Summary
Analys av tårfilmen cytokiner hjälper till att studera olika ögonsjukdomar. Bead baserat multiplex analyser är enkla och känslig och aktivera testning av flera mål i prover med små volymer. Här beskriver vi ett protokoll för tear film cytokin profilering ett använder pärla baserat multiplex assay.
Abstract
Tårfilmen är en komplex blandning av lipider, proteiner och mineraler som täcker den yttre ytan av ögat, vilket ger smörjning, näring och skydd till underliggande celler. Analys av tårar är en framväxande område för identifiering av biomarkörer för prediktion, diagnos och prognos av olika ögonsjukdomar. Tårar är lättillgängliga och deras samling är icke-invasiv. Därför vinner framryckande teknik framträdande för identifiering av flera analyter i tårar att studera förändringar i protein eller metabolit sammansättning och dess samband med sjukdomstillstånd. Tår cytokiner är idealisk biomarkörer för att studera hälsa i den okulära ytan och också hjälpa att förstå mekanismerna bakom olika okulära ytan störningar som kroniskt torra ögon och vernal konjunktivit. Bead baserat multiplex analyser har förmåga att upptäcka flera analyter i en liten mängd av provet med en högre känslighet. Beskriver här vi ett standardiserat protokoll för tår provtagning, extraktion och analys av cytokin profilering med en pärla baserat multiplex assay.
Introduction
Tårar produceras av tårkörteln och tillbehör körtlar och bestryka den yttre ytan av ögat. Tårfilmen består av en yttre lipidskikt och en inre vattenskiktet som innehåller lösliga proteiner, muciner och membran bundna muciner. Tårar förhindra mikrobiell invasion, levererar näringsämnen och ger smörjning till den okulära ytan. Tårar fungera som förbindelselänk mellan luft och vävnad för syretransport till hornhinnan. 1 tårfilmen består av proteiner, kolhydrater, lipider och elektrolyter. Associationen mellan tår proteiner med okulära och systemiska sjukdomar som kroniskt torra ögon, glaukom, diabetes mellitus, vernal konjunktivit, sköldkörtel-associerade orbitopathy och cancer har upptäckts i flera studier. 2 , 3 , 4 tår prover kan samlas in av microcapillary rör eller tårflöde remsor (Schirmer remsor). Dessutom är den Schirmer's test ett standardförfarande som utförs i hornhinnan och refraktiv kirurgi kliniker, vars resultat kan användas för cytokin analys analyser. Icke-invasiv provtagning, tillgänglighet av bio-förlagan, och föreningen av tår sammansättning med olika fysiologiska och patologiska förhållanden gör tear film en potentiell källa till biomarkörer för flera okulära och systemiska sjukdomar. 4 , 5 , 6
Tår cytokiner spelar en viktig roll i att studera den okulära ytan hälsa och inflammatoriska tillstånd i olika ögonsjukdomar. 7 onormala koncentrationer av flera cytokiner i tår prover rapporterades vara associerade med kroniskt torra ögon, vernal keratokonjunktivit (VKC), atopisk keratokonjunktivit (AKC), säsongsbunden allergisk konjunktivit och uveit. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 tår proteiner kan analyseras genom traditionella metoder såsom masspektrometri, western blotting och enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). 14 , 15 begränsningarna av dessa metoder är dock dålig känslighet och en större volym av provet krävs för analys av flera tår cytokiner hos varje patient. 16 , 17 pärla baserat multiplex analyser har utvecklats för att analysera flera analyter i komplex blandning prover och tillämpats på tår prover att analysera flera cytokiner i olika sjukdomar. 6 , 18 A kombination av sandwich-ELISA och flöde flödescytometri tekniker möjliggör dessa analyser att bli känsligare än ELISA för kvantifiering av flera analyter i ett enda prov. 19 denna metod kan tillämpas på en mängd kliniska prover och cell cellkulturer och hjälper till i studien av immunsvaret i flera patofysiologiska förhållanden. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
