Summary
Анализ слезоточивый фильм цитокинов помогает в изучении различных глазных заболеваний. Мультиплекс шарик на основе простых и чувствительной и включить тестирование нескольких целей в образцах с небольшими объемами. Здесь мы описываем протокол для слезоточивый фильм цитокина профилирования с использованием бисера на основе мультиплекс пробирного.
Abstract
Слезной пленки представляет собой сложную смесь липидов, белков и минералов, которая охватывает внешней поверхности глаза, тем самым обеспечивая смазки, питания и защиты в базовой ячейки. Анализ слез является новой областью для идентификации биомаркеров для прогнозирования, диагностики и прогноз различных глазных заболеваний. Слезы легко доступны и их коллекции является неинвазивным. Таким образом продвижение технологии приобретают известность для идентификации нескольких аналитов в слезах для изучения изменений в составе белка или метаболита и его связь с патологических состояний. Слезоточивый цитокины являются идеальным биомаркеров для изучения здоровья глазной поверхности, а также помочь в понимании механизмов различных глазной поверхности расстройств, таких как сухой глаз болезни и весеннем конъюнктивите. Шарик на основе мультиплекс анализов имеют возможность обнаружения нескольких аналитов в небольшое количество образцов с высокой чувствительностью. Здесь мы описываем стандартизированный протокол взятия образца, извлечения и анализа цитокина профилирования с использованием бисера мультиплекс пробирного.
Introduction
Слезы производятся слезных желез и аксессуаров желез и пальто внешней поверхности глаза. Слезной пленки состоит из наружной липидного слоя и внутренний водный слой, который включает в себя растворимые белки, муцин и мембраной связаны муцин. Слезы предотвращения вторжения микробов, поставки питательных веществ и обеспечивают смазку поверхности глаза. Слезы действовать как интерфейс между воздухом и ткани для транспорта кислорода к роговице. 1 слезной пленки состоит из белков, углеводов, липидов и электролитов. Ассоциация между слезоточивый белки с глазной и соматических заболеваний, как глаукома, заболевания сухой глаз, весеннем конъюнктивите, сахарный диабет, офтальмопатии связанных с щитовидной железы и рака была обнаружена в нескольких исследованиях. 2 , 3 , 4 слезоточивый образцы могут быть собраны, микрокапиллярной трубы или разрыв потока полосы (Ширмер полоски). Кроме того Ширмер испытаний является стандартной процедурой в роговице и рефракционной хирургии клиники, результаты которого могут использоваться для анализа анализов цитокина. Неинвазивная проб, доступность био-образца и Ассоциация слезоточивый композиции с различных физиологических и патологических условиях сделать слезной пленки потенциальным источником биомаркеров для нескольких глазных и соматических заболеваний. 4 , 5 , 6
Слеза цитокинов играет важную роль в изучении глазной поверхности здоровья и воспалительных процессов различных глазных заболеваний. 7 аномальные концентрации ряда цитокинов в образцах слезоточивый сообщалось ассоциироваться с сухой глаз болезни, весенний кератоконъюнктивит (VKC), атопический кератоконъюнктивит (АКС), сезонный аллергический конъюнктивит и увеита. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 слезоточивый белки могут быть проанализированы традиционными методами как масс-спектрометрии, Западный blotting и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА). 14 , 15 однако ограничения этих методов являются бедные чувствительность и больший объем выборки, необходимых для анализа нескольких слезоточивый цитокинов у каждого пациента. 16 , 17 мультиплекс анализов шарик на основе разработаны для анализа нескольких аналитов в сложной смеси образцов и успешно применяется на слезоточивый образцы для анализа нескольких цитокинов в различных заболеваний. 6 , 18 A сочетание сэндвич ELISA и потока цитометрии методы позволяют эти анализы стать более чувствительными, чем ELISA для количественного определения нескольких аналитов в одном образце. 19 этот метод может применяться на различных клинических образцов и supernatants культуры клеток и помогает в изучении иммунных реакций в некоторых патофизиологических условий. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Есть несколько исследований, сравнение шарик на основе мультиплекс assays ELISA и сообщили о корреляции между методами. Лоо et al. по сравнению шарик на основе мультиплекс пробирного с обычными ELISA для обнаружения адипонектина, resistin, лептина и Грелин в образцах сыворотки или плазмы и сообщил сильная корреляция (r > 0,9) между анализов. 