Summary
Analyse af tårefilmen cytokiner hjælper i at studere forskellige okulær sygdomme. Perle baseret multiplex assays er enkle og følsomme og aktiverer afprøvning af flere mål i prøver med små mængder. Her beskriver vi en protokol for tåre filmen cytokin profilering en ved hjælp af perle baseret multiplex assay.
Abstract
Tårefilmen er en kompleks blanding af lipider, proteiner og mineraler, som dækker den udvendige overflade i øjet, hvilket giver smøring, ernæring og beskyttelse til de underliggende celler. Analyse af tårer er et nyt areal til identifikation af biomarkører for forudsigelse, diagnose og prognose af forskellige okulær sygdomme. Tårer er let tilgængelige og deres samling er ikke-invasiv. Derfor, fremrykkende teknologier vinder i forgrunden til identifikation af flere analysander i tårer at studere ændringer i protein eller en metabolit sammensætning og dets tilknytning til patologiske tilstande. Tåre cytokiner er ideelle biomarkører for at studere sundhed af okulær overflade og også hjælpe med at forstå mekanismerne af forskellige okulær overflade lidelser som tørre øjne sygdom og vernal konjunktivitis. Perle baseret multiplex assays har evnen til at opdage flere analysander i en lille mængde af prøven med en højere følsomhed. Beskriver her vi en standardiseret protokol af tåre prøvetagning, udvinding og analyse af cytokin profilering ved hjælp af en perle baseret multiplex assay.
Introduction
Tårer er produceret af lacrimal kirtel og tilbehør kirtler og pels den ydre overflade af øjet. Tårefilmen består af en ydre lipid lag og en indre vandige lag, der indeholder opløselige proteiner, Muciner og membran bundet Muciner. Tårer undgå mikrobiel invasion, leverer næringsstoffer og giver smøring til okulær overflade. Tårer fungere som forbindelsesled mellem luft og væv til ilt transport til hornhinden. 1 tårefilmen består af proteiner, kulhydrater, lipider og elektrolytter. Association mellem tåre proteiner med okulær og systemiske sygdomme som glaukom, tørre øjne sygdom, vernal konjunktivitis, diabetes mellitus, thyreoidea-associeret orbitopathy og kræft er blevet identificeret i flere undersøgelser. 2 , 3 , 4 tåre prøver kan indsamles af microcapillary rør eller rive flow strimler (Schirmer strimler). Derudover er Schirmer's test en standardprocedure, som foretages i hornhinden og refraktiv kirurgi klinikker, hvis resultater kan anvendes til cytokin analyse assays. Non-invasiv prøvetagning, tilgængelighed af bio-modellen, og sammenslutningen af tåre sammensætning med forskellige fysiologiske og patologiske betingelser gøre rive filmen en potentiel kilde til biomarkører for flere okulær og systemiske sygdomme. 4 , 5 , 6
Tåre cytokiner spiller en vigtig rolle i at studere okulær overflade sundhed og betændelsestilstande i forskellige okulær sygdomme. 7 unormal koncentrationer af adskillige cytokiner i tåre prøver blev rapporteret at være forbundet med tørre øjne sygdom, vernal keratoconjunctivitis (VKC), atopisk keratoconjunctivitis (AKC), sæsonbetinget allergisk conjunctivitis og uveitis. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 tåre proteiner kan analyseres ved hjælp af traditionelle metoder som massespektrometri, western blotting og enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA). 14 , 15 dog begrænsninger af disse metoder er dårlig følsomhed og en større volumen af prøven kræves til analyse af flere tåre cytokiner i hver patient. 16 , 17 perle baseret multiplex assays er blevet udviklet til at analysere flere analysander i komplekse blanding prøver og anvendt med succes på tåre prøver at analysere flere cytokiner i forskellige sygdomme. 6 , 18 A kombination af sandwich ELISA og flow flowcytometri teknikker aktiverer disse assays til at blive mere følsomme end ELISA til kvantificering af flere analysander i en enkelt prøve. 19 denne metode kan anvendes på en række kliniske prøver og celle kultur analysere og hjælper i studiet af immunrespons i flere patofysiologiske forhold. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Der er flere undersøgelser, sammenligne perle baseret multiplex-undersøgelser, med ELISA og har rapporteret en sammenhæng mellem metoderne. Loo et al. sammenlignede perle baseret multiplex assay med konventionelle ELISA til påvisning af adiponectin, resistin, leptin og ghrelin i humant serum eller plasma prøver og indberettet en stærk korrelation (r > 0,9) mellem assays. 