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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

आंसू Cytokine प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख

Published: October 13, 2017 doi: 10.3791/55993
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 4, 5, 3, 1
1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), 3Institute of Molecular and Cell Biology, A*STAR, 4GROW Research Laboratory, Narayana Nethralaya Foundation, 5Vimta Labs Limited

Summary

आंसू फिल्म साइटोकिंस का विश्लेषण विभिंन नेत्र रोगों के अध्ययन में मदद करता है । मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख सरल और संवेदनशील है और छोटे संस्करणों के साथ नमूनों में कई लक्ष्यों के परीक्षण को सक्षम करें । यहां हम आंसू फिल्म cytokine एक प्रयोग मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख रूपरेखा के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Abstract

आंसू फिल्म लिपिड, प्रोटीन और खनिज जो आंख की बाहरी सतह को शामिल किया गया है, जिससे स्नेहन, पोषण और अंतर्निहित कोशिकाओं को सुरक्षा प्रदान का एक जटिल मिश्रण है । आंसुओं का विश्लेषण भविष्यवाणी, निदान, और विभिन्न नेत्र रोगों के रोग का निदान के लिए एक उभरते हुए चिह्नों की पहचान के लिए क्षेत्र है । आँसू आसानी से सुलभ हैं और उनके संग्रह गैर इनवेसिव है । इसलिए, आगे बढ़ रही प्रौद्योगिकियों के आंसू में कई analytes की पहचान के लिए प्रमुखता प्राप्त कर रहे है प्रोटीन या metabolite संरचना और रोग की स्थिति के साथ अपने सहयोग में परिवर्तन का अध्ययन । आंसू साइटोकिंस आंख की सतह के स्वास्थ्य का अध्ययन करने और भी शुष्क नेत्र रोग और वसंत नेत्रश्लेष्मलाशोथ जैसे विभिंन नेत्र सतह विकारों के तंत्र को समझने में मदद करने के लिए आदर्श है । मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख एक उच्च संवेदनशीलता के साथ नमूना की एक छोटी राशि में कई analytes का पता लगाने की क्षमता है । यहां हम आंसू नमूना संग्रह, निष्कर्षण और एक मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख का उपयोग cytokine profiling के विश्लेषण के एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Introduction

आँसू अश्रु ग्रंथि और गौण ग्रंथियों और कोट आँख की बाहरी सतह द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । आंसू फिल्म एक बाहरी लिपिड परत और एक भीतरी जलीय परत है कि घुलनशील प्रोटीन, mucins और झिल्ली बंधे mucins शामिल हैं । आँसू माइक्रोबियल आक्रमण, आपूर्ति पोषक तत्वों को रोकने, और आंख की सतह को स्नेहन प्रदान करते हैं । आंसू हवा और कॉर्निया के लिए ऑक्सीजन परिवहन के लिए ऊतक के बीच एक अंतरफलक के रूप में कार्य करते हैं । 1 आंसू फिल्म प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, लिपिड और इलेक्ट्रोलाइट्स से बना है । आंख और मोतियाबिंद की तरह प्रणालीगत रोगों के साथ आंसू प्रोटीन के बीच संघ, शुष्क नेत्र रोग, वसंत नेत्रश्लेष्मलाशोथ, मधुमेह, थायराइड से जुड़े orbitopathy और कैंसर कई अध्ययनों में पहचान की गई है । 2 , 3 , 4 आंसू नमूने microcapillary ट्यूबों या आंसू प्रवाह स्ट्रिप्स (Schirmer स्ट्रिप्स) द्वारा एकत्र किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, Schirmer का परीक्षण कॉर्निया और अपवर्तन शल्य चिकित्सा क्लीनिकों में की गई एक मानक प्रक्रिया है, जिसके परिणाम cytokine विश्लेषण की परख के लिए उपयोग किए जा सकते हैं । गैर इनवेसिव नमूना संग्रह, जैव-नमूना की पहुंच, और विभिंन शारीरिक और रोग की स्थिति के साथ आंसू संरचना के संघ के कई नेत्र और प्रणालीगत रोगों के लिए आंसू फिल्म के एक संभावित स्रोत बनाने के लिए । 4 , 5 , ६

आंसू साइटोकिंस नेत्र सतह स्वास्थ्य और विभिंन नेत्र रोगों के भड़काऊ स्थितियों का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । आंसू के नमूनों में कई साइटोकिंस के 7 असामान्य सांद्रता शुष्क नेत्र रोग, वसंत keratoconjunctivitis (वीकेसी), atopic keratoconjunctivitis (AKC), मौसमी एलर्जी नेत्रश्लेष्मलाशोथ, और uveitis के साथ जुड़े होने की सूचना दी गई । 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 आंसू प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री, वेस्टर्न सोख्ता और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) जैसे पारंपरिक तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है । 14 , 15 हालांकि, इन पद्धतियों की सीमाएं गरीब संवेदनशीलता और प्रत्येक रोगी में एकाधिक आंसू साइटोकिंस के विश्लेषण के लिए आवश्यक नमूना की एक बड़ी मात्रा कर रहे हैं । 16 , 17 मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख के लिए जटिल मिश्रण के नमूनों में कई analytes का विश्लेषण और सफलतापूर्वक आंसू नमूनों पर लागू करने के लिए विभिंन रोगों में कई साइटोकिंस का विश्लेषण विकसित किया गया है । ६ , 18 सैंडविच एलिसा और फ्लो cytometry तकनीक का एक संयोजन इन परख सक्षम करने के लिए एक एकल नमूने में एकाधिक analytes के ठहराव के लिए एलिसा से अधिक संवेदनशील हो । 19 यह विधि नैदानिक नमूनों और सेल कल्चर supernatants की एक किस्म पर लागू किया जा सकता है और कई pathophysiological स्थितियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अध्ययन में मदद करता है । 20 , 21 , 22 , 23 , 24