I området i närheten finns det flera studier jämförde pärla baserat multiplex-analyser med ELISA och har rapporterat ett samband mellan metoderna. Loo et al. jämförde pärla baserat multiplex assay med konventionella ELISA för detektion av adiponectin, resistin, leptin och ghrelin i humant serum eller plasma prover och rapporterade en stark korrelation (r > 0,9) mellan analyserna. 25 Dupont et al. rapporterade en stark korrelation mellan pärla baserat multiplex analyser och ELISA-test för påvisande av IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ och TNF-α i phytohemagglutinin och lipopolysackarid stimuleras helblod samlat från gravida kvinnor. 26 Pickering et al. rapporterade en annan stark korrelation mellan pärla baserat multiplex assay och ELISA-test för påvisande av serumantikroppar till Hemophilus influensa typ b polysackarid (r = 0,96), toxoider av Clostridium tetani (r = 0,96), och Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Biagini et al. rapporterade en hög positiv korrelation (r = 0,852) mellan pärla baserat multiplex assay och ELISA-test för påvisande av Bacillus anthracis anti-PA IgG i serumprover. 28 Wang et al. rapporterade en korrelation mellan pärla baserat multiplex assay och ELISA-test för påvisande av Alzheimers sjukdom biomarkörer amyloid-β 42 (r = 0,77), totalt tau (r = 0,94), och tau fosforyleras på aminosyran 181 (r = 0,82) i cerebrospinalvätska prover. 29 dessa studier har visat tillämpligheten av pärla utifrån olika kliniska prover, mindre prov volymkrav och en korrelation med standard ELISA, som gör pärla baserat multiplex analyser en lovande multiplex analyser alternativ till traditionell ELISA metoder för detektion av flera analyter i annan typ av prover i olika sjukdomen fenotyper. Här beskriver vi ett standardiserat protokoll för bead baserat multiplex assay för cytokin profilering för 41 analyter i tår prover som tagits från friska försökspersoner med Schirmer remsor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
de protokoll som används i denna studie godkändes av den institutionella Granskningsnämnden Tan Tock Seng Hospital, Singapore.
1. Riva cytokin analys
- samling av tårar:
- be motivet att sitta bekvämt på en undersökning stol och placera hans/hennes huvud mot nackstödet.
- Be motivet att titta, försiktigt öppna Schirmer remsorna (gjorda av filterpapper Whatman nr 41) och placera den runda änden av remsan på sämre fornix i ögat och instruera föremål att stänga ögonen för 5 min. Samtidigt samla tårarna tar stor omsorg att minimera okulär kontaktyta. 30
- be motivet att öppna sina ögon för att ta bort remsan och placera det i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör. Genast över röret till laboratoriet eller förvaras vid-80 o C tills testning för cytokin profilering.
- Eluering av tår prov från tår flöde strip:
- klippa tår flöde remsan till en längd på 0,5 cm (för att standardisera mängden tårar ska testas) och placera den i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Lägg till 30 µL assay buffert och odla i rumstemperatur 5 minuter följt av centrifugering röret vid 14 000 x g i 1 min.
- Överför supernatanten till en annan 1,5 mL mikrocentrifug rör och kassera remsan. Placera provet som innehåller röret på is och använda eluerade tår provet omedelbart för cytokin profilering.
- Beredning av reagens:
Obs: de fyrti en analyterna som ska testas i varje prov med pärla baserat multiplex assay är interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-inducerbara protein 10 (IP-10, CXCL10), makrofag-derived chemokine (MDC), makrofag inflammatoriska proteinet (MIP)-1α och MIP-1β, monocyt kemotaktiska protein (MCP) -1, MCP-3, tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α), TNF-β, tumör tillväxt factor alpha (TGF-α), epidermal tillväxtfaktor (EGF), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), tillväxt-reglerade onkogen (GRO), fibroblast tillväxtfaktor (FGF) -2, trombocyter härrör tillväxtfaktor (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, granulocyt granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF), granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, lösliga CD40 ligand (sCD40L), Fms-liknande Tyrosin Kinas 3 ligand (Flt - 3L) och reglerade vid aktivering, normala T-celler uttrycks och utsöndras protein (RANTES).- Ta antikropp pärla lösning (50 X) flaskorna till rumstemperatur (20-25 o C) och vortex injektionsflaskorna för 1 min.