25 Dupont et al. сообщили сильная корреляция между мультиплекс шарик на основе анализов и ELISA для обнаружения ИЛ 1β, Ил-4, Ил-5, IL-6, Ил-10, ИФН ϒ и ФНО α в фитогемагглютинина и липополисахарида стимулировали цельной крови собранные из беременных женщин. 26 Пикеринг et al. сообщили еще сильная корреляция между шарик на основе мультиплекс пробирного и ELISA для обнаружения сыворотке антител к гемофилического гриппа типа b полисахарид (r = 0,96), анатоксинов Столбнячная палочка (r = 0,96) и Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Бьяджини et al. сообщили высокая положительная корреляция (r = 0.852) между шарик на основе мультиплекс пробирного и ELISA для обнаружения Bacillus anthracis анти PA IgG в образцах сыворотки. 28 Wang et al. сообщили корреляцию между шарик на основе мультиплекс пробирного и ELISA для обнаружения болезни Альцгеймера биомаркеров амилоид β 42 (r = 0,77), Общая Тау (r = 0,94) и Тау фосфорилированных на аминокислоты 181 (r = 0,82) в образцов спинномозговой жидкости. 29 эти исследования продемонстрировали, что применимость шарик мультиплекс анализов на основе различных клинических образцов, меньшего объема требований образца и корреляция с стандартным ELISA, которые делают мультиплекс анализов шарик на основе перспективных альтернативой для традиционных методов ELISA для обнаружения нескольких аналитов в различных типов образцов в различных заболеваний фенотипов. Здесь мы описываем стандартизированный протокол для бисера на основе мультиплекс assay для цитокина профилирования для 41 аналитов в пробах слезоточивый из здоровых испытуемых с помощью Ширмер полоски.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
протоколы, используемые в данном исследовании были утверждены институционального обзора Советом больницы Тан Ток Сенг, Сингапур.
1. рвать Cytokine анализ
- коллекции слез:
- спросить предмет комфортно сидеть на стуле экспертизы и место его головой подголовник.
- Спросить предмет искать, тщательно открыть Ширмер полоски (из фильтра ватман № 41) и поместите округлые конец полосы на нижний свод глаза и поручить тему закрывать глаза на 5 мин. Во время сбора слезы заботятся для сведения к минимуму глазной поверхности контакта. 30
- спросить предмет открыть свои глаза, чтобы удалить полосу и поместите его в стерильных 1,5 мл microcentrifuge. Немедленно передать трубку лаборатории или магазина на-80 o C до тестирования для профилирования цитокина.
- Элюции слезоточивый образца от слезоточивого газа потока:
- сократить разрыв потока газа длиной 0,5 см (для стандартизации количество слез испытываемого) и поместите его в стерильных 1,5 мл microcentrifuge.
- Добавить 30 мкл пробирного буфера и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин после центрифугирования трубку 14.000 x g за 1 мин
- Передача супернатант в другую трубу microcentrifuge 1,5 мл и отказаться от полосы. Поместите образцы, содержащие трубку на льду и немедленно использовать образец eluted слезоточивый для профилирования цитокина.
- Подготовка реагентов:
Примечание: сорок один аналитов быть проверен в каждом образце шарик на основе мультиплекс пробирного являются интерлейкина (IL)-1α, ИЛ 1β, Ил-Rα, IL-2, IL-3, Ил-4, Ил-5, Ил-6, IL-7, IL-8, IL-9, Ил-10, P40 Ил-12, Ил-12 p70, IL-13, Ил-15, IL-17а, интерферон альфа (ИФН α) 2, ИФН γ, ИФН гамма индуцибельной белков 10 (ИС-10, CXCL10), Макрофаг производные хемокиновых (MDC), макрофагов воспалительные белки (MIP)-1α и MIP-1β, Моноцит белков эозинофилов (MCP) -1, ФНО β, регулируемого роста онкогенов (GRO), фактор роста опухоли альфа (TGF-α), Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фибробластов, МКП-3, альфа-фактора некроза опухоли (ФНО α) фактор роста (ФБП) -2, тромбоцитов, полученных фактор роста (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), eotaxin, fractalkine, растворимые лигандом CD40 (sCD40L), ФМС как тирозин киназа 3 лиганда (Flt - 3 Л) и регулируется после активации, нормальный Т-клеток и выделяется белка (RANTES).- ,
- Принести флаконы раствор (50 X) шарик антитела к комнатной температуре (20-25 o C) и вихревой флаконы за 1 мин
- Количество скважин, необходимых для анализа и рассчитать количество всего антитела шарик коктейль решение (25 мкл на хорошо) и каждый раствор антител шарик (50 X) необходимых для assay.
