Summary
ويساعد تحليل السيتوكينات الفيلم المسيل للدموع في دراسة أمراض العين المختلفة. حبة على أساس متعدد فحوصات بسيطة وحساسة وتمكين اختبار أهداف متعددة في العينات بكميات صغيرة. هنا يمكننا وصف بروتوكول للمسيل للدموع الفيلم سيتوكين التنميط باستخدام حبة على أساس مقايسة متعدد.
Abstract
الفيلم المسيل للدموع هو خليط معقد من الدهون والبروتينات والمعادن الذي يغطي السطح الخارجي للعين، وبالتالي توفير تزييت والتغذية والحماية للخلايا الأساسية. تحليل للدموع مجالاً ناشئاً للتعرف على المؤشرات الحيوية للتنبؤ، والتشخيص، والتشخيص لأمراض العين المختلفة. دموع يمكن الوصول إليها بسهولة وجمعها غير الغازية. ولذلك، تكتسب التكنولوجيات المتقدمة مكانة بارزة للتعرف على تحليلها متعددة في البكاء لدراسة التغيرات في تركيبة البروتين أو المستقلب وارتباطها بالحالات المرضية. السيتوكينات المسيل للدموع هي المؤشرات الحيوية مثالية لدراسة صحة سطح العين، ويساعد أيضا في فهم آليات مختلفة اضطرابات سطح العين مثل مرض جفاف العين والتهاب الملتحمة ربيعي. حبة على أساس متعدد فحوصات لديها القدرة على الكشف عن تحليلها متعددة في كمية صغيرة من العينة مع حساسية أعلى. هنا يمكننا وصف بروتوكول موحد لجمع العينات المسيل للدموع، واستخراج وتحليل التنميط سيتوكين استخدام حبة على أساس مقايسة متعدد.
Introduction
الدموع تنتجها الغدة الدمعية والغدد الملحقة ومعطف على السطح الخارجي للعين. فيلم المسيل للدموع ويتكون من طبقة دهن خارجي وطبقة مائية داخلية يتضمن البروتينات القابلة للذوبان، موكنيس والغشاء ملزمة موكنيس. دموع منع الغزو الميكروبي وتوريد المواد الغذائية وتوفير تزييت لسطح العين. دموع العمل كوسيط بين الهواء والأنسجة لنقل الأوكسجين إلى القرنية. تتكون من البروتينات والكربوهيدرات والدهون والأملاح 1 الفيلم المسيل للدموع. الرابطة بين البروتينات المسيل للدموع بأمراض العين والجهازية مثل الزرق، مرض جفاف العين، التهاب الملتحمة ربيعي، ومرض البول السكري، تم التعرف على أوربيتوباثي المرتبطة بالغدة الدرقية، وسرطان في العديد من الدراسات. 2 , 3 , 4 ويمكن جمع عينات المسيل للدموع بأنابيب ميكروكابيلاري أو شرائط تدفق المسيل للدموع (شرائط شيرمر). بالإضافة إلى ذلك، هو اختبار شيرمر إجراء قياسية المنجز في القرنية وعيادات الجراحة الانكسارية، النتائج التي قد تستعمل لفحوصات التحليل سيتوكين. جمع العينات عدم الغازية، إمكانية الحصول على بيو-العينة، والرابطة لتكوين المسيل للدموع مع مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية تجعل الدموع الفيلم مصدرا محتملاً للمؤشرات الحيوية لعدة أمراض العين والجهازية. 4 , 5 , 6
المسيل للدموع السيتوكينات دوراً هاما في دراسة الصحة سطح العين والظروف الملتهبة من أمراض العين المختلفة. 7 أبلغ عن تركيزات غير طبيعية من السيتوكينات عدة في عينات المسيل للدموع مرتبطة بمرض العين الجافة ورمد ربيعي (فكك) ورمد التاتبيه (AKC)، والتهاب الملتحمة التحسسي الموسمي والتهاب القزحية. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 يمكن أن تحلل البروتينات المسيل للدموع بالطرق التقليدية مثل الطيف الكتلي، النشاف الغربية وفحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). 14 , 15 ولكن القيود المفروضة على هذه الأساليب هي حساسية الفقراء وحجم أكبر من العينة المطلوبة لتحليل متعددة السيتوكينات المسيل للدموع في كل مريض. 16 , 17 حبة على أساس متعدد فحوصات أعدت لتحليل التحاليل متعددة في عينات خليط معقد وتطبيقها بنجاح على عينات المسيل للدموع لتحليل السيتوكينات متعددة في مختلف الأمراض. 6 , 18 ألف الجمع بين ساندويتش أليسا وتقنيات قياس التدفق تمكين هذه فحوصات لتصبح أكثر حساسية من أليسا للتحديد الكمي لتحليلها متعددة في نموذج واحد. 19 ويمكن تطبيق هذا الأسلوب على مجموعة متنوعة من العينات السريرية و supernatants ثقافة الخلية ويساعد في دراسة الاستجابات المناعية في العديد من الشروط الفيزيولوجية المرضية. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
