Summary
Analyse van de traanfilm cytokines helpt bij het bestuderen van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten. Kraal gebaseerd multiplex assays zijn eenvoudig en gevoelige en activeer het testen van meerdere doelen in monsters met kleine volumes. Hier beschrijven we een protocol voor scheur film cytokine profielen met behulp van een kraal gebaseerd multiplex assay.
Abstract
Traanfilm is een complex mengsel van lipiden, eiwitten en mineralen, die betrekking heeft op het buitenoppervlak van het oog, waardoor smering, voeding en bescherming aan de onderliggende cellen. Analyse van tranen is een opkomende gebied voor de identificatie van biomarkers voor de voorspelling, diagnose en prognose voor verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten. Tranen zijn gemakkelijk te bereiken en hun collectie is niet-invasief. Daarom zijn oprukkende technologieën wint aan bekendheid voor de identificatie van meerdere analyten in tranen te bestuderen van de veranderingen in de samenstelling van het eiwit of metaboliet en haar connectie met pathologische condities. Scheur cytokines zijn ideale biomarkers voor de gezondheid van de oculaire oppervlakte bestuderen en ook helpen bij het begrijpen van de mechanismen van de verschillende oogbeschadigingen en/of oppervlakte stoornissen zoals droge oogziekte en vernal conjunctivitis. Kraal gebaseerd multiplex assays hebben de mogelijkheid voor het opsporen van meerdere analyten in een kleine hoeveelheid monster met een hogere gevoeligheid. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor scheur sample collectie, extractie en analyse van cytokine profielen met behulp van een kraal op basis van multiplex assay.
Introduction
Tranen worden geproduceerd door de traanklier en accessoire klieren en jas van de buitenkant van het oog. Traanfilm bestaat uit een buitenste lipide-laag en een waterige binnenlaag die oplosbare eiwitten bevat, mucinen en membraan gebonden mucinen. Tranen voorkomen van microbiële invasie, voedingsstoffen te verstrekken en geven smering aan de oculaire oppervlakte. Tranen fungeren als intermediair tussen de lucht en weefsel voor zuurstoftransport naar het hoornvlies. 1 traanfilm is samengesteld uit eiwitten, koolhydraten, lipiden en elektrolyten. De associatie tussen scheur eiwitten met oogbeschadigingen en/of en systemische ziekten zoals glaucoom, droge oogziekte, vernal conjunctivitis, diabetes mellitus, schildklier-geassocieerde orbitopathy en kanker is geconstateerd in verschillende studies. 2 , 3 , 4 scheur monsters kunnen worden genomen door microcapillary buizen of scheur stroom strips (Schirmer strips). Daarnaast is de Schirmertest een standaardprocedure in het hoornvlies en de refractieve chirurgie klinieken, waarvan de resultaten kunnen worden gebruikt voor de cytokine analyse tests uitgevoerd. Niet-invasieve sample collectie, toegankelijkheid van het bio-model, en de vereniging van scheur samenstelling met verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden maken scheuren film een potentiële bron van biomarkers voor verschillende oogbeschadigingen en/of en systemische ziekten. 4 , 5 , 6
Scheur cytokines speelt een belangrijke rol bij het bestuderen van de oculaire oppervlakte gezondheid en inflammatoire voorwaarden van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten. 7 abnormale concentraties van verschillende cytokines in scheur monsters werden gemeld te worden geassocieerd met droge oogziekte, vernal keratoconjunctivitis (VKC), atopische keratoconjunctivitis (AKC), seizoensgebonden allergische conjunctivitis en uveitis. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 scheur eiwitten kunnen door traditionele methoden als massaspectrometrie, het westelijke bevlekken en enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) worden geanalyseerd. 14 , 15 de beperkingen van deze methoden zijn echter slechte gevoeligheid en een grotere hoeveelheid monster nodig zijn voor de analyse van meerdere scheur cytokines in elke patiënt. 