- Räkna antalet brunnar behövs för analysen, och beräkna mängden totala antikropp pärla cocktail lösning (25 µL per brunn) och varje antikropp pärla lösning (50 X) behövs för analysen.
- Bereda cocktail-lösning genom att lägga till det beräknade beloppet för varje antikropp pärla lösning och fyll till önskad slutlig volym genom att lägga till det resterande beloppet av pärla spädningsvätska. Se till att varje antikropp i cocktail slutliga koncentration 1 X. Förbered alltid minst 20% extra volym cocktail lösning vid pipettering fel.
Obs: Som ett exempel, för en 96 brunnar analys förbereda 3000 µL antikropp pärla cocktail lösning. Den erforderliga mängden av varje antikropp pärla lösning = 3000/lager koncentration varje antikropp pärla lösning; 3000/50 = 60 µL av varje antikropp pärla lösning- lägga till 60 µL av varje av de 41 antikropp pärla lösningarna (60 X 41 = 2460 µL) till en cocktail flaska och lägga till 540 µL pärla spädningsvätska lösning till den antikropp pärla blandningen som gör 3000 µL av final fungerande lösning (X 1).
- Före användning, pärla cocktail lösningen blandas ordentligt. Efter analysen lagra den återstående volymen på 2-8 o C i upp till 30 dagar.
- Förbereda kvalitetskontroller (QC) genom att lägga till 250 µL avjoniserat vatten till QC 1 och QC 2 bestånd.
- Blanda ordentligt genom att invertera flaskorna flera gånger och vortex för 10 s. överföring lösningen på korrekt märkt polypropylen mikrocentrifugrör och lagra återstående lösningen vid-20 ° C som kan användas i upp till 30 dagar.
- Förbered tvättbufferten genom att lägga till 270 mL avjoniserat vatten till 30 mL 10 X tvätta buffertlösning och blanda väl (före utspädning, ta 10 X bufferten till rumstemperatur och upplösa alla salt fällningar av blandning). Förvara oanvända tvättbuffert (1 X) vid 2-8 ° C som kan användas i upp till 30 dagar.
- Förbereda humant cytokin standard beståndet (10 000 pg/mL av alla analyter) genom att lägga till 250 µL avjoniserat vatten till injektionsflaskan med lager. Blanda väl genom att vända flera gånger och vortex injektionsflaskan för 10 s. låt det stå i 10 min och överföra stamlösning till korrekt märkt polypropylen mikrocentrifugrör. Efter analysen, lagra den återstående lösningen vid-20 ° C, som kan användas i upp till 30 dagar.
- Förbereda arbetande människors cytokin standarder genom 5 gånger seriespädningar (50 µL - > 200 µL) med Analysbuffert att få 2000, 400, 80, 16 och 3,2 pg/mL.
- Efter standardpreparatet, använda arbetsnormer inom 60 min och använda analysbuffert som tom/bakgrund (-pg/mL).
- Cytokin profilering av pärla baserat multiplex assay:
- ta alla reagenser till rumstemperatur och vortex för 5-10 sekunder innan de läggs till 96 brunnar mikrotiterplattan. Om eluerade tår proverna lagras vid -80 o C före analysen, Tina upp de frusna tår extrakt på is och centrifugera 1000 X g för 5 min.
- Förbereda en assay arbetsblad i en vertikal konfiguration för att arbeta humant cytokin standarder [0 (tomma), 3.2, 16, 80, 400, 2 000 och 10 000 pg/mL], QC1, QC2 och prover.
- Tillsätt 200 µL av 1 X tvättbuffert till varje brunn av plattan, försegla det med plattan sealer och hålla den på en tallrik shaker i rumstemperatur (20-25 o C) i 10 min.
- Dekantera 1 X tvättbuffert genom att vända plattan och tryck det på absorberande handdukar flera gånger att ta bort eventuella kvarvarande mängden tvättbuffert i brunnarna.
- Lägg till 25 µL av varje arbetande människors cytokin standard, QC1, QC2, tom (analysbuffert) och patientprover i lämpliga brunnar.
