרטיזציה של פרוטוקולים דגימות ביולוגיות שונות. 39 אוטומטי-נוגדנים בדגימות קליניות עשוי להשפיע התוצאות מולטיפלקס חרוז מבוסס. 34 , 39 לשימוש שוטף של אלה מבחני בהגדרות קליניים, הומלץ להשתמש ערכות assay מיצרן ספציפי אחד. הרגישות, זיהוי של ריכוז מוחלט של ציטוקינים, ו הפארמצבטית דווחו להשתנות עם ערכות שונות. 41 נוגדן מיקרו-מערכים או מיקרו-מערכים ממברנה רגישים מאוד, טכניקות זולות תפוקה גבוהה חלופי אשר לזהות analytes מרובים נפח קטן של דוגמאות, יכול להיות מיושם בהצלחה על קורע דוגמאות לניתוח של ציטוקינים וחלבונים אחרים. 35 , 42 . אולם, מגבלות רבות קיים, כמו אלה מבחני זמן רב, דו כמותי, שהפגינו יחס אות לרעש גבוה, חוסר פרוטוקולים סטנדרטיים. 19 , 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף. אין עניין פיננסי או ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודות המחקר נתמך על ידי המענק מרכז של טאן תיק תק סנג החולים מותאמת אישית מטכנאים זרע מימון תוכנית 2015; סינגפור העין מחקר מכון טייס גרנט וגובה טאן תיק תק סנג החולים לקרן הענק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