16 , 17 kraal gebaseerd multiplex assays zijn ontwikkeld om meerdere analyten in complex mengsel monsters te analyseren en met succes toegepast op scheuren monsters te analyseren van meerdere cytokines in verschillende ziekten. 6 , 18 A combinatie van sandwich-ELISA en stroom cytometry technieken kunnen deze testen worden gevoeliger dan ELISA voor de kwantificering van meerdere analyten in één sample. 19 deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid van klinische monsters en cel cultuur supernatant en helpt in de studie van de immuunrespons in meerdere pathofysiologische omstandigheden. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Er zijn verschillende studies vergelijken kraal gebaseerd multiplex testen met ELISA en hebben gemeld een correlatie tussen de methoden. Loo et al. vergeleken kraal gebaseerd multiplex assay met conventionele ELISA voor de opsporing van adiponectin, resistin, leptine en ghreline in menselijke specimens van serum of plasma en gemeld van een sterke correlatie (r > 0.9) tussen de testen. 25 Dupont et al. rapporteerde een sterke correlatie tussen kraal gebaseerd multiplex assays en ELISA voor de opsporing van IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ en TNF-α in phytohemagglutinin en lipopolysaccharide gestimuleerd volbloed verzameld van zwangere vrouwen. 26 Pickering et al. rapporteerde een andere sterke correlatie tussen kraal gebaseerd multiplex assay en ELISA voor de opsporing van serum antilichamen tegen Haemophilus influenzae type b polysaccharide (r = 0,96), toxoids van Clostridium tetani (r = 0,96), en Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). 27 Biagini et al. rapporteerde een hoge positieve correlatie (r = 0.852) tussen kraal gebaseerd multiplex assay en ELISA voor de opsporing van Bacillus anthracis anti-PA IgG in serummonsters. 28 Wang et al. rapporteerde een correlatie tussen kraal gebaseerd multiplex assay en ELISA voor de opsporing van de ziekte van Alzheimer biomarkers amyloid-β 42 (r = 0.77), totale tau (r = 0.94), en tau phosphorylated op aminozuur 181 (r = 0.82) in monsters van de cerebrospinale vloeistof. 29 deze studies hebben aangetoond dat de toepasselijkheid van de kraal multiplex assays gebaseerd op diverse klinische monsters, kleinere steekproef volume eisen en een correlatie met standaard ELISA, waardoor kraal gebaseerd multiplex assays een veelbelovende alternatief voor de traditionele methoden van de ELISA voor de opsporing van meerdere analyten in verschillende soort monsters in andere ziekte fenotypen. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor kraal gebaseerd multiplex assay voor het cytokine profielen voor 41 analyten in scheur monsters verzameld van gezonde proefpersonen gebruik Schirmer strips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
de protocollen die worden gebruikt in deze studie werden goedgekeurd door de board van de institutionele beoordeling van Tan Tock Seng ziekenhuis, Singapore.
1. scheur Cytokine analyse
- collectie van tranen:
- vragen het onderwerp te comfortabel zitten op de stoel van een onderzoek en zijn/haar hoofd tegen de hoofdsteun.
- Vraag het onderwerp opzoeken, zorgvuldig openen de Schirmer strips (gemaakt van het filtreerpapier Whatman nr. 41) en plaats het afgeronde einde van de strip op de inferieure fornix van het oog en het instrueren van het onderwerp af te sluiten van de ogen voor 5 min. Terwijl het verzamelen van besteden de tranen veel zorg aan Minimaliseer oogbeschadigingen en/of oppervlakte contact. 30
- vragen het onderwerp zijn/haar ogen om te verwijderen van de strip en plaatst u deze in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis te openen. Onmiddellijk overdracht de buis naar het laboratorium of de winkel op-80 o C tot testen voor cytokine profileren.
- Elutie van scheur monster uit scheur stroom strip:
- de scheur stroom strip snijden tot een lengte van 0,5 cm (op de standaardisering van de hoeveelheid tranen te beproeven) en plaats deze in een tube van steriele 1,5 mL microcentrifuge.
- Voeg toe 30 µL van assay buffer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, gevolgd door centrifugatie van de buis bij 14.000 x g gedurende 1 min.