وهناك عدة دراسات مقارنة حبة على أساس متعدد فحوصات مع أليسا وأبلغت عن وجود ارتباط بين الأساليب. حبة et al. ، مقارنة مع الحمام على أساس مقايسة متعدد مع أليسا التقليدية للكشف عن الاديبونكتين، ريسيستين، اللبتين وجريلين في عينات المصل أو البلازما البشرية وذكرت علاقة قوية (r > 0.9) بين فحوصات. 25 دوبون وآخرون عن ارتباط قوي بين حبة على أساس متعدد فحوصات وإليزا للكشف عن إيل-1β، إيل-4، وايل-5، وايل-6، إيل-10، إيفن-ϒ، وتنف-α في فيتوهيماجلوتينين وليبوبوليساكتشاريدي وحفز كل الدم جمع من النساء الحوامل. 26 بيكرينغ وآخرون عن آخر علاقة قوية بين حبة على أساس متعدد المقايسة وإليزا للكشف عن أضداد المصل النزلة بنوع السكاريد (r = 0.96)، toxoids الكزازيه clostridium (r = 0.96)، و وتدية خناقية (r = 0.91). 27 بياجيني وآخرون عن ارتباط إيجابي عالية (r = 0.852) بين حبة على أساس متعدد المقايسة وإليزا للكشف عن عصيات الجمرة الخبيثة المضادة-PA مفتش في عينات مصل الدم. 28 وانغ وآخرون عن ارتباط بين حبة على أساس متعدد المقايسة وإليزا للكشف عن مرض الزهايمر المؤشرات الحيوية اميلويد بيتا 42 (r = 0.77)، مجموع تاو (r = 0.94)، وتأو فوسفوريلاتيد في الحمض الأميني 181 (r = 0.82) في عينات السائل الدماغي النخاعي. 29 هذه الدراسات قد أظهرت مدى انطباق حبة استناداً إلى فحوصات متعدد متنوعة من العينات السريرية ومتطلبات حجم عينة أصغر وارتباط مع أليسا القياسية، التي تجعل حبة على أساس متعدد فحوصات مبشرة بالخير بديل للطرق التقليدية إليزا للكشف عن تحليلها متعددة في نوع مختلف من العينات في أمراض مختلفة تعمل. هنا يمكننا وصف بروتوكول موحد للمقايسة حبة على أساس متعدد سيتوكين التنميط لتحليلها 41 في المسيل للدموع عينات جمعت من الأصحاء باستخدام شرائط شيرمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة وقد أقرها المجلس الاستعراض المؤسسي مستشفى تان توك سنج، سنغافورة-
1-تحليل سيتوكين "المسيل للدموع"
- جمع الدموع:
- طرح هذا الموضوع الجلوس بشكل مريح على كرسي فحص ووضع رأسه صفحته/صفحتها ضد مسند الرأس.
- طرح هذا الموضوع البحث عن وفتح مدرجات شيرمر (مصنوعة من ورق الترشيح Whatman رقم 41) بعناية ووضع نهاية مقربة من قطاع غزة على فورنيكس أقل شأنا من العين والإيعاز إلى هذا الموضوع لإغلاق العينين لمدة 5 دقائق. حين جمع الدموع تولي عناية كبيرة لتقليل اتصال سطح العين. 30
- طرح هذا الموضوع لفتح صفحته/صفحتها العينين إزالة الشريط ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل. الأنبوب نقل فورا إلى المختبر أو مخزن في-80 س ج حتى اختبار للتنميط سيتوكين.
- شطف عينة دمعة من قطاع تدفق المسيل للدموع:
- قطع قطاع تدفق المسيل للدموع على طول 0.5 سم (لتوحيد كمية الدموع لفحصها) ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل.
- إضافة 30 ميليلتر من الاعتداء المخزن المؤقت واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق تليها سينتريفوجينج الأنبوبة في 14,000 س ز 1 دقيقة نقل المادة طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل آخر
- وتجاهل قطاع غزة. ضع العينة تحتوي على أنبوب على الجليد واستخدام نموذج التيد المسيل للدموع فورا للتنميط سيتوكين.