वहां कई एलिसा के साथ मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख तुलना अध्ययन कर रहे है और तरीकों के बीच एक संबंध की सूचना दी है । लू एट अल. तुलना मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख adiponectin, resistin, लेप्टिन और मानव सीरम या प्लाज्मा नमूनों में ghrelin का पता लगाने के लिए पारंपरिक एलिसा के साथ और परख के बीच एक मजबूत सहसंबंध (r & #62; ०.९) की सूचना दी । 25 ड्यूपॉंट एट अल. मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख और एलिसा के पता लगाने के लिए il-1β, आईएल-4, आईएल-5, आईएल-6, आईएल-10, IFN-υ, और TNF-α में phytohemagglutinin और lipopolysaccharide में एक मजबूत संबंध की सूचना दी पूरे रक्त गर्भवती महिलाओं से एकत्र । 26 पिकरिंग एट अल. मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख और एलिसा के लिए सीरम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए Haemophilus इंफ्लूएंजा प्रकार बी polysaccharide (आर = 0.96) के बीच एक और मजबूत संबंध की सूचना दी, के toxoids क्लोस्ट्रीडियम tetani (r = 0.96), व Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91) । 27 Biagini एट अल. एक उच्च सकारात्मक सहसंबंध (आर = 0.852) मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख और एलिसा के बीच बैसिलस anthracis विरोधी पीए आईजीजी के सीरम नमूनों में पता लगाने के लिए की सूचना दी । 28 वांग एट अल. ने अल्जाइमर रोग का पता लगाने के लिए मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख और एलिसा के बीच संबंध की सूचना दी amyloid-β ४२ (r = 0.77), कुल ताऊ (आर = 0.94), और ताऊ phosphorylated पर एमिनो एसिड १८१ (आर = 0.82) में मस्तिष्कमेरु द्रव नमूने । 29 इन अध्ययनों से नैदानिक नमूनों की विविधता पर मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया है, छोटे नमूना मात्रा आवश्यकताओं और मानक एलिसा, जो मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख एक होनहार बनाने के साथ एक संबंध विभिंन रोग phenotypes में नमूनों के विभिंन प्रकार में कई analytes का पता लगाने के लिए पारंपरिक एलिसा तरीकों के लिए वैकल्पिक । यहां हम Schirmer स्ट्रिप्स का उपयोग कर स्वस्थ विषयों से एकत्र आंसू नमूनों में ४१ analytes के लिए cytokine की रूपरेखा के लिए मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए प्रोटोकॉल्स को टैन Tock सेंग हॉस्पिटल, सिंगापुर के इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड ने मंजूरी दी थी ।