- Het supernatant overboeken naar een andere 1,5 mL microcentrifuge buis en negeren van de strip. Leg het monster met de buis op ijs en het monster geëlueerd scheur onmiddellijk te gebruiken voor de cytokine profiling.
- Bereiding van reagentia:
Opmerking: de analyten veertig één in elk monster worden getest door kraal gebaseerd multiplex assay zijn Interleukine (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-afleidbare eiwit 10 (IP-10, CXCL10), macrofaag-afgeleide chemokine (MDC), macrofaag inflammatoire eiwit (MIP)-1α en MIP-1β, monocyt Chemotactische eiwit (MCP) -1, MCP-3, Tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), TNF-β, groei-gereglementeerde oncogen (GRO), tumor groei factor Alfa (TGF-α), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), epidermale groeifactor (EGF), fibroblast groeifactor (FGF) -2, bloedplaatjes afgeleid groeifactor (PDGF)-AA PDGF-AB/BB, granulocyt kolonie-stimulerende factor (G-CSF), granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, oplosbare interactie CD40-ligand (sCD40L), Fms-achtige tyrosine kinase 3 ligand (Flt - 3L) en geregeld na activatie, normale T-cel uitgedrukt en uitgescheiden eiwitten (RANTES).- Brengen de antilichaam kraal oplossing (50 X) flesjes op kamertemperatuur (20-25 o C) en vortex de flesjes voor 1 min.
- Het aantal putten die nodig zijn voor de bepaling, en bereken de hoeveelheid totale antilichaam kraal cocktail oplossing (25 µL per putje) en elke antilichaam kraal oplossing (50 X) vereist voor de assay.
- Bereid de cocktail-oplossing door het berekende bedrag van elke antilichaam kraal oplossing en opvulling toevoegen aan de gewenste eindvolume door toe te voegen het resterende bedrag van kraal verdunningsmiddel. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van elk antilichaam in de cocktail 1 X. Altijd bereiden ten minste 20% extra volume cocktail oplossing in geval van pipetting fouten.
Opmerking: Als een voorbeeld voor een 96-Wells-assay bereiden 3000 µL van antilichaam kraal cocktail oplossing. Het normbedrag van elke antilichaam kraal oplossing = 3000/voorraad concentratie van elke antilichaam kraal oplossing; 3000/50 = 60 µL van elke oplossing kraal antilichaam- toevoegen 60 µL van elk van de oplossingen van de kraal 41 antilichaam (60 X 41 = 2460 µL) in een cocktail fles en 540 µL van kraal verdunningsmiddel oplossing toe te voegen aan het antilichaam kraal mengsel te maken van 3000 µL van finale werkoplossing (1 X).
- Vóór gebruik, meng de kraal cocktail oplossing goed. Nadat de bepaling het resterende volume bij 2-8 o C voor maximaal 30 dagen opslaan.
- De kwaliteitscontrole (QC) door toevoeging van 250 µL gedeïoniseerd water om QC 1 en 2 van de QC voorraden bereiden.
- Meng goed door de flessen meerdere malen omkeren en vortex voor 10 s. overdracht de oplossing voor goed het label van polypropyleen microcentrifuge buizen en de resterende oplossing bij-20 ° C, die kan worden gebruikt voor maximaal 30 dagen opslaan.
- Voorbereiden de buffer wassen door toevoeging van 270 mL gedeïoniseerd water tot 30 mL van de 10 X wassen bufferoplossing en meng goed (vóór verdunning, breng de 10 X buffer op kamertemperatuur en alle zout precipitaten ontbinden door mengen). De buffer van de ongebruikte wassen (1 X) bij 2-8 ° C, die kan worden gebruikt voor maximaal 30 dagen opslaan.
- Bereid de menselijke cytokine standaard voorraad (10.000 pg/mL van alle analyten) door 250 µL gedeïoniseerd water toe te voegen aan de voorraad flacon. Meng goed door het omkeren van meerdere malen en vortex de flacon voor 10 s. laat het gedurende 10 minuten staan en de overdracht van de stamoplossing te goed het label van polypropyleen microcentrifuge buizen. Na de test, het opslaan van de resterende oplossing bij-20 ° C, die kan worden gebruikt voor maximaal 30 dagen.