- Lägg till 25 µL analysbuffert i varje brunn.
- Lägg till 25 µL av 1 X antikropp pärla cocktail lösning i varje brunn. Antikropp pärla lösningen är ljuskänsligt, försegla plattan med plattan sealer och täck den med aluminiumfolie att skydda den från ljus under analysens.
- Inkubera plattan på 4 o C över natten på en skakapparat.
- Placera plattan på platta racket av en automatisk magnetbordet brickan. Låt det sitta i 1 min att reglera de magnetiska pärlorna längst ned i brunnen och aspirera väl innehållet. Tillsätt 200 µL av tvättbuffert per brunn och låt det sitta i 1 min och sedan aspirera väl innehållet. Upprepa tvätten igen (plattan tvätt, följ kit tillverkaren ' anvisningar).
- Lägg till 25 µL upptäcka antikroppar lösning till varje väl, försegla plattan, täck den med aluminiumfolie och odla i rumstemperatur i 60 min på en skakapparat.
- Tillsätt 25 µL av Streptavidin-fykoerytrin lösning i varje brunn, försegla plattan, täck den med aluminiumfolie och odla i rumstemperatur i 30 min på en skakapparat.
- Placera plattan på en magnetisk platta bricka. Låt det sitta i 1 min och sedan aspirera väl innehållet. Tillsätt 200 µL av tvättbuffert per brunn. Låt det sitta i 1 min och sedan aspirera väl innehållet. Upprepa tvätten igen.
- Tillsätt 150 µL av slida vätska till varje brunn och placera plattan på en shaker för 5 min i rumstemperatur för att resuspendera antikropp pärlorna.
- Läs plattan omedelbart med pärla baserat Plattläsare med multiplex assay och analysera de cytokin koncentrationer med en 5-parametern kurva-montering algoritm. En schematisk Flödesdiagram för tår cytokin profilering visas i figur 1.
- Läsa assay plattan (instrument inrättats) och analys av data:
- Switch på Pärlan baserat multiplex assay läsare och före varma laser för 30 min.
- Starta programvaran pärla baserat multiplex assay. Under den ' automatiserat underhåll ', Välj den ' kalibrering-verifiering ' alternativet. Vortex varje reagens injektionsflaska av kalibrering och verifiering pärlor för 30 s. Placera 5 droppar av varje reagens i utsedda brunnar. Fyll de utsedda reservoarerna med avjoniserat vatten och 70% etanol.
- Skapa ett nytt protokoll
- öppna den ' protokoll ' sida och sedan den ' protokoll ' tab. klick " skapa nya ProtocolŔ den ' inställningar ' flik öppnas.
- i den ' namn ' rutan, Skriv namnet på protokollet.
- Skriv en beskrivning i rutan till höger om den ' namn ' låda.
- i den ' Version ' anger versionen av protokollet.
- i den ' tillverkaren ' Skriv information om tillverkaren för protokollet.
- Definiera inställningar i det ' förvärvet inställningar ' avsnitt som följer. Ange ' volym ': 100 µL, ' Timeout ': 60 s; ' DD Gating ': 8,000 till 15.000; ' Reporter vinst ': Standard PMT; ' Bead typ ': magnetiska pärla.
- Definiera inställningar i den ' inställningar ' avsnitt, välja ' kvantitativa ' som analystypen. Ange ' antal standarder ': 6; ' Antal kontroller ': 0; Markera den ' menar av replikerar ' box;
Markera den ' analysera resultaten samtidigt förvärva prover ' låda. - Klicka på " NextŔ den ' analyter ' fliken öppnas, klicka på den önskade analyter (bead ID) i rutnätet numrerade analyten.
- Klicka och skriv motsvarande Analytens namn i den ' namn ' kolumn till höger om rutnätet analyt (analyter ' namn och deras motsvarande pärla region för nämndes i tabell 1).
- Klicka och Skriv önskad måttenhet (dvs pg/mL) i den ' enheter ' rutan till vänster om den ' gäller alla ' knappen. Klicka på " gäller alla ".