< p class = "jove_title" > 1. मानिसहरु Cytokine विश्लेषण

  1. आंसू के संग्रह:
    1. विषय पूछने के लिए एक परीक्षा कुर्सी पर आराम से बैठते है और सिर के खिलाफ उसके सिर जगह है ।
    2. विषय पूछने के लिए ऊपर देखो, ध्यान से Schirmer स्ट्रिप्स (Whatman फिल्टर कागज no. ४१ के बने) खुला और आंख के अवर fornix पर पट्टी के गोल अंत जगह और 5 मिनट के लिए आंखें बंद करने के लिए विषय निर्देश । जबकि आंसू इकट्ठा करने के लिए आंख की सतह से संपर्क को कम करने के लिए बहुत ध्यान रखना । < सुप वर्ग = "xref" > ३०
    3. विषय पूछने के लिए अपनी आंखें खोलने के लिए पट्टी को हटाने और यह एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह है । तुरंत प्रयोगशाला या स्टोर करने के लिए ट्यूब हस्तांतरण पर-८० o C cytokine profiling के लिए परीक्षण तक.
    के
  2. से आंसू के रेफरेंस के सैंपल फाड़े प्रवाह पट्टी:
    1. आंसू प्रवाह पट्टी ०.५ सेमी की लंबाई में कटौती (करने के लिए आंसू की मात्रा का मानकीकरण परीक्षण किया जा) और यह एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह है.
    2. जोड 30 & #181; परख के एल बफर और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन 1 मिनट के लिए १४,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया ।
    3. एक और १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और पट्टी त्यागें । बर्फ पर ट्यूब युक्त नमूना प्लेस और cytokine profiling के लिए तुरंत eluted आंसू नमूने का उपयोग करें ।
  3. रिएजेंट की तैयारी:
    नोट: मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख द्वारा प्रत्येक नमूने में ४१ analytes का परीक्षण किया जाना है interleukin (IL)-1 & #945;, il-1 & #946;, आईएल-आर & #945, आईएल-2, आईएल-3, आईएल-4, आईएल-5, आईएल-6, आईएल-7, आईएल-8, आईएल-9, आईएल-10, आईएल-12 p40, आईएल-12 p70, आईएल-13, आईएल-15, आईएल-17A, इंटरफेरॉन-अल्फा (IFN-& #945;) 2, IFN-& #947;, IFN-गामा-inducible प्रोटीन 10 (IP-10, CXCL10), macrophage-व्युत्पन्न chemokine (एमडीसी), macrophage भड़काऊ प्रोटीन (मिप)-1 & #945; और मिप-1 & #946;, monocyte chemotactic प्रोटीन (एमसीपी)-1, एमसीपी-3, ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा (TNF-& #945;), TNF-& #946;, ग्रोथ-विनियमित oncogene (मूह), ट्यूमर ग्रोथ फैक्टर अल्फा (TGF-& #945;), संवहनी endothelial ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ़), एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF), fibroblast वृद्धि कारक (FGF)-2, प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF)-एए, PDGF-एबी/BB, granulocyte कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जी-सीएसएफ), granulocyte-macrophage कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ), eotaxin, fractalkine, घुलनशील CD40 ligand (sCD40L), एफएमएस की तरह tyrosine कळेनासे 3 ligand (Flt-3L) और सक्रियण पर विनियमित, सामांय टी सेल व्यक्त की और गुप्त प्रोटीन (rants) ।
    1. लाओ एंटीबॉडी मनका समाधान (50X) शीशियों को कमरे के तापमान (20 & #160;-25 ओ सी) और भंवर के लिए शीशियों 1 min.
    2. परख के लिए आवश्यक कुओं की संख्या की गणना, और कुल एंटीबॉडी मनका कॉकटेल समाधान की मात्रा की गणना (25 & #181; एल प्रति अच्छी तरह से) और प्रत्येक एंटीबॉडी मनका समाधान (50X) परख के लिए आवश्यक है ।
    3. प्रत्येक एंटीबॉडी मनका समाधान की गणना राशि जोड़कर कॉकटेल समाधान तैयार करें और मनका मंदक की शेष राशि को जोड़कर वांछित अंतिम मात्रा में भरें. सुनिश्चित करें कि कॉकटेल में प्रत्येक एंटीबॉडी की अंतिम एकाग्रता 1x है । pipetting त्रुटियों के मामले में हमेशा कॉकटेल समाधान की कम से 20% अतिरिक्त मात्रा तैयार करें ।
      नोट: एक उदाहरण के रूप में, ९६ के लिए अच्छी तरह से परख तैयार ३००० & #181; एंटीबॉडी मनका कॉकटेल समाधान के एल । प्रत्येक एंटीबॉडी मनका समाधान की आवश्यक राशि = 3000/स्टॉक एकाग्रता प्रत्येक एंटीबॉडी मनका समाधान; 3000/50 = ६० & #181; L येक एंटीबॉडी मनका हल
      1. जोड ६० & #181; l प्रत्येक के ४१ एंटीबॉडी मनका समाधान (६० X ४१ = २४६० & #181; L) एक कॉकटेल बोतल में और जोड़ें ५४० & #181; l मनका मंदक समाधान के एंटीबॉडी मनका मिश्रण को बनाने के लिए ३००० & #181; l अंतिम काम समाधान (1x).
      2. का उपयोग करने से पहले, मनका कॉकटेल समाधान ठीक से मिश्रण । परख के बाद शेष मात्रा 2-8 o C पर 30 दिनों के लिए स्टोर ।
    4. २५० & #181 जोड़कर गुणवत्ता नियंत्रण (qc) तैयार करें; L qc 1 और qc 2 शेयरों के लिए जल ।
    5. के लिए कई बार और भंवर की बोतलें पलटने से ठीक से मिश्रण 10 एस के लिए ठीक से लेबल microcentrifuge ट्यूबों के समाधान हस्तांतरण और शेष समाधान की दुकान पर-20 & #176; ग जिसका प्रयोग 30 दिनों तक किया जा सकता है ।
    6. २७० मिलीलीटर पानी को जोड़कर धो बफर तैयार करें 10x धो बफर समाधान के 30 मिलीलीटर और अच्छी तरह से मिश्रण (कमजोर पड़ने से पहले, कमरे के तापमान के लिए 10x बफर लाने और मिश्रण से सभी नमक हाला भंग) । अप्रयुक्त वाश बफ़र (1x) पर 2-8 & #176; C जो 30 दिनों तक उपयोग किया जा सकता है संग्रहीत करें ।