- De werkende mens cytokine normen voor te bereiden door 5-fold seriële verdunningen (50 µL - > 200 µL) met assay buffer om 2000, 400, 80, 16 en 3.2 pg/mL.
- Na bereiding van de standaard, gebruik de arbeidsnormen binnen 60 min en de assay buffer als blanco/achtergrond (-pg/mL).
- Multiplex assay Cytokine profielen door parel gebaseerd:
- Breng alle reagentia aan kamertemperatuur en vortex gedurende 5-10 seconden voordat u deze toevoegt aan de 96-wells microtiterplaat plaat. Als geëlueerd scheur monsters worden opgeslagen bij -80 o C voorafgaand aan de test, de extracten van de bevroren scheur op ijs ontdooien samen en centrifugeer bij 1000 X g gedurende 5 min.
- Bereiden een assay werkblad in een verticale configuratie voor het werken van menselijke cytokine normen [0 (leeg), 3.2 16, 80, 400, 2.000 en 10.000 pg/mL], QC1, QC2 en monsters.
- Toevoegen-200 µL van 1 X wassen buffer voor elk goed van de plaat, zegel met plaat sealer en bewaar deze op een plaat shaker bij kamertemperatuur (20-25 o C) gedurende 10 minuten
- Het 1 X wassen buffer decanteren door het omkeren van de plaat en tik op het op absorberende handdoeken meerdere malen om de eventuele overblijvende hoeveelheid was buffer in de putjes.
- Voeg toe 25 µL van elke werkende mens cytokine standaard, QC1, QC2, lege (assay buffer) en monsters in de juiste putjes.
- Voeg toe 25 µL van assay buffer in elk putje.
- Voeg toe 25 µL van 1 X antilichaam kraal cocktail oplossing in elk putje. Als de oplossing van de kraal antilichaam lichtgevoelig is, afdichting van de plaat met plaat sealer en bedek het met aluminiumfolie te beschermen tegen licht tijdens de assay.
- Broeden de plaat bij 4 o C's nachts in een roteerapparaat. De plaat plaats
- op de rack plaat van een automatische magnetische plaat wasmachine. Laat het zitten voor 1 min te regelen van de magnetische kralen op de bodem van de put en de goed inhoud gecombineerd. Voeg 200 µL van was buffer per putje en laat het zitten voor 1 min en vervolgens gecombineerd de goed inhoud. Nogmaals het wassen (voor het wassen van de plaat, volg de kit-fabrikant ' s instructies).
- Voeg toe 25 µL van detectie antilichamen oplossing in elk goed, afdichting van de plaat, bedekken met aluminiumfolie en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten op een shaker.
- Voeg 25 µL van Streptavidin-Phycoerythrin oplossing in elk putje, afdichting van de plaat, bedekken met aluminiumfolie en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in een roteerapparaat.
- Plaats de plaat op een magnetische plaat wasmachine. Laat het zitten voor 1 min en vervolgens gecombineerd de goed inhoud. Voeg 200 µL van was buffer per putje. Laat het zitten voor 1 min en vervolgens gecombineerd de goed inhoud. Nogmaals de wash.
- Toevoegen 150 µL van schede vloeistof elk goed en plaats de plaat op een shaker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te resuspendeer de antilichaam-kralen.
- Lees de plaat onmiddellijk met behulp van de parel gebaseerd multiplex assay-afleesapparaat en analyseren van de cytokine concentraties met een 5-parameter curve-fitting algoritme. Een schema van de stroom van scheur cytokine profielen is afgebeeld in Figuur 1.
- Lezen van de assay plaat (instrument ingesteld) en data-analyse:
- Switch op de parel gebaseerd multiplex assay reader en pre warm de laser voor 30 min.