25 Dupont et al. rapporterede en stærk korrelation mellem perle baseret multiplex assays og ELISA til påvisning af IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ og TNF-α i phytohemagglutinin og LPS stimuleret fuldblod indsamlet fra gravide kvinder. 26 Pickering et al. rapporteret en anden stærk korrelation mellem perle baseret multiplex assay og ELISA til påvisning af serumantistoffer mod Haemophilus influenza type b polysaccharid (r = 0,96), Toxoider af Clostridium tetani (r = 0,96), og Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Biagini et al. rapporterede en høj positiv korrelation (r = 0.852) mellem perle baseret multiplex assay og ELISA til påvisning af Bacillus anthracis anti-PA IgG i serumprøver. 28 Wang et al. rapporteret en sammenhæng mellem perle baseret multiplex assay og ELISA til påvisning af Alzheimers sygdom biomarkører amyloid-β 42 (r = 0,77), samlede tau (r = 0,94), og tau fosforyleret på aminosyre 181 (r = 0,82) i cerebrospinalvæske prøver. 29 disse undersøgelser har vist anvendeligheden af perle baseret multiplex assays på forskellige kliniske prøver, mindre sample volumen krav og en korrelation med standard ELISA, som gør perle baseret multiplex assays en lovende alternativ til traditionelle ELISA metoder til påvisning af flere analysander i forskellige slags prøver i forskellige sygdom fænotyper. Her beskriver vi en standardiseret protokol for perle baseret multiplex assay for cytokin profilering for 41 analysander i tåre prøver fra raske forsøgspersoner med Schirmer strimler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
de protokoller, der bruges i denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle review board Tan Tock Seng Hospital, Singapore.
1. rive cytokin analyse
- samling af tårer:
- bede emne til at sidde komfortabelt på en undersøgelse stol og placere hans/hendes hoved mod hovedstøtten.
- Spørger emne at slå op, omhyggeligt åbne Schirmer strimler (lavet af papirfilter Whatman nr. 41) og placere den afrundede ende af strimlen på den ringere fornix i øjet og instruere emnet til at lukke øjnene i 5 min. Mens indsamling tage tårer stor forsigtighed for at minimere okulær overflade kontakt. 30
- bede emne til at åbne deres øjne for at fjerne strimlen og placere den i sterile 1,5 mL microcentrifuge rør. Straks overføre røret til laboratorium eller butikken på-80 o C indtil test for cytokin profilering.
- Eluering af tåre prøve fra tåre flow strip:
- skære tåre flow strip til en længde på 0,5 cm (at standardisere mængden af tårer skal testes) og placere den i en sterile 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Tilføj 30 µL af assay buffer, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. efterfulgt af centrifugering tube på 14.000 x g i 1 min.
- Overføre supernatanten ind i en anden 1,5 mL microcentrifuge rør og kassér strimlen. Placere den prøve, der indeholder rør på is og bruge eksemplet elueret tåre straks til cytokin profilering.
- Forberedelse af reagenser:
Bemærk: 41 analysander skal testes i hver prøve af perle baseret multiplex assay er interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-inducerbar protein 10 (IP-10, CXCL10), makrofag-afledte chemokine (MDC), makrofag inflammatoriske protein (MIP)-1α og MIP-1β, monocyt kemotaktisk protein (MCP) -1, MCP-3, tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α), TNF-β, vækst-regulerede onkogen (GRO), tumor vækst faktor alfa (TGF-α), vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), epidermal vækstfaktor (EGF), fibroblast vækstfaktor (FGF) -2, Trombocyt afledt vækst faktor (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, granulocyt koloni-stimulerende faktor (G-CSF), granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, opløselige CD40 ligand (sCD40L), Fms-lignende tyrosin kinase 3 ligand (Flt - 3L) og reguleret ved aktivering, normal T-celle udtrykt og udskilles protein (RANTES).- Bringe antistof perle løsning (50 X) hætteglas til stuetemperatur (20-25 o C) og vortex hætteglas i 1 min.
