Summary
Sitokinler çeşitli oküler hastalıklar eğitim yardımcı olur gözyaşı film analizi. Boncuk dayalı multiplex deneyleri basit ve hassas ve küçük hacimli örneklerde birden çok hedef test etkinleştirin. Burada biz bir protokolü kullanarak bir profil oluşturma gözyaşı film sitokin için tarif boncuk dayalı multiplex tahlil.
Abstract
Gözyaşı film böylece yağlama, beslenme ve koruma altındaki hücreler için sağlayarak göz, Dış yüzeyini kaplayan bir karmaşık yağlar, proteinler ve mineraller karışımıdır. Gözyaşları analizini biyolojik tahmin, tanı ve Prognozunda çeşitli oküler hastalıklar için tanımlanması için gelişmekte olan bir alandır. Gözyaşı kolayca ulaşılabilir ve onların non-invaziv oluşur. Bu nedenle, gelişen teknolojileri protein veya metaboliti kompozisyon ve patolojik koşulları ile dernek değişiklikleri incelemek için gözyaşları içinde birden çok analitler tanımlanması için önem kazanmaktadır. Gözyaşı sitokinler oküler yüzey sağlık eğitim için ideal biyolojik ve kuru göz hastalığı ve vernal konjonktivit gibi farklı oküler yüzey bozuklukları mekanizmaları anlama konusunda da yardımcı olur. Boncuk dayalı multiplex deneyleri birden çok analitler örnek küçük bir miktar ile daha yüksek bir hassasiyet algılama yeteneğine sahip. Burada tarif biz standart bir protokol gözyaşı örnek toplama, çıkarma ve sitokin bir boncuk kullanarak profil oluşturma analizi multiplex tahlil göre.
Introduction
Gözyaşı gözyaşı bezi ve Aksesuar bezleri tarafından üretilen ve gözün dış yüzeyi ceket. Gözyaşı film bir dış lipit katmanı ve çözünür proteinler içerir bir iç sulu tabaka oluşur, mucins ve membran mucins bağlı. Gözyaşları mikrobiyal işgali önlemek, besin kaynağı ve oküler yüzey için yağlama sağlar. Hava ve oksijen taşıma için kornea dokusu arasında arayüz olarak gözyaşı hareket. 1 gözyaşı film proteinler, karbonhidratlar, lipitler ve elektrolitler oluşur. Gözyaşı proteinler ile oküler ve sistemik hastalıklar arasındaki ilişkiyi gibi Glokom, Kuru göz hastalığı, vernal konjonktivit, diabet, tiroid ilişkili orbitopathy ve kanser birkaç çalışmalar belirlenmiştir. 2 , 3 , 4 gözyaşı örneği microcapillary tüpler tarafından toplanabilir veya gözyaşı akışı (Schirmer şeritler) şeritler. Ayrıca,'ın Schirmer testi'kornea ve Refraktif Cerrahi Klinikler, bunların sonuçlarını sitokin analiz deneyleri için kullanılabilir standart bir işlemdir. Non-invaziv örnek koleksiyonu, biyo-numune erişilebilirliğini ve çeşitli fizyolojik ve patolojik koşulları ile gözyaşı kompozisyon Derneği yapmak film biyolojik birkaç oküler ve sistemik hastalıklar için potansiyel bir kaynak gözyaşı. 4 , 5 , 6
Gözyaşı sitokinler oküler yüzey sağlık ve çeşitli oküler hastalıklar inflamatuvar koşulları önemli bir rol oynar. 7 gözyaşı örneği içinde çeşitli sitokinlerin anormal konsantrasyonları kuru göz hastalığı, vernal keratokonjonktivit (VKC), Atopik keratokonjonktivit (AKC), mevsimsel Alerjik konjonktivit ve Üveit ile ilişkili olduğu bildirildi. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 gözyaşı proteinler kütle spektrometresi, western Blot ve enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) gibi geleneksel yöntemlerle analiz edilebilir. 14 , 15 ancak, bu yöntemlerin zavallı duyarlılık ve her hastada birden fazla gözyaşı sitokinler analizi için gerekli örnek daha büyük bir hacim sınırlamalardır. 16 , 17 dayalı boncuk multiplex deneyleri karmaşık karışımı örneklerinde birden çok analitler analiz etmek için geliştirilmiş ve farklı hastalıklar içinde birden çok sitokinler analiz etmek için gözyaşı örneği başarıyla uygulanan. 