- إعداد الكواشف:
ملاحظة: يتم تحليلها واحد وأربعون لفحصها في كل عينة بحبه على أساس مقايسة متعدد انترلوكين (إيل)-1α، 1β إيل، إيل-Rα، وايل-2، إيل-3، إيل-4، وايل-5، إيل-6، وايل-7، إيل-8، إيل-9، وايل-10، إيل-12 p40، و p70 إيل-12، إيل-13، إيل-15، إيل-17A، الانترفيرون ألفا (IFN-α) 2, IFN-γ، IFN-غاما-إيندوسيبلي البروتين 10 (IP--10، CXCL10)، المستمدة من بلعم chemokine (حركة التغيير الديمقراطي) والبروتين التحريضية بلعم (MIP)-1α وخطة التأمين الطبي-1β، الوحيدات بروتين تشيموتاكتيك (MCP)-1، العملية التشاورية المتعددة الأطراف-3، عامل نخر الورم-ألفا (تنف-α)، تنف-β، ينظم النمو السرطاني (غرو)، عامل نمو الورم ألفا (TGF-α)، عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وعامل نمو البشرة (مماثلة)، وتنتجها الخلايا الليفية عامل النمو (صندوق الأجيال القادمة)-2، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF)-AA، PDGF-AB/BB، عامل تحفيز مستعمرة المحببات (ز-CSF)، وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (GM-CSF)، اوتاكسين، فراكتالكيني، يجند CD40 القابلة للذوبان (sCD40L)، مثل المكتب الاتحادي للهجرة تيروزين كيناز 3 يجند (أنطوني-3 لتر) وينظم عند التنشيط، أعرب تي خلية عادي ويفرز البروتين (رانتيس).- تجلب قارورة الحل (50 س) حبة جسم إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 س ج) ودوامه القنينات للحد الأدنى 1
- إحصاء عدد الآبار المطلوبة للمقايسة، وحساب كمية جسم مجموع حبة كوكتيل الحل (25 ميليلتر للبئر الواحد)، وكل حل حبة جسم (50 س) المطلوبة للفحص.
- إعداد كوكتيل الحل عن طريق إضافة المبلغ المحسوب لكل جسم حبة الحل والتعبئة إلى الحجم النهائي المطلوب بإضافة المبلغ المتبقي من حبة مادة. تأكد من أن التركيز النهائي لكل جسم في الكوكتيل 1 X. تعد دائماً على الأقل 20% حجم إضافي لحل كوكتيل في حالة حدوث أخطاء بيبيتينج.
ملاحظة: على سبيل مثال، مقايسة 96-جيدا إعداد 3000 ميليلتر من جسم حبة كوكتيل الحل. المبلغ المطلوب لكل جسم حبة حل = تركيز 3000/المخزون لكل حل حبة جسم؛ 3000/50 = 60 ميليلتر من كل جسم حبة حل- إضافة 60 ميليلتر لكل حل من الحلول حبة جسم 41 (60 × 41 = 2460 ميليلتر) في حفل كوكتيل زجاجة وإضافة 540 ميليلتر لحل مادة حبة إلى الخليط حبة جسم جعل 3000 ميليلتر من النهائي حل العامل (1 X)-
- ميكس الحل كوكتيل حبة قبل الاستخدام، بشكل صحيح. بعد الفحص تخزين حجم المتبقي في 2-8 س ج لمدة تصل إلى 30 يوما-
- إعداد ضوابط الجودة (QC) عن طريق إضافة 250 ميليلتر منزوع الماء إلى مخزون 1 ضمان الجودة ومراقبة الجودة 2-
- مزيج بشكل صحيح بعكس الزجاجات عدة مرات ودوامه لنقل س. 10 الحل صحيح المسمى أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي وتخزين الحل المتبقي في-20 درجة مئوية ويمكن أن تستخدم لمدة تصل إلى 30 يوما-
- إعداد المخزن المؤقت عن طريق إضافة منزوع 270 مل من الماء إلى 30 مل 10 X يغسل يغسل الحل المخزن المؤقت ومزيج جيد (قبل التخفيف، جلب المخزن المؤقت X 10 إلى درجة حرارة الغرفة وحل جميع رواسب الملح بالاختلاط). تخزين المخزن المؤقت الغسيل غير المستخدمة (1 س) في 2-8 درجة مئوية ويمكن أن تستخدم لمدة تصل إلى 30 يوما-
- إعداد المخزون سيتوكين البشرية الموحدة (10,000 بيكوغرام/مل لجميع التحاليل) بإضافة 250 ميليلتر منزوع الماء إلى القنينة الأسهم. المزيج جيدا بعكس عدة مرات ودوامه القنينة 10 س. السماح لها بالوقوف لمدة 10 دقائق ونقل الأسهم حل المسمى أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي بشكل صحيح. وبعد الفحص، تخزين الحل المتبقي في-20 درجة مئوية، ويمكن أن تستخدم لمدة تصل إلى 30 يوما-
- إعداد معايير سيتوكين البشري العامل بتخفيف المسلسل 5 إضعاف (50 ميليلتر-> 200 ميليلتر) مع فحص المخزن المؤقت للحصول على 2000، 400 و 80، 16، و 3.2 بيكوغرام/مل.