- Klicka och Skriv önskad pärla räknas för varje analyt (dvs. 50) i den ' Count ' rutan. Klicka på " gäller alla ".
- Klicka " NextŔ plattan Layout fliken öppnas. Markera brunnarna för standarder och välj " 2 " under replikera greve och klicka på den " S " Standard-knappen. Upprepa detta steg för bakgrunden " B " och prover " U " brunnar.
- Klicka " Spara ".
- Skapar nya normer/kontroll massor
- öppen den ' protokoll ' sida, och sedan den ' standarder & kontroller ' tab. klick " skapa nya Standard/kontroll massor ".
- Öppna den ' Välj protokoll ' rutan. Välj det protokoll som skapades i steg 1.5.3.
- Nyckel i informationen av standarder med detta: Std/Ctrl kit nummer, Std/Ctrl kit namn, utgångsdatum och tillverkare.
- Nyckel i värdet av den högsta standarden för varje analyt (dvs. 10000 pg/mL). Knappa in 5 under utspädning och klicka på " gäller alla " att automatiskt generera beräknade halterna för resten av normerna.
- Klicka " Spara ".
- Skapa en ny Batch från ett befintligt protokoll
- öppen den ' partier ' sida och klicka " skapa en ny Batch flik från ett befintligt protokoll ".
- Skriv batch-namn i den ' Batch-namn ' rutan och en beskrivning om partiet i den ' ange valfri beskrivning ' låda.
- Klicka på det protokoll som genererats tidigare (i steg 1.5.3).
- Klicka på " NextŔ nästa flik som öppnas är den ' Stds & Ctrls ' tab. Visa information om assay standarder och välj " nästa ".
- På den ' plattan Layout ' fliken, tilldela väl kommandon för den här batchen och klicka " Spara " att spara batchinformation till den ' väntande Batch ' lista.
- Ladda plattan i pärla baserat multiplex assay plattan läsaren, skaka den för 5 min och köra batchen från väntande batchlistan. Data förvärvade sparas i formatet .csv.
- Dataanalys
- konvertera den .csv-fil som genereras från pärla baserat multiplex assay programvaran i .rbx (resultat data fil) format i den rbx konvertering programvaran. Starta konvertering programvara, välj CSV-filen under Välj xPONENT fil(er) och klicka på den " generera " knappen; den .rbx filen sparas i den valda utgående mappen.
- Starta analysprogrammet och öppna filen .rbx.
- Optimera standard kurvorna med 4PL/5PL kurvan passar.
- Välj följande i den ' standardkurvan ' fliken: ' Regression typ ': ' Logistic-5PLƆ ' Axis Transformation ': ' Log(x) - linjär (y) Ɔ kryssa den ' Visa Conc utbud rader ' rutan, markera den ' Visa okänd Prover ' rutan; Markera den ' Visa kontrollprover ' rutan; Markera den ' tillämpa över alla analyter ' rutan; Markera den ' Visa rapport efter optimering ' låda.
- Klicka på den " optimera " knappen för auto-optimering.
- Märk provet identiteter under ' Ange prov Info ' tab.