- Tælle antallet af brønde kræves for analysen, og beregne mængden af samlede antistof perle cocktail løsning (25 µL pr. brønd) og hver antistof perle løsning (50 X) nødvendige for assayet.
- Forbereder den cocktail løsning ved at tilføje det beregnede beløb for hver antistof perle løsning og fyld til den ønskede endelige mængden ved at føje det resterende beløb af perle fortyndingsmiddel. Sikre, at den endelige koncentration af hver antistof i cocktail 1 X. Altid forberede mindst 20% ekstra volumen af cocktail løsning i tilfælde af pipettering fejl.
Bemærk: Som et eksempel, for en 96-brønd assay forberede 3000 µL antistof perle cocktail løsning. Den nødvendige mængde af hver antistof perle løsning = 3000/lager koncentration af hver antistof perle løsning; 3000/50 = 60 µL af hver antistof perle løsning- tilføje 60 µL af hver af de 41 antistof perle løsninger (60 X 41 = 2460 µL) i en cocktail flaske og tilføje 540 µL af perle fortyndingsmiddel løsning til antistof perle blandingen til at gøre 3000 µL af finalen brugsopløsning (1 X).
- Før brug, bland perle cocktail løsning ordentligt. Efter analysen gemme den resterende mængde på 2-8 o C for op til 30 dage.
- Forberede kvalitetskontrol (QC) ved at tilføje 250 µL deioniseret vand til QC 1 og QC 2 bestande.
- Blandes ordentligt ved at invertere flaskerne flere gange og vortex for 10 s. overførsel løsning til korrekt mærket polypropylen microcentrifuge rør og gemme den resterende løsning ved-20 ° C, som kan bruges i op til 30 dage.
- Forbered vaskebuffer ved at tilføje 270 mL deioniseret vand til 30 mL 10 X vaske stødpudeopløsning og bland godt (før fortynding, bringe den 10 X buffer til stuetemperatur og opløse alle salt bundfald ved at blande). Gemme den ubrugte vaskebuffer (1 X) ved 2-8 ° C, som kan bruges i op til 30 dage.
- Forbered menneskelige cytokin standard materiel (10.000 pg/mL af alle analysander) ved at tilføje 250 µL deioniseret vand til stock hætteglasset. Bland godt ved at vende flere gange og vortex hætteglas til 10 s. lad det stå i 10 min og overføre stamopløsning til korrekt mærket polypropylen microcentrifuge rør. Efter analysen, gemme den resterende løsning ved-20 ° C, som kan bruges i op til 30 dage.
- Forbered menneskelige cytokin arbejdsstandarder ved 5-fold serielle fortyndinger (50 µL - > 200 µL) med analysebuffer at få 2000, 400, 80, 16 og 3,2 pg/mL.
- Efter standardpraeparat, bruge arbejdsstandarder i 60 min og bruge analysebuffer som blank/baggrund (-pg/mL).
- Cytokin profilering af perle baseret multiplex assay:
- bringe alle reagenser til stuetemperatur og vortex for 5-10 sekunder før du føjer dem til 96-brønd mikrotiter plade. Hvis elueret tåre prøver opbevares på-80 o C forud for analysen, optø frosne tåre uddrag på is og centrifugeres ved 1000 X g i 5 min.
- Udarbejde en analyse arbejde ark i en lodret konfiguration for arbejder menneskelige cytokin standarder [0 (Blank), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 og 10.000 pg/mL], QC1, QC2 og prøver.
- Tilføje 200 µL 1 X vaskebuffer til hver godt af pladen, forsegle det med plade sealer og holde det på en plade shaker ved stuetemperatur (20-25 o C) til 10 min.
- Dekanteres 1 X vaskebuffer af invertere pladen og tryk det på absorberende håndklæder flere gange til at fjerne enhver resterende mængden af wash buffer i brøndene.
- Tilføje 25 µL af hver arbejder menneskelige cytokin standard, QC1, QC2, tom (analysebuffer) og stikprøver ind i passende brøndene.