    7. तैयार करने के लिए मानव cytokine मानक स्टॉक (१०,००० स्नातकोत्तर/सभी analytes के एमएल) जोड़कर २५० & #181; L जल स्टॉक शीशी को कई बार पलटने और भंवरा 10 एस के लिए शीशी को अच्छी तरह से मिलाएं । यह 10 मिनट के लिए खड़े होने की अनुमति दें और स्टॉक समाधान हस्तांतरण ठीक से microcentrifuge ट्यूबों लेबल के लिए । परख के बाद, शेष समाधान पर स्टोर-20 & #176; C, जिसका उपयोग 30 दिनों तक किया जा सकता है ।
    8. 5 गुना सीरियल कमजोर पड़ने से काम कर रहे मानव cytokine मानकों को तैयार (५० & #181; l-& #62; २०० & #181; l) परख बफर के साथ २००० पाने के लिए, ४००, ८०, 16, और ३.२ स्नातकोत्तर/एमएल
    9. मानक तैयारी के बाद, ६० मिनट के भीतर काम कर मानकों का उपयोग करें और खाली/पृष्ठभूमि (-pg/
      10. के रूप में परख बफर का उपयोग करें
  4. Cytokine मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख द्वारा profile:
    1. उंहें ९६-well microtiter प्लेट में जोड़ने से पहले 5-10 सेकंड के लिए कमरे के तापमान और भंवर के लिए सभी रिएजेंटों लाओ । यदि eluted आंसू नमूने में संग्रहित कर रहे है-८० हे सी परख से पहले, गल बर्फ पर जमे हुए आंसू अर्क और 5 मिनट के लिए १००० X g पर केंद्रापसारक ।
    2. मानव cytokine मानकों के काम के लिए एक ऊर्ध्वाधर विंयास में एक परख काम शीट तैयार [0 (रिक्त), ३.२, 16, ८०, ४००, २,०००, और १०,००० स्नातकोत्तर/एमएल], QC1, QC2 और नमूने ।
    3. Add २०० & #181; 1x धोने के एल की एक अच्छी प्लेट के लिए बफर, प्लेट मुहर के साथ इसे सील और कमरे के तापमान पर एक प्लेट शेखर पर रखने के लिए (20-25 o C) 10 min.
      4. के लिए
    4. प्लेट औंधा और शोषक तौलिए पर यह दोहन कई बार कुओं में धोने बफर के किसी भी अवशिष्ट राशि को दूर करने के द्वारा 1x धो बफर नहीं कर सकते ।
    5. Add 25 & #181; प्रत्येक कार्यरत मानव cytokine मानक, QC1, QC2, रिक्त (परख बफर) और नमूनों के उपयुक्त कुओं में से एल.
    6. Add 25 & #181; प्रत्येक कुआं में परख बफर के एल ।
    7. Add 25 & #181; प्रत्येक कुआं में 1x एंटीबॉडी मनका कॉकटेल समाधान के एल । के रूप में एंटीबॉडी मनका समाधान प्रकाश संवेदनशील है, प्लेट मुहर के साथ प्लेट सील और यह एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर करने के लिए यह परख के दौरान प्रकाश से बचाने के लिए ।
    8. एक शेखर पर रात भर 4 ओ सी में थाली मशीन ।
    9. एक स्वत: चुंबकीय प्लेट वॉशर की प्लेट रैक पर थाली जगह है । यह अच्छी तरह से और महाप्राण अच्छी तरह से सामग्री के तल पर चुंबकीय मोतियों का निपटारा करने के लिए 1 मिनट के लिए बैठते हैं । Add २०० & #181; वॉश बफर के एल अच्छी तरह से प्रति और इसे 1 मिनट के लिए बैठते हैं और फिर अच्छी तरह से सामग्री महाप्राण. वॉश को एक बार फिर से दोहराएं (थाली धोने के लिए, किट निर्माता का पालन करें & #39; s निर्देश).
    10. Add 25 & #181; प्रत्येक कुआं में पहचान एंटीबॉडी समाधान के एल, प्लेट सील, यह एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर, और कमरे के तापमान पर ६० मिनट के लिए एक शेखर पर मशीन ।
    11. Add 25 & #181; Streptavidi के एलn-Phycoerythrin समाधान में एक अच्छी तरह से, प्लेट सील, यह एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर, और एक प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    12. एक चुंबकीय प्लेट वॉशर पर थाली जगह है । यह 1 मिनट के लिए बैठते हैं और फिर अच्छी तरह से सामग्री महाप्राण. Add २०० & #181; एल ऑफ वॉश बफर प्रति कुआं. यह 1 मिनट के लिए बैठते हैं और फिर अच्छी तरह से सामग्री महाप्राण. वॉश को एक बार फिर से दोहराएं ।
    13. Add १५० & #181; एक अच्छी तरह से म्यान द्रव के एल और एंटीबॉडी मोतियों को फिर से स्थगित करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक शेखर पर थाली जगह.
    14. प्लेट तुरंत मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख प्लेट रीडर का उपयोग कर पढ़ें और cytokine सांद्रता एक 5-पैरामीटर वक्र-फिटिंग एल्गोरिथ्म का उपयोग कर विश्लेषण । आंसू cytokine profile का एक योजनाबद्ध प्रवाह आरेख < सुदृढ वर्ग = "xfig" > आरेख 1 .
      15. में दिखाया गया है
  5. परख प्लेट (साधन स्थापित) और डेटा विश्लेषण पढ़ना:
    1. मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख रीडर पर स्विच और पूर्व 30 मिनट के लिए लेजर गर्म.
    2. ने मनका आधारित मल्टीप्लेक्स की परख सॉफ्टवेयर लांच की । Under & #39; स्वचालित रखरखाव & #39; टैब, & #39; अंशांकन-सत् & #39; विकल्प का चयन करें । भंवर 30 एस के लिए अंशांकन और सत्यापन मोतियों की प्रत्येक रिएजेंट शीशी नामित कुओं में प्रत्येक रिएजेंट के 5 बूंदें प्लेस । जल और ७०% इथेनॉल के साथ नामित जलाशयों भरें ।
    3. एक नया प्रोटोकॉल बना
      1. ओपन द & #39;P rotocols & #39; पेज और फिर द & #39;P rotocols & #39; tab. क्लिक करें & #34; नया प्रोटोकॉल बनाएं & #34;; द & #39; settings & #39; tab खुलेगा ।
      2. & #39; नाम & #39; बॉक्स में, प्रोटोकॉल का नाम लिखें ।
      3. के दाईं ओर बॉक् स में एक विवरण टाइप करें & #39; नाम & #39; box.
      4. & #39; version & #39; बॉक्स में, प्रोटोकॉल का संस्करण टाइप करें ।
      5. & #39; निर्माता & #39; बॉक्स में, प्रोटोकॉल के लिए निर्माता जानकारी लिखें ।