- Få de observerade koncentrationerna i den ' rapporttabellen ' fliken och klicka på " Exportera rapport tabell " att generera data i en kalkylbladsfil för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tår prover samlades från 8 ögon 4 friska försökspersoner med tår flöde remsor och cytokin nivåer analyserades med hjälp av ovan nämnda protokollet. Alla ämnen var män och år de fyra ämnena var 36, 42, 44 och 52 år respektive. Okulära ytan hälsa och torra ögon sjukdom utvärderades genom kliniska tester (tear film bryta upp tid, Schirmer's test, korneal missfärgning, konjunktival färgning, lock/meibomian körtel undersökning, korneal tår tecken och visuella tecken och symtom) enligt den International Dry Eye Workshop, 2007 riktlinjer och ingen av försökspersonerna visade några tecken eller symtom på kroniskt torra ögon. 31
Av de 41 cytokiner analyseras, upptäcktes 31 cytokiner i alla tår prover, IL-17A, MIP-1β och TNF-α upptäcktes i 7 ögon av 4 patienter, IL-4 påvisades i 6 ögon av 4 patienter, IFN-γ upptäcktes i 6 ögon 3 ämnen, IL-1A upptäcktes i 5 ögon 3 subj ECTS, eotaxin och IL-9 upptäcktes i 3 ögon 2 försökspersoner, IL-3 upptäcktes i 1 öga och MIP-1α i inget av proverna. Medelvärde ± SD koncentrationerna av 41 cytokiner upptäcks hos friska försökspersoner med pärla baserat multiplex assay (figur 2) nämndes i tabell 2. Av 41 cytokiner analyseras, IL-1ra hittades mycket uttrycks i alla prover med det medelvärde ± SD 203,9 ± 52,6 ng/ml och varierade från 129.64 ng/mL till 271.7 ng/mL. Cytokiner IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, IL-8, EGF, PDGF-BB, VEGF och G-CSF var också starkt uttryckt (ng/mL kvantiteter) i revorna av friska försökspersoner och de återstående cytokiner uttrycktes i pg/mL kvantiteter (tabell 2). Den lägsta uppmätta koncentrationen av tår cytokin var TNF-α med det medelvärde ± SD 27,25 ± 19.97 pg/ml och varierade från 10.75 pg/mL 56.02 pg/ml. I 31 cytokiner som upptäcktes i alla prover, ingen visade en statistiskt signifikant skillnad i koncentration (p> 0,05) mellan höger och vänster ögat av t-test (figur 3).
Figur 1: Schematisk Flödesdiagram för tår cytokin profilering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Riv cytokin profiler för friska människor. Representant spridningsdiagram visar den logg medelvärde ± SD koncentrationer av 41 cytokiner i Riva prover som tagits från friska försökspersoner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Inter ögat tår cytokin profil skillnader hos friska försökspersoner. Representant spridningsdiagram visar ingen statistiskt signifikant skillnad (p> 0,05) mellan öga genomsnittliga koncentrationer av 31 Riv cytokiner hos friska försökspersoner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| S. nej. | Analyter | Bead regionen |
| 1 | EGF | 12 |
| 2 | FGF-2 | 13 |
| 3 | Eotaxin | 14 |
| 4 | TGF-Α | 15 |
| 5 | G-CSF | 18 |
| 6 | FLT - 3L | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | Fractalkine | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | GRO | 26 |
| 12 | IL-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | IL - 12P 40 | 29 |
| 15 | MDC | 30 |
| 16 | IL - 12P 70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17A | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1Α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1Β | 46 |
| 27 | IL-2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | IL-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | IL-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1Α | 72 |
| 37 | MIP-1Β | 73 |
| 38 | RANTES | 74 |
| 39 | TNFΑ | 75 |
| 40 | TNFΒ | 76 |
| 41 | VEGF | 78 |
Tabell 1: Analyter namn och motsvarande pärla regionen Detaljer.
| S. nej. | Cytokin | Antalet ögon | Antalet försökspersoner | Genomsnittliga koncentrationer | SD |
| 1 | EGF | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | Eotaxin | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | FGF-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | FLT - 3L | 8 | 4 | 475,4 | 133,6 |
| 5 | Fractalkine | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | G-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28,1 |
| 8 | GRO | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641,4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76,6 | 42,81 |
| 11 | IL-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41,52 |
| 12 | IL-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | IL-12 |