- بعد إعداد قياسية، استخدام معايير العمل داخل 60 دقيقة واستخدام المخزن المؤقت المقايسة فارغة/الخلفية (-pg/mL)-
- سيتوكين التنميط بحبه على أساس مقايسة متعدد:
- إحضار جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة ودوامه 5-10 ثوان قبل إضافتها إلى لوحة ميكروتيتير 96-جيدا. إذا كان يتم تخزين العينات التيد المسيل للدموع في-80 س ج قبل الفحص، ذوبان الجليد مقتطفات المجمدة المسيل للدموع على الجليد والطرد المركزي في ز 1000 X للحد الأدنى 5
- إعداد ورقة عمل مقايسة في تكوين رأسي للعمل معايير سيتوكين البشرية [0 (فارغ)، 3.2، 16، 80، 400، 2,000، و 10,000 بيكوغرام/مل]، QC1، QC2 وعينات.
- إضافة 200 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل جيد من اللوحة وختم ذلك مع لوحة السدادة ويبقيه على شاكر لوحة في درجة حرارة الغرفة (20-25 س ج) للحد الأدنى 10
- صب X 1 يغسل المخزن المؤقت بعكس اللوحة والاستفادة من ذلك على المناشف الماصة عدة مرات لإزالة أي المبلغ المتبقي من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في الآبار.
- عينات في الآبار المناسبة وإضافة 25 ميليلتر من كل العامل البشري سيتوكين القياسية، QC1، QC2، فارغة (مقايسة المخزن المؤقت).
- ميليلتر 25 إضافة الإنزيم المخزن المؤقت في كل بئر-
- إضافة 25 ميليلتر من 1 X جسم حل كوكتيل حبة في كل بئر. كما أن الحل حبة جسم حساسة للضوء، ختم اللوحة مع لوحة السدادة وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم لحمايتها من الضوء أثناء الفحص.
- احتضان اللوحة في 4 س ج بين عشية وضحاها على شاكر.
- وضع اللوحة على الرف لوحة الغسالة التلقائي لوحة مغناطيسية. فلنجلس لمدة 1 دقيقة لتسوية الخرز المغناطيسي في الجزء السفلي من البئر ونضح المحتويات جيدا. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ليغسل كل بئر والسماح لها الجلوس لمدة 1 دقيقة وثم نضح المحتويات جيدا. تكرار الغسيل مرة أخرى (للوح الغسيل، تتبع الشركة المصنعة مجموعة ' تعليمات s)-
- إضافة 25 ميليلتر للكشف عن الأجسام المضادة للحل في كل جيدا، ختم اللوحة وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة على شاكر.
- إضافة 25 ميليلتر من ستريبتافيديالحل فيكوريثرين ن في كل بئر، ختم اللوحة وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر-
- وضع اللوحة على غسالة لوحة مغناطيسية. السماح لها الجلوس لمدة 1 دقيقة وثم نضح المحتويات جيدا. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ليغسل كل بئر. السماح لها الجلوس لمدة 1 دقيقة وثم نضح المحتويات جيدا. تكرار الغسيل مرة أخرى.
- إضافة 150 ميليلتر من السوائل غمد كل جيدا ووضع اللوحة على شاكر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ريسوسبيند الخرز جسم. قراءة لوحة فورا باستخدام حبة على أساس مقايسة متعدد قارئ لوحة
- وتحليل تركيزات سيتوكين باستخدام خوارزمية المنحنى لتركيب 5-المعلمة. ويرد في الشكل 1 رسم تخطيطي تدفق التنميط سيتوكين المسيل للدموع-
- قراءة لوحة المقايسة (إعداد الصك) وتحليل البيانات:
- التبديل على حبة على أساس مقايسة متعدد قارئ والدافئة قبل الليزر للحد الأدنى 30
- إطلاق البرنامج حبة على أساس مقايسة متعدد. تحت ' "الآلي صيانة" ' التبويب، حدد ' المعايرة-التحقق ' الخيار. قطرات دوامة كل كاشف فيال من الخرز والمعايرة والتحقق عن 30 س. 5 مكان لكل كاشف في الآبار المعينة. ملء الخزانات المعينة مع الإيثانول منزوع الماء و 70%-
- إنشاء بروتوكول جديد
- فتح ' البروتوكولات ' الصفحة ومن ثم ' البروتوكولات ' التبويب انقر فوق " إنشاء ProtocolŔ جديدة ' إعدادات ' سيتم فتح علامة التبويب.