- Tilføje 25 µL af analysebuffer til hver brønd.
- Tilføje 25 µL 1 X antistof perle cocktail løsning i hver brønd. Som antistof perle løsning er lysfølsomt, forsegle pladen med plade sealer og dække det med aluminiumsfolie at beskytte det mod lys under analysen.
- Ruger plade på 4 o C natten over på en shaker.
- Pladen anbringes på pladen rack af en automatisk magnetisk plade skive. Lad det sidde i 1 min til at afgøre de magnetiske perler i bunden af brønden og Opsug de godt indhold. Tilføje 200 µL af wash buffer pr. hul og lad det sidde i 1 min og derefter Opsug de godt indhold. Gentag vask igen (for plade vask, Følg kit producent ' s instruktioner).
- Tilføje 25 µL af påvisning antistoffer løsning i hver godt, forsegle pladen, dække den med alufolie og Inkuber ved stuetemperatur i 60 min på en shaker.
- Tilsæt 25 µL af Streptavidin-Phycoerythrin løsning i hver brønd, forsegle pladen, dække den med alufolie og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. på en shaker.
- Pladen anbringes på en magnetisk plade skive. Lad det sidde i 1 min og derefter Opsug de godt indhold. Tilføje 200 µL af wash buffer pr. hul. Lad det sidde i 1 min og derefter Opsug de godt indhold. Gentag vask igen.
- Tilføj 150 µL af kappe væske til hver godt og pladen anbringes på en shaker i 5 min ved stuetemperatur til resuspend antistof perler.
- Læse pladen straks ved hjælp af perle baseret multiplex assay Pladelæser og analysere cytokin koncentrationer ved hjælp af en 5-parameter kurvetilpasning algoritme. En skematisk Blokdiagram af tåre cytokin profilering er vist i figur 1.
- Læsning assay plade (instrument oprettet) og analyse af data:
- Switch på perlen baseret multiplex assay læseren og pre varm laser i 30 min.
- Launch perle baseret multiplex assay software. Under den ' automatiseret vedligeholdelse ' fanen, skal du vælge den ' kalibrering-kontrol ' indstilling. Vortex hver reagens vial af kalibrering og verifikation perlerne for 30 s. sted 5 dråber hvert reagens i de udpegede brønde. Fyld de udpegede reservoirer med deioniseret vand og 70% ethanol.
- Opret en ny protokol
- åbne i ' protokoller ' side og derefter den ' protokoller ' tab. falde i hak " oprette nye ProtocolŔ de ' indstillinger ' fane åbnes.
- i den ' navn ' Skriv navnet på protokollen.
- Indtast en beskrivelse i boksen til højre for den ' navn ' boks.
- i den ' Version ' Skriv versionen af protokollen.
- i den ' fabrikanten ' Skriv oplysninger om producenten for protokollen.
- Definer indstillingerne i den ' erhvervelse indstillinger ' afsnit som følger. Indstille ' volumen ': 100 µL ' Timeout ': 60 s; ' DD Gating ': 8.000 til 15.000; ' Reporter gevinst ': Standard ydelse; ' Perle type ': magnetisk bead.
- Definer indstillingerne i den ' analyseindstillingerne ' afsnit, valg ' kvantitative ' som analysetypen. Indstille ' række standarder ': 6; ' Antal kontrolelementer ': 0; Kryds den ' betyde af replikater ' boksen;
Kryds den ' analysere resultater mens erhverve prøver ' boks. - Klik på " NextŔ den ' analysander ' under fanen åbner, klik på den ønskede analysander (perle ID) i gitteret nummererede analysand.
- Klik og skriv tilsvarende analysanden navn i den ' navn ' kolonne til højre for analysanden gitter (analysander ' navne og deres tilsvarende perle region detaljer blev nævnt i tabel 1).
- Klik og skriv den ønskede måleenhed (dvs. pg/mL) i de ' enheder ' boks til venstre for den ' gælder alle ' knappen. Klik derefter på " gælder alle ".
- Klik og skriv den ønskede perle tæller for hver analysand (dvs. 50) i den ' Grev ' boks. Klik på " gælder alle ".