      6. & #39; प्राप्ति सेटिंग्स & #39; खंड में निम्नानुसार सेटिंग्स निर्धारित करें । सेट & #39; खंड & #39;: १०० & #181; ल, & #39; बाह्र & #39;: ६० s; & #39;DD गेटिंग & #39;: ८,००० to १५,०००; & #39; रिपोर्टर गेन & #39;: मानक पीएमटी; & #39; मनका प्रकार & #39;: चुंबकीय मनका.
      7. में सेटिंग्स निर्धारित करें & #39; विश्लेषण सेटिंग्स & #39; अनुभाग, चयन & #39; गुणात्मक & #39; विश्लेषण प्रकार के रूप में । Set & #39; मानकों की संख्या & #39;: 6; & #39; कण्ट्रोल की संख्या & #39;: 0; टिक & #39; मतलब की प्रतिकृति & #39; बॉक्स;
        टिक & #39; नमूने प्राप्त करते समय परिणाम का विश्लेषण & #39; box.
      8. Click & #34; अगला & #34;; द & #39; Analytes & #39; टैब खुलता है, क्रमांकित analyte ग्रिड में वांछित Analytes (मनका ID) पर क्लिक करें.
      9. क्लिक करें और इसी analyte नाम को टाइप करे & #39; नाम & #39; analyte ग्रिड के दाईं ओर स्तंभ (analytes & #39; नाम और उनके अनुरूप मनका क्षेत्र विवरण तालिका 1 में उल्लेख किया गया) ।
      10. क्लिक कर टाइप करें और माप की वांछित इकाई ( अर्थात pg/मब) म & #39; यूनिट्स & #39; बॉक् स के बायीं ओर & #39; लागू सभी & #39; बटन । फिर & #34 पर क्लिक करें; लागू केलेली & #34;.
      11. क्लिक कर टाइप करें और प्रत्येक analyte ( यानी ५०) के लिए वांछित मनका गिनती & #39; count & #39; बॉक्स में लिखें । Click & #34; लागू केलेली & #34;.
      12. Click & #34; अगला & #34;; प्लेट लेआउट टैब खुलता है । मानकों के लिए कुओं पर प्रकाश डाला और चयन & #34; 2 & #34; दोहराने की गणना के तहत और & #34; S & #34; मानक बटन पर क्लिक करें. पृष् ठभूमि के लिए यह चरण दोहराएँ & #34; ब & #34; व samples & #34; भ & #34; वेल्स.
      13. Click & #34; सेव & #34;.
    4. बनाने के नए मानक/
      1. ओपन द & #39;P rotocols & #39; पेज, और फिर द & #39; standards & #38; controls & #39; टैब क्लिक करें & #34; नया मानक/नियंत्रण बहुत बनाएं & #34;.
      2. Open the & #39; प्रोटोकॉल & #39; बॉक्स का चयन करें । चरण 1.5.3 में बनाए गए प्रोटोकॉल का चयन करें ।
        3. मानकों की जानकारी में
      3. कुंजी तदनुसार: एसटीडी/ctrl किट संख्या, एसटीडी/ctrl किट का नाम, समाप्ति और निर्माता ।
        4. प्रत्येक analyte के लिए उच्चतम मानक के मान में
      4. कुंजी ( अर्थात १०००० स्नातकोत्तर/ 5 में कुंजी कमजोर पड़ने के तहत और पर क्लिक करें & #34; लागू सभी & #34; स्वचालित रूप से शेष मानकों के लिए अपेक्षित सांद्रता उत्पन्न करने के लिए.
      5. Click & #34; सेव & #34;.
    5. मौजूदा प्रोटोकॉल से एक नया बैच बनाएं
      1. & #39; बैचेस & #39; पृष्ठ और क्लिक करें & #34; किसी मौजूदा प्रोटोकॉल से एक नया बैच टैब बनाएं & #34;.
      2. & #39; बैच नाम & #39; बॉक्स में बैच नाम टाइप करें और & #39 में बैच के बारे में वर्णन लिखें; वैकल्पिक विवरण & #39 दर्ज करें; box.
      3. पहले उत्पंन प्रोटोकॉल पर क्लिक करें (1.5.3 चरण में) ।
      4. Click & #34; अगला & #34;; अगला टैब जो खुलता है & #39; एसटीडी & #38; ctrls & #39; tab. परख मानकों का विवरण देखें और & #34 का चयन करें; अगला & #34;.
      5. पर & #39;P देर लेआउट & #39; टैब पर, इस बैच के लिए अच्छी तरह से आदेश असाइन करें और & #34; save & #34 के लिए बैच जानकारी बचाने के लिए #39 बैच समाप्त करना &;P; सूची.
      6. मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख प्लेट रीडर में प्लेट लोड, यह 5 मिनट के लिए शेक और बैच लंबित सूची से चलाने के लिए । प्राप्त किए गए डेटा को. csv फ़ाइल स्वरूप में सहेजा जाएगा ।
  6. डाटा एनालिसिस
    1. मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख सॉफ्टवेयर से उत्पंन. rbx फ़ाइल (परिणाम डेटा फ़ाइल) प्रारूप को rbx रूपांतरण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. csv फ़ाइल में कनवर्ट करें । रूपांतरण सॉफ़्टवेयर लॉंच करें, चुनें xPONENT file (s) के अंतर्गत. csv फ़ाइल चुनें और & #34 पर क्लिक करें; जनरेट & #34; बटन; चयनित आउटपुट फ़ोल्डर में. rbx फ़ाइल सहेजी जाएगी ।
    2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर लांच और. rbx फ़ाइल खोलें.
    3. मानक 4PL/5PL वक्र फिट का उपयोग घटता अनुकूलन ।
      1. & #39; मानक वक्र & #39; tab: & #39; प्रतीपगमन प्रकार & #39;: & #39; उपस्कर-5PL & #39;; & #39; अक्ष परिवर्तन & #39;: & #39; Log (x)-रेखीय (y) & #39;; टिक द & #39; दिखाएं ' एस एस एस श्रेणी लाइनों & #39; बॉक्स; टिक द & #39; अज्ञात दिखाएं samples & #39; बॉक्स; टिक & #39; नियंत्रण नमूने दिखाएं & #39; बॉक्स; टिक & #39; सभी analytes & #39; बॉक्स में लागू करें; टिक & #39; ऑप्टिमाइज़ेशन के बाद रिपोर्ट दिखाएं & #39; box.
      2. क्लिक करें & #34; ऑप्टिमाइज़ & #34; ऑटो-ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए बटन ।
      4. के
    4. लैबल के तहत नमूना पहचान को & #39; नमूना जानकारी & #39 दर्ज करें; tab.
    5. में स्वीकार्य सांद्रता प्राप्त करें & #39; रिपोर्ट तालिका & #39; टैब और & #34 पर क्लिक करे; निर्यात रिपोर्ट तालिका & #34; आगे विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में डेटा जनरेट करने के लिए.