6 , 18 A birleştirme-in sandviç ELISA ve Akış Sitometresi teknikleri bu deneyleri ELISA için tek bir örneğinde birden çok analitler miktar daha duyarlı olmaya olanak sağlar. 19 klinik örnekler ve hücre kültür supernatants ve bağışıklık yanıtı birkaç patofizyolojik koşullarında çalışmada yardımcı olur çeşitli bu yöntem uygulanabilir. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Karşılaştırma tabanlı boncuk multiplex ELISA ile deneyleri ve yöntemleri arasında bir korelasyon bildirdin birçok çalışma vardır. Loo karşılaştırıldığında vd. boncuk resistin, leptin ve Grelin insan serum veya plazma numuneleri, geleneksel ELISA adiponektin, tespiti ile çok katmanlı tahlil tabanlı ve güçlü bir korelasyon bildirdi (r > 0,9) deneyleri arasında. 25 Dupont ve ark. temel boncuk multiplex deneyleri ve ELISA arasında güçlü bir korelasyon IL-1β, tespiti için rapor, IL-5, Il-6, Il-4 IL-10, IFN-ϒ ve TNF-α phytohemagglutinin ve lipopolysaccharide uyarılmış tam kan hamile kadınlar toplanan. 26 Pickering ve ark. dayalı boncuk multiplex tahlil ve ELISA arasında başka bir güçlü korelasyon Haemophilus influenza tip b polisakkarit serum antikor tespiti için rapor (r = 0,96), toxoids Clostridium parasitize (r = 0,96) ve Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). 27 Biagini vd. yüksek pozitif korelasyon bildirdi (r = 0.852) dayalı boncuk multiplex tahlil ve ELISA Bacillus anthracis anti-PA IgG serum örneklerinde tespiti için arasında. 28 Wang ve ark. temel boncuk multiplex tahlil ve ELISA arasında bir ilişki Alzheimer hastalığı biyolojik amiloid-β 42 tespiti için rapor (r 0.77 =), toplam tau (r = 0,94) ve amino asit 181 fosforile tau (r = 0,82) içinde beyin omurilik sıvısı örnekleri. 29 boncuk uygulanabilirliği multiplex deneyleri bir umut verici dayalı boncuk multiplex deneyleri yapmak klinik örnekler, küçük örnek hacim gereksinimleri ve standart ELISA ile bir korelasyon çeşitli üzerinde dayalı bu çalışmalar göstermiştir geleneksel ELISA yöntemleri farklı hastalık fenotipleri örneklerinde farklı tür birden çok analitler tespiti için bir alternatif. Burada tarif biz sitokin sağlıklı bir konu Schirmer şeritler kullanarak toplanan gözyaşı örnekleri 41 analitler için profil oluşturma için temel boncuk multiplex tahlil için standart bir protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan protokolleri Tan Tock Seng hastane, Singapur Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi.
1. gözyaşı sitokin analizi
- gözyaşları topluluğu:
- rahat bir muayene sandalyeye oturun ve yanlarında karşı seçtiğin bu kullanıcı kafasını yerleştirmek için konu sormak.
- Konu aramak, dikkatle (Whatman filtre kağıttan 41.liğe yapılmış) Schirmer şeritler açın ve şerit yuvarlak sonu üzerinde göz fornix aşağı yerleştirin ve 5 min için gözlerini kapatmak için konu talimat isteyin. Gözyaşı toplarken oküler yüzey teması en aza indirmek için çok dikkat edin. 30
- Şerit kaldırmak ve bir steril 1.5 mL microcentrifuge Tüpü yerleştirmek için seçtiğin bu kullanıcı gözleri açmak amacıyla konusunu sormak. Hemen tüp laboratuvar veya-80 o C mağaza sitokin profil oluşturma için test kadar transfer.
- Elüsyon gözyaşı akışı şerit üzerinden gözyaşı örneği:
- (gözyaşları test edilecek miktarı standartlaştırmak için) 0.5 cm uzunluğunda için gözyaşı akışı şerit kesilmiş ve bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin.