- Klik " NextŔ fanen plade Layout åbnes. Fremhæve wells standarder og vælg " 2 " under replikere count og klik på den " S " Standard knap. Gentag dette trin for baggrunden " B " og prøver " U " wells.
- Klik " Gem ".
- Oprette nye standarder/kontrol masser
- åbne i ' protokoller ' side, og derefter den ' standarder & kontrol ' tab. falde i hak " oprette nye Standard/kontrol masser ".
- Lukke op den ' Vælg protokol ' boks. Vælg den protokol, der blev oprettet i trin 1.5.3.
- Nøglen i forbindelse med standarderne i overensstemmelse hermed: Std/Ctrl kit nummer, Std/Ctrl kit navn, udløbsdato, og fabrikanten.
- Nøglen i værdien af den højeste standard for hver analysand (dvs. 10000 pg/mL). Indtast 5 under fortynding og klik på " gælder alle " til automatisk at generere de forventede koncentrationer for resten af standarderne.
- Klik " Gem ".
- Opret et nyt parti fra en eksisterende protokol
- åben de ' partier ' side og klik på " oprette et nyt parti fane fra en eksisterende protokol ".
- Skriv kladdenavn i den ' kladdenavn ' boksen og skriv en beskrivelse om parti i den ' indtaste valgfri beskrivelse ' boks.
- Klik på den protokol, der er genereret tidligere (i trin 1.5.3).
- Klik på " NextŔ den næste fane, der åbnes, er den ' kønssygdomme & Ctrls ' tab. se detaljerne i analysen standarder og vælg " næste ".
- På den ' plade Layout ' fanen, tildele godt kommandoer for denne batch og klik " Gem " gemme batchoplysninger til den ' ventende Batch ' listen.
- Læg pladen i perle baseret multiplex assay-Pladelæser, ryst den i 5 min og køre batchen den ventende batchlisten. Data erhvervet vil blive gemt i formatet .csv.
- Dataanalyse
- konvertere den .csv-fil, der genereres fra perle baseret multiplex assay software til .rbx (resultater data fil) format bruger rbx konvertering software. Start konvertering software, vælge .csv-fil under Vælg xPONENT fil(er) og klik på den " generere " knappen; .rbx fil vil blive gemt i den valgte outputmappe.
- Launch analyse software og åbne filen .rbx.
- Optimere standard kurver ved hjælp af 4PL/5PL kurven passer.
- Vælg følgende i den ' standardkurven ' fane: ' Regression Type ': ' logistik-5PLƆ ' akse Transformation ': ' Log(x) - lineær (y) Ɔ kryds den ' Vis konc vifte linjer ' kasse, kryds den ' Vis ukendt Prøver ' kasse; Kryds den ' Vis kontrolprøver ' kasse; Kryds den ' Anvend på tværs af alle analysander ' kasse; kryds den ' Vis rapport efter optimering ' boks.
- Klik på den " Optimer " knap til auto-optimering.
- Mærke prøve identiteter under ' indtaste prøve Info ' tab.