- Start de kraal gebaseerd multiplex assay software. Onder de ' geautomatiseerd onderhoud ' tab, selecteer het ' kalibratie-verificatie ' optie. Vortex elk reagens ampul van de calibratie and verificatie parels voor 30 s. plaats 5 druppels van elk reagens in de aangewezen putten. De aangewezen reservoirs Vul met gedeïoniseerd water en 70% ethanol.
- Maken een nieuw protocol
- opent de ' protocollen ' pagina en vervolgens de ' protocollen ' tab. Klik " nieuwe ProtocolŔ maken de ' instellingen ' tabblad wordt geopend.
- In de ' naam ' vak, typ de naam van het protocol.
- Typ een beschrijving in het vak aan de rechterkant van de ' naam ' vak.
- In de ' versie ' typt u de versie van het protocol.
- In de ' fabrikant ' typt u de informatie van de fabrikant voor het protocol.
- Definiëren instellingen in de ' overname-instellingen ' afdeling als volgt. Instellen ' Volume ': 100 µL, ' Timeout ': 60 s; ' DD Gating ': 8.000 tot 15.000; ' Verslaggever Gain ': standaard PMT; ' Bead type ': magnetische kraal.
- Definiëren instellingen in de ' analyse instellingen ' sectie, selecteren ' kwantitatieve ' als het soort analyse. Instellen ' aantal normen ': 6; ' Aantal besturingselementen ': 0; Tik de ' betekenen van repliceert ' vak;
Tik de ' analyseren van resultaten tijdens het verwerven van de monsters ' vak. - Klik op " NextŔ de ' analyten ' tab opent, klikt u op de gewenste analyten (bead ID) in het raster genummerde analyt.
- Klikken en typen de overeenkomstige analyt naam in de ' naam ' kolom rechts van de analyt raster (analyten ' namen en hun overeenkomstige kraal regio details werden vermeld in tabel 1).
- Klik en typ de gewenste maateenheid (d.w.z. pg/mL) in de ' eenheden ' vak aan de linkerkant van de ' van toepassing zijn alle ' knop. Klik vervolgens op " van toepassing zijn alle ".
- Klikken en typen de gewenste parel tellen voor elke analyt (d.w.z. 50) in de ' graaf ' vak. Klik op " alle toepassen ".
- Klik op " NextŔ het tabblad plaat-indeling wordt geopend. De putten voor de normen en selecteer Markeer " 2 " onder graaf repliceren en klik op de " S " standaard knop. Herhaal deze stap voor de achtergrond " B " en monsters " U " wells.
- Klik op " opslaan ".
- Maken nieuwe normen/controle veel
- Open de ' protocollen ' pagina, waarna de ' normen & besturingselementen ' tab. Klik op " maken nieuwe standaard/controle veel ".
- Open de ' Selecteer Protocol ' vak. Selecteer het protocol dat werd gemaakt in stap 1.5.3.
- Sleutel in de informatie van de normen dienovereenkomstig: Std/Ctrl-kit nummer, Std/Ctrl-kit naam, vervaldatum en fabrikant.
- Sleutel in de waarde van de hoogste standaard voor elke analyt (d.w.z. 10000 pg/mL). Toets 5 onder verdunning in en klik op " van toepassing zijn alle " voor het automatisch genereren van de verwachte concentraties voor de rest van de normen.
- Klik op " opslaan ".
- Maken een nieuwe partij van een bestaande protocol
- Open de ' partijen ' pagina en klik op " maken van een nieuwe Batch-tab van een bestaand Protocol ".
- Typ de batchnaam in de ' batchnaam ' vak en typ een beschrijving over de partij in de ' beschrijving invoeren ' vak.
- Klik op het protocol gegenereerd eerder (in stap 1.5.3).
- Klik op " NextŔ het volgende tabblad dat wordt geopend is de ' SOA's & Ctrls ' tab. de details weergeven van assay normen en selecteer " Next ".
- Op de ' plaat lay-out ' tab, toewijzen van goed opdrachten voor deze batch en klik op " opslaan " aan batch informatie opslaan en de ' in behandeling Batch ' lijst.