Tabell 2: Riva cytokin profiler hos friska försökspersoner. Menar ± SD koncentrationer av 41 cytokiner upptäcks hos friska försökspersoner med pärla baserat multiplex assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytokiner är små cellproteiner utsöndras och potent immun modulatorer reglerar immunsvar. 32 de uttrycket profilerna av olika cytokiner i tår prover är relaterade till olika sjukdomstillstånd i ögat och studier på cytokin profiler hjälpa att förstå mekanismerna bakom sjukdomspatogenes, avgöra okulär hälsotillstånd, sjukdomens svårighetsgrad, diagnos och progression. 2 , 5 lägre protein koncentrationer och små provmängder är de huvudsakliga utmaningarna av traditionella metoder, begränsa användningen av analyser som ELISA för analys av tår cytokin profiler. 33 pärla baserat multiplex analyser finns immunanalyser, som har tydliga fördelar jämfört med ELISA. Bead baserat multiplex analyser kräver mindre provvolymer för analys av flera analyter och är mycket känslig, kan upptäcka pikogram koncentrationer av proteiner i biologiska vätskor. 34
Här rapporterar vi ett standardiserat protokoll för kvantitativ analys av 41 tår cytokiner hos friska människor använder pärla baserat multiplex assay. Av de 41 cytokiner i panelen, pärla baserat multiplex assay upptäcks 40 cytokiner i tår prover och kunde inte upptäcka MIP-1α. Detta negativa resultat bero på att det fanns omätbara nivåer av MIP-1α i friska tår prover eller på grund av en mindre volym av tårar. Tår prover som tagits med Schirmer remsor har en fördel över andra insamlingsmetoder som microcapillary tube och svampar. Exempelvis i flera kliniska tillstånd, tår volym kan mätas av Schirmer remsor och revan vätska kan elueras från samma remsan efter mätning och användas för cytokin analys. 35 även om microcapillary rör används rutinmässigt samla tårar och producera mer konsekvent tår profiler, förfarandet tar längre tid än strip-metoden, är mer tråkiga och kan vara obekväma för barn och andra patienter. Dessutom kan denna metod också framkalla reflex tårproduktion genom att trycka på bindhinnan och ge olika resultat av cytokin profiler jämfört med basala tårar, vilket påverkar reproducerbarheten för analysen. 36 vid vissa kliniska tillstånd som kroniskt torra ögon, tår provtagning av Schirmer remsor är tillförlitliga för proteinanalys och hjälper i identifiering av biomarkörer. 37 , 38
Bead baserat multiplex analyserna är en kombination av flödescytometri och multiplex ELISA där analyter i provet inklämt mellan specifika antikroppen belagda och färg kodade magnetiska pärlor eller mikrosfärer och biotinylerade detektionsantikropp. Dessa komplex kan upptäckas genom att lägga till de reporter molekyl streptividin-fykoerytrin (PE) konjugat och efterföljande exponering för en dubbel lasersystem i en modifierad flöde flödescytometri-baserade instrument. 39 i ett lasersystem med dubbla en laser retar de interna färgämnena och dess signal representerar den belagda specifika antikroppen. Den andra lasern piggar rapportering molekyl PE konjugatet bunden till den komplexa detektionsantikropp och intensiteten av signalerna representerar koncentrationen av analyten.
Förmåga att mikrosfärerna att kodas med färgämnen av varierande intensitet aktivera analysen att upptäcka upp till 100 olika analyter i en liten volym av provet i en enda brunn. 39 men pärla bygger multiplex analyserna är snabba, reproducerbar och jämförbar standard ELISA-analyser, den här metoden kräver dedikerad instrument, målet34,40 utvärdering av kit och standardisering av protokoll för olika biologiska prover. 39 från auto-antikroppar i kliniska prover kan påverka pärla baserat multiplex resultaten. 34 , 39 för rutinmässig användning av dessa analyser i kliniska inställningar, är det rekommenderat att använda den assay kit från en specifik tillverkare. Den känslighet, upptäckt av absoluta koncentrationerna av cytokiner och reproducerbarhet rapporterades att variera med olika kit. 41 antikropp microarrays eller membran microarrays är mycket känsliga, billig alternativa hög genomströmning tekniker som upptäcka flera analyter i en liten volym av prover och kan tillämpas framgångsrikt på Riva prover för analys av cytokiner och andra proteiner. 35 , 42 men talrika begränsningar finns, eftersom dessa analyser är tidskrävande, semi kvantitativa, uppvisar en hög signal-brus-förhållande och saknar standardiserade protokoll. 19 , 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja. Inga ekonomiska intressen eller intressekonflikt.
Acknowledgments
Forskningsarbetet stöddes av centrala anslaget från Tan Tock Seng Hospital personlig utsäde finansiering Program 2015. Singapore Eye Research Institute Pilot Grant och Tan Tock Seng Hospital Pitch för fonden bevilja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