- في ' اسم '، اكتب اسم البروتوكول.
- اكتب وصفاً في مربع الحق في ' اسم ' مربع.
- في ' الإصدار '، اكتب إصدار البروتوكول.
- في ' الشركة المصنعة '، اكتب معلومات الشركة المصنعة للبروتوكول.
- تعريف الإعدادات في ' "الحصول على إعدادات" ' الفرع كما يلي. تعيين ' حجم ': 100 ميليلتر، ' مهلة ': 60 ثانية؛ ' النابضة DD ': 8,000 إلى 15,000؛ ' مكسب مراسل ': PMT القياسية؛ ' حبة نوع ': حبة المغناطيسي.
- تعريف الإعدادات في ' "إعدادات تحليل" ' الباب، تحديد ' الكمي ' كنوع التحليل. تعيين ' عدد من معايير ': 6؛ ' عدد من عناصر التحكم ': 0؛ ضع علامة ' "يعني ليتطابق" ' مربع؛
التجزئة ' تحليل النتائج في حين الحصول على عينات ' مربع- - انقر فوق " NextŔ ' تحليلها ' علامة التبويب يفتح، انقر على التحاليل المطلوبة (حبة معرف) في شبكة رقمية أكثر.
- انقر فوق واكتب اسم أكثر المقابلة في ' اسم ' عمود إلى يمين الشبكة أكثر (تحليلها ' أسماء وتفاصيل المنطقة الخاصة بهم المطابق حبة المشار إليها في الجدول 1).
- انقر فوق واكتب المطلوب وحدة القياس (أي pg/mL) في ' وحدات ' المربع إلى اليسار ' "تطبيق جميع" ' زر. ثم انقر فوق " "تطبيق جميع" "-
- النقر والكتابة عد حبة المنشود لكل أكثر (أي 50) في ' عدد ' مربع. انقر فوق " تطبيق كافة "-
- انقر فوق " NextŔ فتح علامة التبويب "تخطيط اللوحة". تسليط الضوء على الآبار للمعايير وتحديد " 2 " تحت تكرار العد وانقر فوق " S " زر القياسية. كرر هذه الخطوة للخلفية " ب " وعينات " يو " الآبار.
- انقر فوق " حفظ ".
- إنشاء الجديدة معايير/مراقبة الكثير
- مفتوحة ' البروتوكولات ' الصفحة، ومن ثم ' المعايير & الضوابط ' التبويب انقر فوق " "إنشاء الكثير" القياسية/عنصر التحكم الجديد ".
- مفتوحة ' "تحديد بروتوكول" ' مربع. حدد البروتوكول الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.5.3.
- الرئيسية في معلومات المعايير تبعاً لذلك: الأمراض المنقولة جنسياً/Ctrl طقم عدد الأمراض المنقولة جنسياً/Ctrl كيت، وانتهاء الصلاحية واسم الشركة المصنعة.
- مفتاح القيمة لأعلى مستوى لكل أكثر (أي 10000 pg/mL). مفتاح في 5 بإضعاف، وانقر فوق " "تطبيق جميع" " لتوليد تلقائياً التركيزات المتوقعة لبقية المعايير.
- انقر فوق " حفظ ".
- إنشاء "دفعة جديدة" من وضع بروتوكول موجودة
- مفتوحة ' دفعات ' الصفحة، وانقر فوق " إنشاء علامة تبويب "دفعة جديدة" من وضع بروتوكول موجودة ".
- اكتب اسم المجموعة في ' "اسم دفعة" ' المربع ثم اكتب وصفاً عن الدفعة في ' "أدخل وصف اختياري" ' مربع.
- انقر فوق البروتوكول التي تم إنشاؤها مسبقاً (في الخطوة 1.5.3).
- انقر فوق " NextŔ علامة التبويب التالي الذي يفتح ' الأمراض المنقولة جنسياً & كترلس ' علامة التبويب عرض التفاصيل المتعلقة بمعايير التحليل وتحديد " القادم ".
- على ' "تخطيط لوحة" ' علامة التبويب وتعيين الأوامر جيدا لهذه المجموعة، وانقر فوق " حفظ " لحفظ المعلومات دفعة إلى ' "دفعي المعلقة" ' قائمة. تحميل اللوحة في قارئ لوحة حبة على أساس مقايسة متعدد
- واهتز لمدة 5 دقائق وتشغيل المجموعة من قائمة انتظار الدفعة. سيتم حفظ البيانات المكتسبة في تنسيق الملف.csv.