- Подготовить коктейль решение путем добавления желаемого конечного объема подсчитанная сумма каждой шарик раствор антител и заполнить, добавив оставшееся количество бисера разбавителя. Убедитесь, что конечная концентрация каждого антитела в коктейль 1 X. Всегда готовить по крайней мере 20% дополнительный объем раствора коктейль в случае дозирования ошибок.
Примечание: В качестве примера для assay 96-луночных подготовить 3000 мкл антител шарик коктейль решения. Необходимое количество каждого антитела шарик решения = 3000/фондовый концентрация каждого антитела шарик решения; 3000/50 = 60 мкл каждого антитела шарик решения- Добавить 60 мкл каждого из решений шарик 41 антитела (60 X 41 = 2460 мкл) в коктейль бутылку и 540 мкл шарик разбавителя решения в смесь антител шарик сделать 3000 мкл финал Рабочий раствор (1 X).
- До использования, смешать коктейль решение шарик правильно. После того, как assay хранить остальные тома на 2-8 o C на срок до 30 дней.
- Подготовить контроля качества (QC) путем добавления 250 мкл деионизированная вода запасов QC 1 и КК 2.
- Mix правильно инвертирование бутылки несколько раз и вихревой 10 s. передачи решение должным образом помечены Трубы полипропиленовые microcentrifuge и хранить оставшийся раствор при-20 ° C, которые могут быть использованы на срок до 30 дней.
- Подготовка мыть буфера путем добавления 30 мл 10 X 270 мл деионизированной воды промывочный раствор буфера и хорошо перемешать (до растворения, довести 10 X буфер до комнатной температуры и распустить все соли преципитаты путем смешивания). Храните неиспользованные мыть буфера (1 X) при 2-8 ° C, которые могут быть использованы на срок до 30 дней.
- Подготовить человека цитокина приклада (10 000 пг/мл всех аналитов) путем добавления запасов флакон 250 мкл деионизированной водой. Смесь хорошо, переворачивать несколько раз и вихревой флакон 10 s. позволяют ему постоять 10 мин и передачи акций решение должным образом помечены Трубы полипропиленовые microcentrifuge. После анализа, хранить оставшийся раствор при-20 ° C, которые могут быть использованы на срок до 30 дней.
- Подготовить стандарты человеческого цитокина работы по 5 раз серийных разведений (50 мкл - > 200 мкл) с Пробирной буфер для получения 2000, 400, 80, 16 и 3.2 пг/мл.
- После стандарта подготовки, использовать стандарты работы в течение 60 мин и использовать аналитический буфер как пустой/фон (-ПГ/мл).
- Цитокина профилирования, шарик на основе мультиплекс пробирного:
- довести все реагенты до комнатной температуры и вихревые для 5-10 секунд перед их добавлением в 96-луночных микротитровальных пластины. Если eluted слезоточивый образцы хранятся в -80 o C до assay, оттепель замороженных слезоточивый выдержки на льду и центрифуги на 1000 X g 5 мин
- Подготовить рабочий лист пробирного в вертикальной конфигурации для человека цитокина стандарты работы [0 (пусто), 3.2, 16, 80, 400, 2000 и 10 000 пг/мл], QC1, образцы и QC2.
- Добавить 200 мкл 1 X мыть буфер для каждой хорошо пластины, запечатать его с sealer пластины и держать его на шейкере пластины при комнатной температуре (20-25 o C) 10 мин
- Сцеживаться 1 X мыть буфера, инвертирование пластину и коснитесь его на абсорбента полотенца несколько раз, чтобы удалить любые остаточные количество мыть буфера в скважинах.