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Representative Results

आंसू नमूने के 8 आंखों से एकत्र किए गए 4 स्वस्थ आंसू प्रवाह स्ट्रिप्स और cytokine स्तर का उपयोग कर विषयों उपर्युक्त प्रोटोकॉल का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । सभी विषय पुरुष थे और चार विषयों की आयु क्रमशः ३६, ४२, ४४ और ५२ वर्ष थी. नेत्र सतह स्वास्थ्य और शुष्क नेत्र रोग नैदानिक परीक्षणों द्वारा मूल्यांकन किया गया था (आंसू फिल्म समय तोड़, Schirmer के परीक्षण, corneal धुंधला, नेत्रश्लेष्मला धुंधला, ढक्कन/meibomian ग्रंथि परीक्षा, corneal आंसू संकेत और दृश्य लक्षण और लक्षण) के अनुसार अंतर्राष्ट्रीय शुष्क नेत्र कार्यशाला, २००७ दिशा निर्देशों और विषयों में से कोई भी कोई संकेत और शुष्क नेत्र रोग के लक्षण दिखाई । 31

४१ साइटोकिंस विश्लेषण के बाहर, 31 साइटोकिंस सभी आंसू नमूने में पाया गया, il-17A, मिप-1β और TNF-α 4 विषयों की 7 आंखों में पता लगाया गया था, आईएल 4 4 विषयों की 6 आंखों में पाया गया था, IFN-γ 3 विषयों की 6 आंखों में पाया गया था, il-1a 3 subj की 5 आंखों में पाया गया था ects, eotaxin और il-9 2 विषयों की 3 आंखों में पता लगाया गया, आईएल 3 में 1 आंख और नमूनों में से किसी में मिप-1α का पता लगाया गया था । ४१ साइटोकिंस की मतलब ± एसडी सांद्रता मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख (चित्रा 2) का उपयोग कर स्वस्थ विषयों में पाया गया तालिका 2में उल्लेख किया गया था । ४१ साइटोकिंस विश्लेषण के बाहर, IL-1ra उच्च २०३.९ ± ५२.६ एनजी/एमएल और १२९.६४ एनजी/एमएल के लिए २७१.७ एनजी/एमएल का मतलब ± एसडी के साथ सभी नमूनों में व्यक्त किया जा पाया गया । साइटोकिंस आईपी-10, मूह, एमसीपी-१, PDGF-एए, Fractalkine, आईएल-८, EGF, PDGF-बीबी, वीईजीएफ़ और जी-सीएसएफ में भी अत्यधिक व्यक्त (एनजी/एमएल मात्रा) स्वस्थ विषयों के आँसू में और शेष साइटोकिंस स्नातकोत्तर में व्यक्त किए गए थे एमएल मात्रा (तालिका २). आंसू cytokine की सबसे कम मापा एकाग्रता २७.२५ ± १९.९७ स्नातकोत्तर/एमएल के माध्य ± एसडी के साथ TNF-α था और १०.७५ स्नातकोत्तर/एमएल से ५६.०२ स्नातकोत्तर/ 31 साइटोकिंस में जो सभी नमूनों में पाए गए थे, उनमें से किसी ने एकाग्रता में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया (p& #62; ०.०५) टी-टेस्ट (चित्रा 3) द्वारा दाएं और बाएं आंख के बीच ।

Figure 1
चित्रा 1: आंसू cytokine profiling के योजनाबद्ध प्रवाह आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: स्वस्थ लोगों में cytokine प्रोफाइल आंसू । प्रतिनिधि scatterplot स्वस्थ विषयों से एकत्र आंसू नमूनों में ४१ साइटोकिंस के लॉग मतलब ± एसडी सांद्रता दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: अंतर-नेत्र आंसू स्वस्थ विषयों में cytokine प्रोफ़ाइल अंतर । प्रतिनिधि scatterplot दिखा रहा है कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर (p& #62; ०.०५) में अंतर-नेत्र मतलब सांद्रता 31 के स्वस्थ विषयों में आंसू साइटोकिंस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एस. नो. Analytes मनका क्षेत्र
1 egf 12
2 FGF-2 13
3 eotaxin 14
4 TGF-α 15
5 जी सीएसएफ 18
6 Flt-3L 19
7 जीएम-सीएसएफ 20
8 Fractalkine 21
9 IFNα2 22
10 IFNγ 25
11 मूह 26
12 आईएल-10 27
13 एमसीपी-3 28
14 IL-12P40 29
15 एमडीसी 30
16 IL-12P70 ३३
17 PDGF-AA ३४
18 आईएल-13 ३५
19 PDGF-AB/ ३६
20 आईएल-15 ३७
21 sCD40L ३८
22 IL-17A ३९
23 IL-1RA ४२
24 IL-1α ४४
25 आईएल-9 ४५
26 IL-1β ४६
27 आईएल-2 ४८
28 आईएल-3 ५१
29 आईएल-4 ५३
30 आईएल-5 ५५
31 आईएल-6 ५७
३२ आईएल-7 ६१
३३ आईएल-8 ६३
३४ आईपी-10 ६५
३५ एमसीपी-1 ६७
३६ मिप-1α ७२
३७ मिप-1β ७३
३८ rants ७४
३९ TNFα ७५
४० TNFβ ७६
४१ वीईजीएफ़ ७८