- Få de observerede koncentrationer i de ' rapporttabel ' fanen og klik på " eksportere rapporttabel " til at generere data i en regnearksfil til yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tåre prøver blev indsamlet fra 8 øjne af 4 raske forsøgspersoner med tåre flow strimler og cytokin niveauer blev analyseret ved hjælp af den ovenfor nævnte protokol. Alle forsøgspersoner blev mandlige og alder af de fire fag var 36, 42, 44 og 52 år henholdsvis. Okulær overflade sundhed og tørre øjne sygdom blev evalueret ved kliniske forsøg (tåre filmen bryde op tid, Schirmer's test, cornea farvning, konjunktival farvning, låg/meibomske kirtel undersøgelse, cornea tåre tegn og visuelle tegn og symptomer) i henhold til den International tørt øje Workshop, 2007 retningslinjer og ingen af emnerne, der viste nogen tegn og symptomer på tørre øjne sygdom. 31
Ud af de 41 cytokiner analyseret, blev 31 cytokiner opdaget i alle prøverne, tåre, IL-17A, MIP-1β og TNF-α blev opdaget i 7 øjne af 4 fag, IL-4 blev opdaget i 6 øjne af 4 fag, IFN-γ blev opdaget i 6 øjne af 3 fag, IL-1A blev registreret i 5 øjne af 3 subj ECTS, eotaxin og IL-9 blev opdaget i 3 øjne af 2 fag, IL-3 blev opdaget i 1 øje og MIP-1α i ingen af prøverne. Gennemsnit ± SD koncentrationer af 41 cytokiner opdaget hos raske forsøgspersoner med perle baseret multiplex assay (figur 2) blev nævnt i tabel 2. Ud af 41 cytokiner analyseret, blev IL-1ra fundet at være stærkt udtrykt i alle prøver med den gennemsnit ± SD 203.9 ± 52,6 ng/ml og varierede fra 129.64 ng/mL til 271.7 ng/mL. Cytokiner IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, IL-8, EGF, PDGF BB, VEGF og G-CSF var også stærkt til udtryk (ng/mL mængder) i tårer af raske forsøgspersoner og de resterende cytokiner blev udtrykt i pg/mL mængder (tabel 2). Den laveste målte koncentration af tåre cytokine TNF-α med den gennemsnit ± SD 27.25 ± 19.97 pg/ml og varierede fra 10,75 pg/mL til 56.02 pg/mL. I 31 cytokiner, som blev konstateret i alle prøverne, ingen viste en statistisk signifikant forskel i koncentrationen (p> 0,05) mellem højre og venstre øje af t-test (figur 3).
Figur 1: skematisk Blokdiagram af tåre cytokin profilering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: rive cytokin profiler i raske mennesker. Repræsentant scatterplot viser log gennemsnit ± SD koncentrationer af 41 cytokiner i rive prøver fra raske forsøgspersoner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Inter øje tåre cytokin profilen forskelle hos raske forsøgspersoner. Repræsentant scatterplot viser ingen statistisk signifikant forskel (p> 0,05) i Inter øje gennemsnitlige koncentrationer af 31 rive cytokiner hos raske forsøgspersoner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| S. nr. | Analysander | Perle region |
| 1 | EGF | 12 |
| 2 | FGF-2 | 13 |
| 3 | Eotaxin | 14 |
| 4 | TGF-Α | 15 |
| 5 | G-CSF | 18 |
| 6 | Flt - 3L | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | Fractalkine | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | GRO | 26 |
| 12 | IL-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | IL - 12P 40 | 29 |
| 15 | MDC | 30 |
| 16 | IL - 12P 70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17A | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1Α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1Β | 46 |
| 27 | IL-2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | IL-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | IL-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1Α | 72 |
| 37 | MIP-1Β | 73 |
| 38 | RANTES | 74 |
| 39 | TNFΑ | 75 |
| 40 | TNFΒ | 76 |
| 41 | VEGF | 78 |
Tabel 1: Analysander navne og tilsvarende perle områdedetaljer.
| S. nr. | Cytokin | Antallet af øjne | Antallet af emner | Gennemsnitlige koncentrationer | SD |
| 1 | EGF | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | Eotaxin | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | FGF-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | Flt - 3L | 8 | 4 | 475.4 | 133.6 |
| 5 | Fractalkine | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | G-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28.1 |
| 8 | GRO | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641.4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76,6 | 42.81 |
| 11 | IL-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41.52 |
| 12 | IL-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | IL-12 |