- Добавить 25 мкл каждого рабочего человека цитокина стандарт, QC1, QC2, пустой (assay buffer) и образцы в соответствующие ячейки.
- Добавить 25 мкл аналитического буфера в каждой скважине.
- Добавить 25 мкл 1 X антитела шарик коктейль решение в каждой скважине. Как шарик раствор антител светочувствительных, печать пластины с sealer пластины и накрыть алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света во время assay.
- Инкубировать пластину на 4 o C на ночь на шейкере.
- Место пластину на полке плиты машина автоматическая магнитные пластины. Пусть это сидеть в течение 1 мин отстояться магнитные шарики в нижней части скважины и аспирационная хорошо содержимое. Добавить 200 мкл буфера мыть за хорошо и дайте ему сидеть за 1 мин и затем аспирационная хорошо содержимое. Еще раз повторяю мыть (для мытья пластины, следуйте изготовителем комплекта ' s инструкции).
- Добавить 25 мкл раствора обнаружения антител в каждый хорошо, печать пластину, накрыть алюминиевой фольгой и инкубации при комнатной температуре 60 мин в шейкере. 25 мкл
- Streptavidin фикоэритрин решения в каждой скважине, печать пластину, накрыть алюминиевой фольгой и инкубации при комнатной температуре за 30 минут на шейкере.
- Место пластину на магнитные пластины шайбу. Пусть это сидеть в течение 1 мин и затем аспирационная хорошо содержимое. 200 мкл буфера мытья в колодец. Пусть это сидеть в течение 1 мин и затем аспирационная хорошо содержимое. Еще раз повторяю мыть.
- Добавить 150 мкл оболочка жидкости каждый хорошо и поместить пластину на шейкер для 5 мин при комнатной температуре для Ресуспензируйте антител бусины.
- Читать пластину, немедленно с помощью шарика на основе мультиплекс пробирного пластины reader и анализа концентрации цитокинов, с помощью алгоритма построения кривой 5-параметра. Принципиальная схема слезоточивый цитокина профилирования показано на рис. 1.
- Чтения пробирного пластины (инструмент создан) и анализа данных:
- выключатель на шарик на основе мультиплекс пробирного читателя и предварительно теплой лазера для 30 мин
- Запуск программного обеспечения мультиплекс пробирного шарик на основе. Под ' автоматизированное обслуживание ' вкладку, выберите ' калибровки проверка ' вариант. Вихревой каждого реагента флаконе калибровка и поверка бисера для 30 s. место 5 капель каждого реагента в назначенный скважины. Заполнить места для резервуаров с деионизированной воды и 70% этанол.
- Создать новый протокол
- Открыть ' протоколы ' страницы и затем ' протоколы ' tab. Нажмите " создать новый ProtocolŔ ' параметры ' откроется вкладка.
- В ' имя ' введите имя протокола.
- Введите описание в поле справа от ' имя ' коробке.
- В ' версии ' введите версию протокола.
- В ' производитель ' введите информацию производителя для протокола.
- Определить параметры в ' приобретения параметры ' раздел следующим образом. Задать ' объем ': 100 мкл, ' ожидания ': 60 s; ' DD стробирования ': 8000-15000; ' Репортер получить ': Стандартный ПЛТ; ' Бусинка типа ': магнитный шарик. В
- определить параметры ' параметры анализа ' раздела, выбрав ' количественный ' как тип анализа. Задать ' количество стандартов ': 6; ' Количество элементов управления ': 0; Тик ' означает реплицирует ' коробки;
Тик ' анализировать результаты при приобретении образцы ' коробке. - Нажмите " NextŔ ' аналитов ' вкладке откроется, нажмите на желаемый аналитов (шарик ID) в сетке пронумерованных аналита.
- Нажмите кнопку и введите имя соответствующего аналита в ' имя ' столбец справа от сетки исследуемое вещество (аналитов ' были упомянуты имена и их соответствующие детали региона шарик в таблице 1).
- Нажмите кнопку и введите нужную единицу измерения (то есть пг/мл) в ' единиц ' поле слева от ' применить все ' кнопку. Затем нажмите " применить все ".