- Arabellek tahlil ve 5 min 1 dk. 14. 000 x g de tüp centrifuging tarafından takip için oda sıcaklığında kuluçkaya eklemek 30 µL
- Süpernatant başka bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve şerit atın. Buz tüp içeren örnek ve eluted gözyaşı örnek hemen sitokin profil oluşturma için kullanın.
- Reaktifler hazırlanması:
Not: her örnekte temel boncuk multiplex tahlil tarafından test edilecek kırk bir analitler İnterlökin (Il) vardır-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, Il-4, IL-5, Il-6, 7 Il, Il-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-indüklenebilir protein 10 (IP-10, CXCL10), makrofaj kaynaklı Kemokin (MDC), makrofaj inflamatuvar protein (MIP)-1α ve MIP-1β, monosit kemotaktik protein (MCP) -1, MCP-3, tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-α), TNF-β, büyüme düzenlenir onkogen (GRO), tümör büyüme faktörü alfa (TGF-), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF) -2, trombosit-türevi büyüme faktörü (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF), granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, çözünür CD40 ligand (sCD40L), Fms benzeri tirozin kinaz 3 ligand (Flt - 3L) ve harekete geçirmek düzenlenmiş, normal T hücreli ifade ve salgılanan protein (RANTES).- Antikor boncuk çözüm (50 X) tüpleri oda sıcaklığında (20-25 o C) ve girdap 1 dk. şişeleri getir
- Tayini için gerekli kuyu sayısını ve toplam antikor boncuk kokteyl çözüm (iyi başına 25 µL) ve tahlil için gerekli her antikor boncuk çözüm (50 X) miktarını hesaplamak.
- Boncuk Dilüent kalan miktarı ekleyerek istenen son hacim için hesaplanan miktarı her antikor boncuk çözüm ve dolgu ekleyerek kokteyl çözüm hazırlamak. Kokteyl her antikor son konsantrasyonu 1 X olduğundan emin olun. Her zaman en az % 20 hazırlamak ilave birim pipetting hataları durumunda kokteyl çözüm.
Not: örnek olarak, bir 96-iyi tahlil için 3000 µL antikor boncuk kokteyl çözüm hazırlamak. Her antikor boncuk çözüm gerekli miktarı 3000/hisse senedi toplama her antikor boncuk çözümünün; = 3000/50 60 µL her antikor boncuk çözümünün- ekleyin 60 µL her 41 antikor boncuk Çözümleri = (60 X 41 = 2460 µL) bir kokteyl içine şişe ve boncuk Dilüent çözüm 540 µL 3000 µL final yapmak için antikor boncuk karışıma ekleyin çalışma çözüm (1 X).
- Kullanmadan önce mix boncuk kokteyl çözüm düzgün. 30 gün için kalan ses 2-8 o C seviyesinde tahlil depolamak sonra.
- Kalite kontrol (QC) QC 1 ve QC 2 hisse senetleri için 250 µL deiyonize su ekleyerek hazırlayın.
- Şişe birkaç kez ters çevirme ve girdap tarafından 10 s. Transfer için çözüm düzgün etiketli polipropilen microcentrifuge tüpler mix düzgün ve -20 ° c ilâ 30 yaşam için kullanılabilecek kalan çözüm mağaza.
- Hazırla 10 X 30 mL 270 mL deiyonize su ekleyerek yıkama arabellek arabellek çözüm yıkayın ve iyice karıştırın (seyreltme önce 10 X arabellek oda sıcaklığına getirmek ve tüm tuz precipitates karıştırılarak erimesi). 2-8 ° C'de 30 gün için kullanılabilen kullanılmayan yıkama arabellek (1 X) depolamak.
- İnsan sitokin standart stok (10.000 pg/mL bütün analitler) hisse senedi şişeyi 250 µL deiyonize su ekleyerek hazırlayın. Mix de birkaç kez ve girdap 10 şişe ters çevirme tarafından s. 10 dakikadır stand ve polipropilen microcentrifuge tüpler düzgün etiketli stok çözümü aktarmak izin verildi. Tahlil sonra kalan çözüm-20 ° C'de 30 gün için kullanılan, mağaza.