- تحليل البيانات
- تحويل الملف.csv المتولدة من برمجيات تحليل متعدد حبة على أساس تنسيق الملف (ملف بيانات النتائج).rbx باستخدام برامج التحويل أجريت. إطلاق برامج التحويل، وحدد الملف.csv تحت إكسبونينت حدد الملف (الملفات) وانقر على " تولد " زر؛ سيتم حفظ الملف.rbx في مجلد الإخراج المحدد.
- إطلاق برامج التحليل، وافتح الملف.rbx-
- تحسين المنحنيات القياسية باستخدام منحنى 4PL/5PL صالح.
- حدد ما يلي في ' "المنحنى المعياري" ' التبويب: ' "نوع الانحدار" ': ' اللوجستية-5PLƆ ' "تحول محور" ': ' Log(x)-القراد Ɔ الخطية (ص) ' "إظهار خطوط النطاق الزيركونيم" ' مربع؛ ووضع علامة ' "إظهار غير معروف" عينات ' مربع؛ التجزئة ' "تظهر عينات مراقبة" ' مربع؛ ضع علامة ' تطبيق عبر جميع التحاليل ' مربع؛ ضع علامة ' إظهار التقرير بعد التحسين ' مربع.
- انقر فوق " أمثلية " زر للسيارات-الأمثل-
- التسمية هوية العينات تحت ' "أدخل معلومات العينة" ' التبويب
- الحصول على التركيزات الملاحظة في ' "تقرير الجدول" ' علامة التبويب وانقر فوق " تصدير الجدول تقرير " لتوليد البيانات في ملف جدول بيانات لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم جمع عينات المسيل للدموع من أعين 8 من 4 مواضيع صحية باستخدام شرائط تدفق المسيل للدموع وحللت سيتوكين مستويات استخدام البروتوكول المشار إليه أعلاه. جميع المواضيع كانت الذكور وسن المواضيع الأربعة أعوام 36، 42 و 44 و 52 على التوالي. الصحة سطح العين والعين الجافة تم تقييم المرض بالاختبارات السريرية (المسيل للدموع فيلم فاصل حتى الوقت، شيرمر لاختبار، وتلطيخ القرنية، وتلطيخ مايوجد، فحص غدة غطاء/الميبوميه، علامات القرنية المسيل للدموع والبصرية علامات وأعراض) وفقا حلقة العمل الدولية بالعين الجافة، والمبادئ التوجيهية لعام 2007 وأيا من المواضيع التي تبين أي علامات وأعراض مرض العين الجافة. 31
من السيتوكينات 41 تحليلها، اكتشفت السيتوكينات 31 في جميع العينات المسيل للدموع، إيل-17A وخطة التأمين الطبي-1β وتنف-α اكتشفت في عيون 7 مواضيع 4، تم الكشف عن إيل-4 في عيون 6 مواضيع 4، تم الكشف عن IFN-γ في عيون 6 المواد 3، تم الكشف عن إيل-1A في أعين 3 subj 5 تم الكشف عن هذا النظام، واوتاكسين، وايل-9 في عيون 3 مواضيع 2، اكتشفت إيل--3 في 1 العين وخطة التأمين الطبي-1α في أي من العينات. تركيزات السيتوكينات 41 الكشف عنها في مواضيع صحية باستخدام مقايسة حبة على أساس تعدد الإرسال (الشكل 2) يعني ± SD مذكورة في الجدول 2. من أصل 41 السيتوكينات التي تم تحليلها، وجد للتعبير عن درجة عالية في جميع العينات مع ± يعني SD 203.9 ± 52.6 نانوغرام/مل 1ra إيل وتراوحت 129.64 نانوغرام/مليلتر 271.7 نانوغرام/مليلتر. 10 IP السيتوكينات، وغرو، العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، PDGF-AA، فراكتالكيني، وايل-8، لو، PDGF BB، VEGF وز-CSF كانت أيضا عالية أعرب (الكميات نانوغرام/مليلتر) في دموع الأصحاء، وأعرب عن السيتوكينات المتبقية في كميات pg/mL (الجدول 2). أدنى تركيز المقاسة سيتوكين المسيل للدموع كان تنف-α مع ± يعني SD 27.25 ± 19.97 بيكوغرام/مل وتراوحت 10.75 بيكوغرام/مل 56.02 بيكوغرام/مل. في 31 السيتوكينات التي تم الكشف عنها في جميع العينات، لم يظهر أي اختلاف مهم إحصائيا في تركيز (ف> 0.05) بين العين اليمنى واليسرى باختبار t (الشكل 3).