- Laden van de plaat in de kraal gebaseerd multiplex assay-afleesapparaat, roteer gedurende 5 min en uitvoeren van de partij van de lijst van in behandeling batch. Verkregen gegevens zullen worden opgeslagen in de bestandsindeling .csv.
- Gegevensanalyse
- het CSV-bestand gegenereerd op basis van de kraal gebaseerd multiplex assay software aan het .rbx bestand (bestand met resultaten) formaat met behulp van de rbx conversiesoftware converteert. Start de conversiesoftware, selecteer het CSV-bestand onder Selecteer xPONENT bestanden en klik op de " genereren " knop; het .rbx-bestand zal worden opgeslagen in de geselecteerde uitgang van de map.
- Start de analysesoftware en open het bestand .rbx.
- Optimaliseren de standaard krommen met behulp van de curve van de 4PL/5PL passen.
- Selecteren de volgende handelingen uit in het ' standaard Curve ' tabblad: ' Type regressie ': ' logistiek-5PLƆ ' as transformatie ': ' Log(x) - lineaire (y) Ɔ teek de ' Toon Conc bereik lijnen ' vak, Vink de ' Toon onbekend Monsters ' vak; Tik de ' controlemonsters Toon ' vak; Tik de ' toepassen over alle analyten ' vak; Tik de ' rapport laten zien na optimalisatie ' vak.
- Klik op de " optimaliseren " knop voor auto-optimalisering.
- Label de identiteit van de steekproef onder ' Voer monster Info ' tab.
- Verkrijgen van de waargenomen concentraties in het ' rapport tabel ' tab en klik op " verslag tabel exporteren " voor het genereren van de gegevens in een spreadsheet-bestand voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Scheur monsters werden verzameld uit 8 ogen van 4 gezonde proefpersonen gebruik scheur stroom strips en cytokine niveaus werden geanalyseerd met behulp van het hierboven genoemde protocol. Alle onderwerpen zijn mannelijke en de leeftijd van de vier onderwerpen was 36, 42, 44 en 52 jaar respectievelijk. Oogbeschadigingen en/of oppervlakte gezondheid en droge ogen ziekte werd beoordeeld door klinische tests (scheur film breken tijd, Schirmer van test, hoornvlies verkleuring, conjunctivale kleuring, deksel/meibomian klier onderzoek, hoornvlies scheur tekenen en visuele tekens en symptomen) volgens de Internationale droog oog Workshop, 2007 richtlijnen en geen van de onderwerpen toonde tekens en simptome van droge oogziekte. 31
Uit de 41 cytokines geanalyseerd, werden 31 cytokines ontdekt in alle de monsters van de scheur, IL-17A, MIP-1β en TNF-α werden ontdekt in 7 ogen van 4 onderwerpen, IL-4 werd ontdekt in 6 ogen van 4 onderwerpen, IFN-γ werd ontdekt in 6 ogen van 3 onderwerpen, IL-1A werd ontdekt in 5 ogen van 3 subj ECTS, eotaxin en IL-9 werden ontdekt in 3 ogen van 2 onderwerpen, IL-3 werd ontdekt in 1 oog en MIP-1α in geen van de monsters. De gemiddelde ± SD concentraties van 41 cytokines gedetecteerd bij gezonde proefpersonen met behulp van de kraal gebaseerd multiplex assay (Figuur 2) werden vermeld in tabel 2. Uit 41 cytokines geanalyseerd, was de IL-1ra gevonden moet worden sterk uitgedrukt in alle monsters met de gemiddelde ± SD van 203.9 ± 52.6 ng/mL en varieerden van 129.64 ng/mL tot 271.7 ng/mL. Cytokines IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, IL-8, EGF, PDGF-BB, VEGF en G-CSF waren ook zeer uitgedrukt (ng/mL hoeveelheden) in de tranen van gezonde proefpersonen en de resterende cytokines werden uitgedrukt in pg/mL hoeveelheden (tabel 2). De laagst gemeten concentratie van scheur cytokine was van TNF-α met de gemiddelde ± SD van 27.25 ± 19.97 pg/mL en varieerde van 10.75 pg/mL tot 56.02 pg/mL. In 31 cytokines die werden ontdekt in alle monsters, geen toonde een statistisch significant verschil in concentratie (p> 0.05) tussen het rechter en linker oog door t-test (Figuur 3).