- Нажмите и введите нужный шарик рассчитывать для каждого исследуемое вещество (т.е. 50) в ' количество ' поле. Нажмите " применить все ".
- Нажмите " NextŔ, откроется вкладка Макет пластины. Выделите скважин для стандартов и выберите " 2 " под реплицировать фото и нажмите на " S " стандартной кнопки. Повторите этот шаг для фона " B " и образцы " U " скважин.
- Нажмите " сохранить ".
- Создать новые стандарты управления много
- открытые ' протоколы ' страницы и затем ' стандартов & контроля ' tab. Нажмите " создать новый стандарт управления много ".
- Открыть ' выберите протокол ' поле. Выберите протокол, который был создан в шаге 1.5.3.
- Ключ в информации стандартов соответственно: Std/Ctrl номер комплекта, Std/Ctrl kit имя, срок действия и производителя.
- Ключ в значение высокий стандарт для каждого исследуемое вещество (т.е. 10000 пг/мл). Ключ в 5 под разрежения и нажмите на " применить все " для автоматической генерации ожидаемые концентрации для остальной части стандартов.
- Нажмите " сохранить ".
- Создать новый пакет из существующего протокола
- открытые ' пакетов ' страницы и нажмите кнопку " создать новый пакет вкладку из существующего протокола ".
- Введите имя пакета в ' имя пакета ' поле и введите описание о пакете в ' введите необязательное описание ' коробке.
- Нажмите на протоколе, созданный ранее (в действии 1.5.3).
- Нажмите " NextŔ, Следующая вкладка, которая открывает ' ЗППП & Ctrls ' Вкладка Просмотр сведений о анализа стандартов и выберите " Следующая ".
- На ' пластины макет ' вкладку, назначить также команды для этого пакета и нажмите кнопку " сохранить " сохранить пакет информации для ' отложенный пакет ' список.
- Загрузить пластину в считывающее устройство плита мультиплекс пробирного шарик на базе, встряхните его на 5 мин и запустить пакет из списка ожидающих партии. Полученные данные будут сохранены в формате CSV файла.
- Анализ данных
- преобразовать CSV-файл, созданный из программного обеспечения мультиплекс пробирного шарик на основе .rbx формат файла (результаты данных), с помощью rbx преобразования программного обеспечения. Запуск преобразования программного обеспечения, выберите CSV-файл под файлы выберите xPONENT и нажмите на " генерировать " кнопку; файл .rbx будет сохранен в выбранной выходной папке.
- Запуск программного обеспечения для анализа и откройте файл .rbx.
- Оптимизировать стандартных кривых с помощью кривой 4PL/5PL.
- Выберите следующее в ' калибровочной кривой ' вкладка: ' тип регрессии ': ' материально 5PLƆ ' оси трансформации ': ' Log(x) - линейная (y) Ɔ тик ' Показать Conc диапазона линии ' коробки; галочку ' Показать неизвестные Образцы ' поле; Тик ' Показать контрольные образцы ' поле; Тик ' применить во всех аналитов ' поле; Тик ' Показать отчет после оптимизации ' коробке.
- Нажмите " оптимизировать " кнопка auto-оптимизации.