رقم 1: رسم تخطيطي تدفق المسيل للدموع سيتوكين التنميط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: المسيل للدموع ملامح سيتوكين في الأشخاص الأصحاء. الدموع سكاتيربلوت الممثل عرض ± يعني سجل SD تركيزات السيتوكينات 41 في عينات جمعت من الأصحاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: العين بين المسيل للدموع سيتوكين الخلافات الشخصية في مواضيع صحية- سكاتيربلوت الممثل يبين الفرق لا يعتد به إحصائيا (p> 0.05) في العين بين متوسط التركيزات من 31 تمزيق السيتوكينات في مواضيع صحية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| س. رقم | تحليلها | المنطقة حبة |
| 1 | لو | 12 |
| 2 | صندوق الأجيال القادمة-2 | 13 |
| 3 | اوتاكسين | 14 |
| 4 | TGF-Α | 15 |
| 5 | ز-CSF | 18 |
| 6 | أنطوني-3 لتر | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | فراكتالكيني | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | غرو | 26 |
| 12 | إيل-10 | 27 |
| 13 | 3-العملية التشاورية المتعددة الأطراف | 28 |
| 14 | إيل-12 ف 40 | 29 |
| 15 | حركة التغيير الديمقراطي | 30 |
| 16 | إيل-12 ف 70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | إيل-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | إيل-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | إيل-17A | 39 |
| 23 | إيل-1RA | 42 |
| 24 | إيل 1Α | 44 |
| 25 | إيل-9 | 45 |
| 26 | إيل 1Β | 46 |
| 27 | إيل-2 | 48 |
| 28 | إيل-3 | 51 |
| 29 | إيل-4 | 53 |
| 30 | إيل-5 | 55 |
| 31 | إيل-6 | 57 |
| 32 | إيل-7 | 61 |
| 33 | إيل-8 | 63 |
| 34 | 10-الملكية الفكرية | 65 |
| 35 | العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 | 67 |
| 36 | برنامج التأمين الصحي--1Α | 72 |
| 37 | برنامج التأمين الصحي--1Β | 73 |
| 38 | رانتيس | 74 |
| 39 | TNFΑ | 75 |
| 40 | TNFΒ | 76 |
| 41 | فيجف | 78 |
الجدول 1: تحليلها أسماء وتفاصيل المنطقة حبة المقابلة.
| س. رقم | سيتوكين | عدد من العيون | عدد من المواضيع | متوسط تركيزات | التنمية المستدامة |
| 1 | لو | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | اوتاكسين | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | صندوق الأجيال القادمة-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | أنطوني-3 لتر | 8 | 4 | 475.4 | 133.6 |
| 5 | فراكتالكيني | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | ز-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28.1 |
| 8 | غرو | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641.4 | 253.55 |
| 10 | إيفنج | 6 | 3 | 76.6 | 42.81 |
| 11 | إيل-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41.52 |
| 12 | إيل-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | إيل-12 |
الجدول 2: المسيل للدموع ملامح سيتوكين في مواضيع صحية- يعني ± SD تركيزات السيتوكينات 41 الكشف عنها في مواضيع صحية باستخدام مقايسة حبة على أساس متعدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
السيتوكينات هي البروتينات يفرزها الخلوية الصغيرة والمغيرون محصنة قوية تنظم الاستجابات المناعية. 32 ملامح التعبير السيتوكينات المختلفة في المسيل للعينات المرتبطة بمختلف الحالات المرضية للعين ودراسات عن سيتوكين التشكيلات الجانبية لتساعد على فهم آليات إمراضية المرض، وتحديد الحالة الصحية العين، شدة المرض والتشخيص والتقدم. 2 , 5 تركيزات البروتين أقل وأحجام عينة صغيرة هي التحديات الرئيسية للطرق التقليدية، الحد من استخدام فحوصات مثل أليسا لتحليل الملامح سيتوكين المسيل للدموع. يوجد 33 حبة على أساس فحوصات متعدد تحديدكم، التي لديها مزايا واضحة على أليسا. حبة على أساس متعدد فحوصات تتطلب حجم عينة أصغر لتحليل التحاليل متعددة وهي حساسة للغاية، وقادرة على اكتشاف حلول تركيزات البروتينات في السوائل البيولوجية. 34