Figuur 1: Schematisch diagram van de stroom van scheur cytokine profielen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: scheur van cytokine profielen bij gezonde mensen. Vertegenwoordiger scatterplot toont de log gemiddelde ± SD concentraties van 41 cytokinen in scheuren monsters verzameld van gezonde proefpersonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Inter eye scheur cytokine profiel verschillen in gezonde proefpersonen. Vertegenwoordiger scatterplot waaruit geen statistisch significant verschil (p> 0.05) scheur in de gemiddelde concentraties tussen oog van 31 cytokines in gezonde proefpersonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| S. nr. | Analyten | Kraal regio |
| 1 | EFG | 12 |
| 2 | FGF-2 | 13 |
| 3 | Eotaxin | 14 |
| 4 | TGF-Α | 15 |
| 5 | G-CSF | 18 |
| 6 | Flt - 3L | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | Fractalkine | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | GRO | 26 |
| 12 | IL-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | IL - 12P 40 | 29 |
| 15 | MDC | 30 |
| 16 | IL - 12P 70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17A | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1Α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1Β | 46 |
| 27 | IL-2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | IL-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | IL-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1Α | 72 |
| 37 | MIP-1Β | 73 |
| 38 | RANTES | 74 |
| 39 | TNFΑ | 75 |
| 40 | TNFΒ | 76 |
| 41 | VEGF | 78 |
Tabel 1: Analyten namen en de bijbehorende kraal regio details.
| S. nr. | Cytokine | Aantal ogen | Aantal onderwerpen | Gemiddelde concentraties | SD |
| 1 | EFG | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | Eotaxin | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | FGF-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | Flt - 3L | 8 | 4 | 475.4 | 133.6 |
| 5 | Fractalkine | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | G-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28.1 |
| 8 | GRO | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641.4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76,6 | 42.81 |
| 11 | IL-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41.52 |
| 12 | IL-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | IL-12 |
Tabel 2: Scheuren van cytokine profielen in gezonde proefpersonen. Bedoel ± SD concentraties van 41 cytokines gedetecteerd bij gezonde proefpersonen met behulp van de kraal gebaseerd multiplex assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytokines zijn kleine cellulaire secreted eiwitten en krachtige immuun modulatoren, regulering van de immuunrespons. 32 de expressieprofielen van diverse cytokinen in scheur monsters zijn gerelateerd aan verscheidene pathologische condities van het oog en studies over cytokine profielen helpen om te begrijpen van de mechanismen van de pathogenese van de ziekte, het vaststellen van oogbeschadigingen en/of gezondheid, Ernst van de ziekte, de diagnose en de progressie. 2 , 5 lagere eiwit concentraties en kleine steekproef volumes zijn de belangrijkste uitdagingen van traditionele methoden, beperking van het gebruik van tests als ELISA voor de analyse van de scheur cytokine profielen. 33 kraal gebaseerd multiplex assays zijn immunoassay, die verschillende voordelen ten opzichte van ELISA hebben. Kraal gebaseerd multiplex assays vereisen van kleinere volumes van het monster voor analyse van meerdere analyten en zijn uiterst gevoelige, voor het opsporen van picogram concentraties van eiwitten in biologische vloeistoffen van. 34