- Ярлык образец удостоверения под ' введите образец информация ' таб
- Получить наблюдаемых концентраций в ' таблица отчета ' вкладке и нажмите на " экспорт отчета таблицы " для создания данных в файл электронной таблицы для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Слеза образцы были собраны от 8 глаз 4 здоровых испытуемых, используя слезоточивый поток полос и уровни цитокина были проанализированы с использованием упомянутых выше протокола. Все предметы были мужского пола и возраста четырех предметов было 36, 42, 44 и 52 лет соответственно. Сухой глаз и глазной поверхности здоровья заболевания была оценена клинических испытаний (слезоточивый фильм перерыв время, Ширмер тест, окрашивание роговицы, конъюнктивы окрашивание, крышка/мейбомиевых желез экспертизы, роговицы слезоточивый знаки и визуальные знаки и симптомы) согласно Международный семинар сухой глаз, руководство 2007 и ни один из субъектов показал любые признаки и симптомы болезни сухого глаза. 31
Из 41 цитокинов проанализированы 31 цитокинов были обнаружены во всех пробах слезоточивый, IL-17а и MIP-1β, ФНО α были обнаружены в 7 глаза 4 предметов, Ил-4 был обнаружен в 6 глаза 4 предметов, ИФН γ был обнаружен в 6 глаза 3 субъектов, IL-1A был обнаружен в 5 глаза 3 пожалуйста ECTS, eotaxin и IL-9 были обнаружены в 3 глаза 2 предметов, Ил-3 был обнаружен в 1 глаз и MIP-1α ни в одном из образцов. В таблице 2были упомянуты среднее ± SD концентрации 41 цитокинов, обнаруженных в здоровых испытуемых с использованием бисера на основе мультиплекс пробирного (рис. 2). Из 41 цитокинов проанализированы IL-1ra был найден весьма выражаться во всех образцах с среднее ± SD 203.9 ± 52.6 нг/мл и варьировались от 129.64 нг/мл 271.7 нг/мл. Цитокины IP-10, ГРУ, МКП-1, PDGF-AA, Fractalkine, IL-8, EGF, PDGF-BB, VEGF и G-CSF были также весьма выразил (количества нг/мл) в слезах здоровых испытуемых и остальные цитокинов были выражены в ПГ/мл количествах (Таблица 2). Низкая концентрация слезоточивый цитокина был ФНО α с среднее ± SD 27.25 ± 19.97 пг/мл и варьировались от 10,75 пг/мл до 56.02 пг/мл. В 31 цитокины, которые были обнаружены во всех пробах, никто не показал статистически значимого различия в концентрации (p> 0,05) между правый и левый глаз, t тест (Рисунок 3).
Рисунок 1: Принципиальная схема слезоточивый цитокина профилирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: слеза цитокинового профиля в здоровых людей. Представитель рассеяния показаны журнала среднее ± SD концентрации 41 цитокинов в слезу пробах здоровых испытуемых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: меж глаз слеза цитокинового профиля различия в здоровых испытуемых. Представитель рассеяния, показаны не выявлено статистически значимой разницы (p> 0,05) в концентрации между глаз от 31 слезу цитокинов в здоровых испытуемых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| S. № | Аналитов | Шарик регион |
| 1 | EGF | 12 |
| 2 | ФБП-2 | 13 |
| 3 | Eotaxin | 14 |
| 4 | TGF-Α | 15 |
| 5 | G-CSF | 18 |
| 6 | Флайт - 3 Л | 19 |
| 7 | ГМ КСФ | 20 |
| 8 | Fractalkine | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | ГРУ | 26 |
| 12 | ИЛ-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | ИЛ - 12P 40 | 29 |
| 15 | MDC | 30 |
| 16 | ИЛ - 12P 70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17А | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1Α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1Β | 46 |
| 27 | ИЛ-2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | ИЛ-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | ИЛ-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1Α | 72 |
| 37 | MIP-1Β | 73 |
| 38 | RANTES | 74 |
| 39 | TNFΑ | 75 |
| 40 | TNFΒ | 76 |
| 41 | VEGF | 78 |
Таблица 1: Аналитов имена и соответствующие данные региона шарик.