هنا نحن تقرير بروتوكول موحد للتحليل الكمي من 41 السيتوكينات المسيل للدموع في الأشخاص الأصحاء باستخدام مقايسة حبة على أساس متعدد. الخروج من السيتوكينات 41 في الفريق، حبة على أساس تحليل متعدد اكتشاف السيتوكينات 40 في عينات المسيل للدموع، وتعذر الكشف عن برنامج التأمين الصحي--1α. قد تكون هذه النتيجة السلبية لأنه كانت هناك مستويات غير قابلة للكشف لخطة التأمين الطبي-1α في عينات سليمة المسيل للدموع، أو نتيجة لحجم أصغر من الدموع. المسيل للدموع العينات التي تم جمعها باستخدام شرائط شيرمر تتمتع بميزة أخرى أساليب جمع مثل أنبوب ميكروكابيلاري والإسفنج. على سبيل المثال، في العديد من الشروط السريرية، ويمكن قياس حجم السائل المسيل للدموع بشرائط شيرمر والمسيل للدموع يمكن التيد من نفس قطاع بعد قياس السوائل وتستخدم لتحليل سيتوكين. 35 على الرغم من أنابيب ميكروكابيلاري تستخدم بشكل روتيني لجمع الدموع وإنتاج أكثر اتساقا المسيل للدموع الملامح، الإجراء يأخذ وقتاً أكثر من أسلوب قطاع أكثر مملة وقد يكون غير مريح للأطفال والمرضى الآخرين. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب قد أيضا تحفز الإنتاج المسيل للدموع منعكس بلمس الملتحمة ونتائج متغير الملامح سيتوكين مقارنة بالدموع القاعدية، مما يؤثر على إمكانية تكرار نتائج للفحص. 36 في بعض الظروف السريرية مثل مرض العين الجافة، جمع العينات المسيل للدموع بشرائط شيرمر هو موثوق لتحليل البروتين ويساعد في تحديد المؤشرات الحيوية. 37 , 38
أليسا المتعددة التي يتم تحليلها في العينة تقع بين جسم معين المغلفة ولون ترميز حبات مغناطيسية أو جسم الكشف الجزئي المجالات الخرز الصغير وبيوتينيلاتيد وحبه على أساس متعدد فحوصات مزيج من التدفق الخلوي. ويمكن الكشف عن هذه المجمعات بإضافة مراسل جزيء ستريبتافيدين-فيكوريثرين (PE) المتقارن والتعرض اللاحق لنظام ليزر مزدوج في صك على أساس قياس تدفق معدلة. 39 في نظام ثنائي ليزر، ليزر واحد يثير الأصباغ الداخلية ويمثل الإشارة جسم معين المغلفة. الليزر الثاني يثير المتقارن جزيء PE الإبلاغ منضمة إلى جسم الكشف معقدة وشدة الإشارات التي تمثل تركيز أكثر.
تمكين القدرة على الجزئي المجالات الخرز الصغير أن تم تلوينها بالأصباغ بدرجات متفاوتة الفحص للكشف عن ما يصل إلى 100 من تحليلها مختلفة في كمية صغيرة من العينة في بئر واحدة. 39 ولو على أساس حبة فحوصات متعدد سريعة واستنساخه، وقابلة للمقارنة إلى معيار أليسا فحوصات،34،40 هذا الأسلوب يتطلب أدوات مخصصة، تقييم مجموعات وتوحيد البروتوكولات العينات البيولوجية المختلفة. 39 وجود الأجسام المضادة-للسيارات في العينات السريرية التي قد تؤثر على نتائج حبة على أساس متعدد. 34 , 39 للاستخدام الروتيني لهذه الاختبارات في ظروف سريرية، من المستحسن استخدام مجموعات المقايسة من شركة مصنعة معينة واحدة. وأفيد حساسية، والكشف عن تركيزات المطلقة من السيتوكينات، وإمكانية تكرار نتائج تختلف مع مجموعات مختلفة. 41 جسم [ميكروارس] أو [ميكروارس] غشاء حساسة للغاية، وتقنيات إنتاجية عالية بديلة رخيصة الثمن الذي كشف تحليلها متعددة في كمية صغيرة من عينات ويمكن تطبيقها بنجاح على المسيل للدموع للتحليل عينات السيتوكينات وغيرها من البروتينات. 35 , 42 ومع ذلك، قيود عديدة موجودة، كما هذه فحوصات وقتاً طويلاً، نصف الكمية ويحمل نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية، وتفتقر إلى بروتوكولات موحدة. 19 , 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن. لا مصلحة مالية أو تضارب في المصالح.
Acknowledgments
أعمال البحث التي تدعمها "منحة المركز" من تان توك سنج مستشفى شخصية بذرة تمويل البرنامج عام 2015؛ منح سنغافورة العين بحوث المعهد الطيار غرانت وتأن توك سنج مستشفى الملعب للصندوق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