तालिका 1: Analytes नाम और इसी मनका क्षेत्र विवरण ।

एस. नो. cytokine आँखों की संख्या विषयों की संख्या मतलब सांद्रता एसडी
1 egf 8 4 २६१०.२९ १७११.५६
2 eotaxin 3 2 ४०४.७३ २६०.७६
3 FGF-2 8 4 ८२७.७३ २६२.४४
4 Flt-3L 8 4 ४७५.४ १३३.६
5 Fractalkine 8 4 ४१७९.०८ १८८८.३८
6 जी सीएसएफ 8 4 १२८७.५७ ६३३.१६
7 जीएम-सीएसएफ 8 4 ९३.०३ २८.१
8 मूह 8 4 २३१७६.८७ १८६९२.०७
9 IFNa2 8 4 ६४१.४ २५३.५५
10 IFNg 6 3 ७६.६ ४२.८१
11 आईएल-10 8 4 १०१.३२ ४१.५२
12 आईएल-12 p40 8 4 २४५.४६ १३३.०१
13 आईएल-12
p70 8 4 १६५.५३ ७३.०९ 14 आईएल-13 8 4 ६८५.८४ २७२.९२ 15 आईएल-15 8 4 १०४.४ ३०.६६ 16 IL-17A 7 4 १६४.३२ २८.६९ 17 IL-1a 5 3 २८६.७९ १६६.८७ 18 आईएल -1 बी 8 4 ६३.९८ १८.२९ 19 IL-1ra 8 4 २०३८९२.५८ ५२५९३.४८ 20 आईएल-2 8 4 ७८.३५ २५.१५ 21 आईएल-3 1 1 ३८.२ 0 22 आईएल-4 6 4 २६८.९४ १२०.८४ 23 आईएल-5 8 4 ७४.९६ २३.८ 24 आईएल-6 8 4 ८६.९७ २७.७८ 25 आईएल-7 8 4 ३८४.०८ १५३.५७ 26 आईएल-8 8 4 ३६१५.२१ ४६७७.५ 27 आईएल-9 3 2 ३५.२२ ५.११ 28 आईपी-10 8 4 ८७५४६.२६ ३३२५६.५३ 29 एमसीपी-1 8 4 १००७४.७३ ८२०५.५ 30 एमसीपी-3 8 4 ३७६.१३ १२०.६८ 31 एमडीसी 8 4 ९६८.०८ ३०९.३९ ३२ मिप-1b 7 4 १९९.७२ ८४.७९ ३३ PDGF-AA 8 4 ५१७४.०६ ४१०३.९७ ३४ PDGF-बीबी 8 4 २५६७.६१ ९१९.०१ ३५ rants 8 4 ७४२.४१ ४५७.५७ ३६ TGF-एक 8 4 ४०७.८२ ३३९.१२ ३७ TNFa 7 4 २७.२५ १९.९७ ३८ TNFb 8 4 १२४ २४.१६ ३९ वीईजीएफ़ 8 4 १६०१.२ ७७६.८५ ४० sCD40L 8 4 ९३२.१ ५०९.२७ ४१ मिप-1a 0 0 0 0

तालिका 2: स्वस्थ विषयों में आंसू cytokine प्रोफाइल । ४१ साइटोकिंस की ± एसडी सांद्रता मतलब मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख का उपयोग कर स्वस्थ विषयों में पता चला ।

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Discussion

साइटोकिंस छोटे सेलुलर स्रावित प्रोटीन और शक्तिशाली प्रतिरक्षा मॉडुलन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित कर रहे हैं । ३२ आंसू नमूनों में विभिन्न साइटोकिंस की अभिव्यक्ति प्रोफाइल आंख की विभिन्न रोग स्थितियों से संबंधित हैं और cytokine प्रोफाइल पर अध्ययन रोग रोगजनन के तंत्र को समझने में मदद, नेत्र स्वास्थ्य की स्थिति का निर्धारण, रोग गंभीरता, निदान और प्रगति । 2 , 5 कम प्रोटीन सांद्रता और छोटे नमूने की मात्रा पारंपरिक तरीकों की मुख्य चुनौतियों, आंसू cytokine प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए एलिसा की तरह परख के उपयोग को सीमित कर रहे हैं । ३३ मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख immunoassays हैं, जो एलिसा पर विशिष्ट लाभ है । मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख एकाधिक analytes के विश्लेषण के लिए छोटे नमूने की मात्रा की आवश्यकता होती है और अत्यधिक संवेदनशील, जैविक तरल पदार्थ में प्रोटीन की picogram सांद्रता का पता लगाने में सक्षम । ३४