Tabel 2: Rive cytokin profiler hos raske forsøgspersoner. Betyde ± SD koncentrationer af 41 cytokiner opdaget hos raske forsøgspersoner med perle baseret multiplex assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytokiner er små cellulære udskilles proteiner og potent immunmodulatorer regulere immunrespons. 32 i udtrykket profiler af forskellige cytokiner i tåre prøver er relateret til forskellige patologiske tilstande af øjet og undersøgelser af cytokin profiler hjælpe til at forstå mekanismerne af sygdom patogenese, bestemme okulær sundhedstilstand, sygdommens sværhedsgrad, diagnose og progression. 2 , 5 lavere protein koncentrationer og lille udsnit diskenheder er de vigtigste udfordringer af traditionelle metoder, begrænse brugen af assays ligesom ELISA til analyse af tåre cytokin profiler. 33 perle baseret multiplex assays er immunassays, som har klare fordele over ELISA. Perle baseret multiplex assays kræver mindre prøven til analyse af flere analysander og er meget følsomme og kan påvise pikogram koncentrationer af proteiner i biologiske væsker. 34
Her rapporterer vi en standardiseret protokol til kvantitativ analyse af 41 tåre cytokiner i raske mennesker ved hjælp af perle baseret multiplex assay. Ud af de 41 cytokiner i panelet, perle baseret multiplex assay opdaget 40 cytokiner i tåre prøver og kunne ikke registrere MIP-1α. Denne negative resultat kan være fordi der var målbart niveauer af MIP-1α i sund tåre prøver eller på grund af en mindre mængde af tårer. Tåre prøver indsamlet ved hjælp af Schirmer strimler har en fordel frem for andre samling metoder som microcapillary tube og svampe. For eksempel, i flere kliniske tilstande, tåre væske volumen kan måles ved Schirmer strimler og rive væske kan elueres fra den samme stribe efter måling og anvendes til cytokin analyse. 35 selvom microcapillary rør bruges rutinemæssigt til at indsamle tårer og producere mere konsekvent tåre profiler, proceduren, der tager længere tid end strip-metode er mere kedelig og kan være ubehageligt for børn og andre patienter. Desuden, denne metode kan også fremkalde refleks tåreproduktion ved at røre ved conjunctiva og give variable resultater af cytokin profiler i forhold til basal tårer, derved påvirker reproducerbarhed af analysen. 36 i nogle kliniske tilstande som tørre øjne sygdom, tåre prøvetagning af Schirmer strimler er pålidelige for proteinanalyse og hjælper i identifikation af biomarkører. 37 , 38
Perle baseret multiplex assays er en kombination af flowcytometri og multiplex ELISA hvor analysander i stikprøven er klemt inde mellem de specifikke antistof coated og farve kodet magnetiske perler eller mikrokugler og biotinylated detektor-antistof. Disse komplekser kan påvises ved at tilføje reporter molekyle Streptavidin-Phycoerythrin (PE) konjugat og efterfølgende eksponering for en dobbelt laser system i en modificeret flow flowcytometri-baserede instrument. 39 i en dobbelt laser system, en laser ophidser de interne farvestoffer og dens signal repræsenterer den coatede specifikt antistof. Den anden laser ophidser den indberettende molekyle PE konjugat bundet til detektor-antistof kompleks og intensiteten af signalerne, der repræsenterer koncentrationen af analysanden.
Mikrokugler evne til at være kodet med farvestoffer af vekslende intensitet aktiverer analysen til at registrere op til 100 forskellige analysander i en lille mængde af prøven i et enkelt godt. 39 om perle baseret multiplex assays er hurtige, reproducerbar, og kan sammenlignes med standard ELISA assays,34,40 denne metode kræver dedikerede instrumenter, evaluering af kits og standardisering af protokoller for forskellige biologiske prøver. 39 tilstedeværelsen af \u200b\u200bauto-antistoffer i de kliniske prøver kan påvirke perle baseret multiplex resultater. 34 , 39 til rutinemæssig brug af disse assays i klinisk indstillinger, det anbefales at bruge assay kits fra en bestemt producent. Følsomhed, påvisning af absolutte koncentrationer af cytokiner og reproducerbarhed blev rapporteret til at variere med de forskellige kits. 41 antistof microarrays eller membran microarrays er meget følsomme, billig alternativ høj overførselshastighed teknikker, som registrerer flere analysander i en lille mængde af prøver og kan anvendes med succes på rive prøver til analyse af cytokiner og andre proteiner. 35 , 42 men talrige begrænsninger findes, da disse assays er tidskrævende, semi kvantitative, udviser en høj signal-støj-forholdet, og mangler standardiserede protokoller. 19 , 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse. Ingen økonomiske interesser eller interessekonflikter.
Acknowledgments
Forskningen blev støttet af Center tilskud fra Tan Tock Seng Hospital personlig frø finansiering Program 2015; Singapore øje Research Institute Pilot Grant og Tan Tock Seng Hospital Pitch for fondens tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