Wij rapporteren hier een gestandaardiseerd protocol voor de kwantitatieve analyse van 41 scheur cytokinen in gezonde mensen met behulp van de kraal gebaseerd multiplex assay. Uit de 41 cytokines in het deelvenster, kraal gebaseerd multiplex assay gedetecteerd 40 cytokines in scheur monsters en kon niet detecteren MIP-1α. Dit negatieve resultaat zou kunnen zijn omdat er niet detecteerbaar niveaus van MIP-1α in gezonde scheur monsters of als gevolg van een kleinere hoeveelheid tranen waren. Scheur monsters verzameld via Schirmer strips hebben een voordeel ten opzichte van andere methoden van de collectie zoals microcapillary buis en sponzen. Bijvoorbeeld, in verschillende klinische omstandigheden, scheur vloeistof volume kan worden gemeten door Schirmer strips en de scheur vloeistof kan worden geëlueerd uit de dezelfde strip na meting en gebruikt voor analyse van cytokine. 35 al microcapillary buizen routinematig gebruikt worden voor het verzamelen van tranen en produceren meer consistente scheur profielen, de procedure duurt langer dan de methode van de strip, is meer vervelend en kan worden ongemakkelijk voor kinderen en andere patiënten. Bovendien, deze methode kan ook veroorzaken reflex scheur productie door het aanraken van het bindvlies en variabele resultaten van cytokine profielen in vergelijking met basale tranen, zulks afbreuk doet aan de reproduceerbaarheid van de test. 36 in sommige klinische aandoeningen zoals de ziekte van droge ogen, traan sample collectie door Schirmer strips is betrouwbaar voor eiwit analyse en helpt bij de identificatie van biomarkers. 37 , 38
Kraal gebaseerd multiplex assays zijn een combinatie van stroom cytometry en multiplex ELISA waarin analyten in de steekproef worden ingeklemd tussen de specifieke antilichaam bekleed en kleur gecodeerd magnetische kralen of detectieantilichaam microbolletjes en biotinyleerd. Deze complexen kunnen worden gedetecteerd door de verslaggever molecuul streptavidine-Phycoerythrin (PE)-conjugaat en latere blootstelling aan een dubbele lasersysteem toe te voegen in een gewijzigde stroom cytometry gebaseerde instrument. 39 in een systeem van de dubbele laser is een laser prikkelt de interne kleurstoffen en zijn signaal vertegenwoordigt het gecoate specifieke antilichaam. De tweede laser prikkelt de rapportage molecuul PE geconjugeerde gebonden aan de complexe detectieantilichaam en de intensiteit van de signalen vertegenwoordigen de concentratie van de analyt.
Het vermogen van de microsferen worden gecodeerd met kleurstoffen van verschillende intensiteiten inschakelen de bepaling te detecteren tot 100 verschillende analyten in een kleine hoeveelheid van het monster in een enkele goed. 39 al kraal gebaseerd multiplex assays zijn snelle, reproduceerbare en vergelijkbaar met standaard ELISA testen,34,40 deze methode speciale instrumenten vereist, evaluatie van kits en standaardisatie van protocollen voor verschillende biologische monsters. 39 de aanwezigheid van auto-antistoffen in de klinische monsters invloed kan zijn op de kraal gebaseerd multiplex resultaten. 34 , 39 voor routinematig gebruik van deze tests in klinische instellingen, is het aanbevolen om het gebruik van de test-kits van een bepaalde fabrikant. De gevoeligheid, de detectie van absolute concentraties van cytokines, en reproduceerbaarheid werden gemeld om te variëren met de verschillende kits. 41 antilichaam microarrays of membraan microarrays zijn zeer gevoelig, goedkope alternatieve high throughput technieken die meerdere analyten detecteren in een klein volume van monsters en met succes kunnen worden toegepast op scheuren monsters voor de analyse van cytokines en andere eiwitten. 35 , 42 echter talrijke beperkingen bestaan, zoals deze testen zijn tijdrovend, semi-kwantitatieve, vertonen een hoge signaal-/ ruisverhouding en gebrek aan gestandaardiseerde protocollen. 19 , 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen. Geen financieel belang of belangenconflict.
Acknowledgments
Het onderzoekswerk werd gesteund door het centrum subsidie van Tan Tock Seng ziekenhuis gepersonaliseerd zaad financiering programma 2015; Singapore oog onderzoek instituut Pilot Grant en Tan Tock Seng ziekenhuis Pitch voor Fonds verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