यहां हम ४१ के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट स्वस्थ लोगों में आंसू साइटोकिंस मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख का उपयोग कर । पैनल में ४१ साइटोकिंस में से, मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख ने आंसू के नमूनों में ४० साइटोकिंस का पता लगाया और मिप-1α का पता नहीं लगा सके । यह नकारात्मक परिणाम हो सकता है क्योंकि वहां मिप के undetectable स्तर थे स्वस्थ आंसू नमूनों में या आंसू की एक छोटी मात्रा के कारण 1α । आंसू नमूने Schirmer स्ट्रिप्स का उपयोग कर एकत्र microcapillary ट्यूब और स्पंज की तरह अन्य संग्रह तरीकों पर एक फायदा है. उदाहरण के लिए, कई नैदानिक स्थितियों में, आंसू द्रव की मात्रा Schirmer स्ट्रिप्स द्वारा मापा जा सकता है और आंसू द्रव माप के बाद एक ही पट्टी से eluted किया जा सकता है और cytokine विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया । ३५ हालांकि microcapillary ट्यूबों नियमित रूप से आंसू इकट्ठा करते है और अधिक अनुरूप आंसू प्रोफाइल का उत्पादन कर रहे हैं, प्रक्रिया पट्टी विधि से अधिक समय लगता है, और अधिक थकाऊ है, और बच्चों और अंय रोगियों के लिए असहज हो सकता है । इसके अलावा, इस विधि भी कंजाक्तिवा छू और बेसल आंसू की तुलना में cytokine प्रोफाइल के चर परिणामों का उत्पादन द्वारा पलटा आंसू उत्पादन प्रेरित कर सकते हैं, जिससे परख के reproducibility को प्रभावित । ३६ शुष्क नेत्र रोग की तरह कुछ नैदानिक स्थितियों में, Schirmer स्ट्रिप्स द्वारा आंसू नमूना संग्रह प्रोटीन विश्लेषण के लिए विश्वसनीय है और यह की पहचान में मदद करता है । ३७ , ३८

मनका आधारित मल्टीप्लेक्स की परख फ्लो cytometry और मल्टीप्लेक्स एलिसा का एक संयोजन है जिसमें नमूने में analytes विशिष्ट एंटीबॉडी लेपित और रंग कोडित चुंबकीय मोतियों या microspheres और biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी के बीच सैंडविच हैं । इन परिसरों रिपोर्टर अणु Streptavidin-Phycoerythrin (पीई) संयुग्म और एक संशोधित प्रवाह cytometry-आधारित साधन में एक दोहरी लेजर प्रणाली के लिए बाद में जोखिम को जोड़कर पता लगाया जा सकता है । एक दोहरी लेजर प्रणाली में ३९ , एक लेजर आंतरिक रंगों को उत्तेजित और उसके संकेत लेपित विशिष्ट एंटीबॉडी का प्रतिनिधित्व करता है । दूसरी लेजर रिपोर्टिंग अणु पीई संयुग्म का पता लगाने एंटीबॉडी जटिल और संकेतों की तीव्रता से बंधे को उत्तेजित analyte की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

microspheres की क्षमता अलग तीव्रता के रंजक के साथ कोडित किया जा करने के लिए एक अच्छी तरह से नमूना की एक छोटी मात्रा में १०० अलग analytes को पता लगाने के लिए परख सक्षम. ३९ हालांकि माला आधारित मल्टीप्लेक्स परख तेजी से कर रहे हैं, प्रतिलिपि, और मानक एलिसा परख के लिए तुलनीय,३४,४० इस विधि समर्पित उपकरणों, किट और के लिए प्रोटोकॉल के मानकीकरण के मूल्यांकन की आवश्यकता है विभिन्न जैविक नमूनों । ३९ नैदानिक नमूनों में ऑटो-एंटीबॉडी की उपस्थिति मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परिणामों को प्रभावित कर सकती है. ३४ , नैदानिक सेटिंग्स में इन परख के नियमित उपयोग के लिए ३९ , यह एक विशिष्ट निर्माता से परख किट का उपयोग करने की सिफारिश की है । संवेदनशीलता, साइटोकिंस की निरपेक्ष सांद्रता का पता लगाने, और reproducibility अलग किट के साथ भिन्न होने की सूचना दी गई. ४१ एंटीबॉडी microarrays या झिल्ली microarrays अत्यधिक संवेदनशील, सस्ती वैकल्पिक उच्च प्रवाह तकनीकों जो नमूनों की एक छोटी मात्रा में कई analytes का पता लगाने और के विश्लेषण के लिए आंसू नमूने पर सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है साइटोकिंस और अंय प्रोटीन । ३५ , ४२ हालांकि, कई सीमाएं मौजूद हैं, के रूप में इन परख समय लेने वाले हैं, अर्द्ध मात्रात्मक, एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदर्शन, और मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी है । 19 , ४३

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है । कोई वित्तीय हित या हितों का संघर्ष ।

Acknowledgments

अनुसंधान कार्य टैन Tock सेंग अस्पताल निजीकृत बीज अनुदान कार्यक्रम २०१५ से केंद्र अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; सिंगापुर नेत्र अनुसंधान संस्थान पायलट ग्रांट और टैन Tock सेंग अस्पताल की पिच के लिए फंड अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit Merck, USA HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument  Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software  Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1 BIO-RAD, France
Plate shaker Corning, USA
TECAN Microplate Washer Tecan, Switzerland HydroSpeed
Vortex Genie 2 Scientific Industries inc, USA G560E
Pipettes Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube Axygen, USA MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip Eye Care and Cure, USA 101657
Flexmap 3D Calibration Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-028
Flexmap 3D Verfication Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-029
Ocular examination chair

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इम्यूनोलॉजी अंक १२८ आँसू cytokine profile मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख साइटोकिंस आंख की सतह नेत्र रोग
आंसू Cytokine प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख
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Balne, P. K., AU, V. B., Tong, L.,… More

Balne, P. K., AU, V. B., Tong, L., Ghosh, A., Agrawal, M., Connolly, J., Agrawal, R. Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles. J. Vis. Exp. (128), e55993, doi:10.3791/55993 (2017).

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