| S. № | Цитокинов | Количество глаз | Количество предметов | Средние концентрации | SD |
| 1 | EGF | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | Eotaxin | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | ФБП-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | Флайт - 3 Л | 8 | 4 | 475.4 | 133.6 |
| 5 | Fractalkine | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | G-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | ГМ КСФ | 8 | 4 | 93.03 | 28.1 |
| 8 | ГРУ | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641.4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76,6 | 42.81 |
| 11 | ИЛ-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41,52 |
| 12 | Ил-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | ИЛ-12 |
Таблица 2: Слезу цитокинового профиля в здоровых испытуемых. Средний ± SD концентрации 41 цитокинов, обнаруженных в здоровых испытуемых с использованием мультиплексных пробирного шарик на основе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цитокины являются маленькие сотовой секретируемые белки и мощным иммунных модуляторов, регулировании иммунной реакции. 32 выражение профили различных цитокинов в слезу образцы связаны с различных патологических состояний глаз и исследования cytokine, профили помогают понять механизмы патогенеза заболевания, определить состояние здоровья глаза, тяжесть заболевания, диагностика и прогрессии. 2 , 5 более низкой концентрации белка и небольшой образец тома являются основные проблемы традиционных методов, ограничивая использование анализы как ELISA для анализа слезоточивый цитокинового профиля. 33 шарик на основе мультиплекс анализов являются immunoassays, которые имеют явные преимущества над ELISA. Шарик на основе мультиплекс анализы требуют меньших объемах выборки для анализа нескольких аналитов и чувствительный, способный обнаруживать пикограмм концентрации белков в биологических жидкостях. 34
Здесь мы приводим стандартизированный протокол для количественного анализа 41 слезоточивый цитокинов у здоровых людей, с использованием мультиплексных пробирного шарик на основе. Из 41 цитокинов в панели шарик на основе мультиплекс assay обнаружено 40 цитокинов в образцах слезоточивого и не мог обнаружить MIP-1α. Этот отрицательный результат может быть потому, что там были неопределяемого уровня MIP-1α в образцах здоровых слезоточивый или из-за меньшего объема слез. Слеза образцы, собранные с помощью Ширмер полоски имеют преимущество перед другими методами сбора как микрокапиллярной трубки и губки. Например, можно измерить объем слезной жидкости в нескольких клинических условиях, Ширмер полоски и разрыву жидкости могут быть этого eluted из же газа после измерения и используется для анализа цитокина. 35 хотя микрокапиллярной трубы обычно используются для сбора слезы и производить более последовательной слезоточивого профилями, процедура занимает больше времени, чем метод газа, более утомительно и может быть неудобно для детей и других пациентов. Кроме того этот метод может также вызвать рефлекторный слезоточивый производства, прикоснувшись конъюнктивы и переменной результатов цитокинового профиля по сравнению с базальной слезы, влияя тем самым на воспроизводимость анализа. 36 в некоторых клинических условиях, таких как сухой глаз болезни, взятия образца Ширмер полосами надежна для анализа белка и помогает в определении биомаркеров. 37 , 38
Шарик на основе мультиплекс анализов являются сочетанием проточной цитометрии и мультиплексной ELISA, в котором аналитов в образце прослоены между специфическим антителом покрытием и цвет кодированная магнитные шарики или микросферы и биотинилированным обнаружения антител. Эти комплексы могут быть обнаружены путем добавления репортер молекулы конъюгата стрептавидина фикоэритрин (PE) и последующего воздействия на систему двойного лазерного в изменение потока документа на основе цитометрии. 39 в двойной лазерной системы, один лазерный возбуждает внутренних красителей и его сигнал представляет покрытием специфическое антитело. Второй лазер возбуждает отчетности молекулы PE конъюгата, обязан обнаружения антител комплекса и интенсивность сигналы представляют собой концентрации аналита.
Микросферы возможность быть закодированы с помощью красителей различную возможность проба для выявления до 100 различных аналитов в малом объеме выборки в одной скважине. 39 хотя шарик мультиплекс анализов быстрого, воспроизводимые и сопоставимы с стандартным assays ELISA,34,40 этот метод требует специальных инструментов, оценки наборы и стандартизации протоколов для различных биологических образцов. 39 наличие авто антител в клинических пробах может повлиять на результаты мультиплекс шарик на основе. 34 , 39 для обычного использования этих анализов в клинических условиях, рекомендуется использовать наборы assay из одного конкретного производителя. Чувствительность, обнаружение абсолютной концентрации цитокинов и воспроизводимость сообщалось зависят от различных комплектов. Microarrays антитела 41 или мембраны microarrays очень чувствительны, недорогих альтернативных высокопроизводительных методов, которые обнаружить несколько аналитов в небольшом объеме образцов и может успешно применяться на слезу проб для анализа цитокинов и другие белки. 35 , 42 однако, многочисленные ограничения существуют, как эти анализы являются временными затратами, полу количественных, демонстрируют высокое соотношение сигнал шум и отсутствие стандартизированных протоколов. 19 , 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать. Без финансовых интересов или конфликта интересов.
Acknowledgments
Научно-исследовательская работа была поддержана центр грант от Тан Tock Сенг больница персонализированные семян финансирования программы к 2015 году; Сингапур глаз исследовательский институт пилот Грант и Тан Ток Сенг больницы шаг за фонда субсидии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