- 5-fold seri dilutions tarafından çalışma insan sitokin standartları hazırlamak (50 µL - > 200 µL) 2000, almak için tahlil arabelleği ile 400, 80, 16 ve 3.2 pg/mL.
- Standart hazırlama sonra 60 dakika içinde çalışma standartları ve tahlil arabellek boş/arka plan kullanır (-pg/mL).
- Multiplex tahlil dayalı sitokin boncuk tarafından profil oluşturma:
- 5-10 saniye 96-şey microtiter plakasına eklemeden önce tüm reaktifler oda sıcaklığında ve girdap getirmek. Eluted gözyaşı örnekleri-80 depolanıyorsa, o C tahlil önce dondurulmuş gözyaşı özleri buz çözme ve santrifüj kapasitesi 1000 X g 5 dakika süreyle,
- Bir tahlil mizan insan sitokin standartları çalışmak için dikey bir yapılandırma hazırlamak [0 (boş), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 ve 10.000 pg/mL], QC1, QC2 ve örnekler.
- Eklemek 200 µL yıkama arabellek her X 1 tabak iyi, plaka mühürleyen ile kapatın ve bir plaka shaker, oda sıcaklığında (20-25 o C) 10 dakika süreyle devam et
- 1 X yıkama tampon plaka ters çevirme tarafından dikkatle boşaltmak ve yıkama arabellek herhangi bir kalıntı miktarı wells kaldırmak için birkaç kez emici havlu dokunun.
- Ekle 25 µL (tahlil arabellek), her çalışma insan sitokin standart, QC1, QC2, boş ve uygun kuyu içine örnekleri.
- Ekle 25 µL tahlil arabelleği her kuyuya. Her kuyuya
- 1 X 25 eklemek µL antikor boncuk kokteyl çözüm. Antikor boncuk çözüm ışığa duyarlı olduğundan, plaka mühürleyen ile plaka mühür ve tahlil sırasında ışıktan korumak için alüminyum folyo ile yeter.
- Plaka 4 o C gecede bir shaker, kuluçkaya.
- Plaka bir otomatik manyetik kalıp yıkayıcı tabak rafına koyun. Kuyunun dibinde manyetik boncuklar ve iyi içeriği Aspire 1 dk. oturup izin. Yıkama arabelleği iyi başına 200 µL ekleyin ve 1 dakika oturmak ve iyi içeriği Aspire edin. Yıkama bir kez daha tekrarlamak (tabak yıkama için kit üreticisine izleyin ' s talimatları).
- Ekle 25 µL algılama antikorlar çözüm her şey, plaka mühür alüminyum folyo ile kapatın ve bir shaker üzerinde 60 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Streptavidi 25 µL Eklen-Phycoerythrin çözüm her kuyuya plaka mühür, alüminyum folyo ile kapatın ve bir shaker üzerinde 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Plaka mıknatıslı plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirin. 1 dakika oturmak ve iyi içeriği Aspire edin edelim. Yıkama arabelleği iyi başına 200 µL ekleyin. 1 dakika oturmak ve iyi içeriği Aspire edin edelim. Yıkama bir kez daha tekrarlamak.
- Her şey ve antikor boncuk resuspend için oda sıcaklığında 5 min için bir shaker Plakayı yerleştirmek için kılıf sıvı eklemek 150 µL.
- Kalenin hemen boncuk kullanarak çok katmanlı tahlil plaka okuyucu dayalı okumak ve 5-parametre eğri sığdırma algoritmasıyla sitokin konsantrasyonları analiz. Gözyaşı sitokin profil oluşturma şematik bir akış diyagramı şekil 1 ' de gösterilen.
- Tahlil plaka (enstrüman kurmak) ve veri analizi okuma:
- multiplex tahlil okuyucu ve öncesi sıcak lazer 30 dakika süreyle boncuk anahtarı göre
- Göre boncuk multiplex tahlil yazılımını başlatın. Altında ' otomatik bakım ' sekme, seçme ' kalibrasyon-doğrulama ' seçeneği. Her reaktif şişe kalibrasyon ve doğrulama boncuk 30 yer 5 s. için girdap her reaktif belirlenen kuyu düşer. Belirlenen su depoları ile deiyonize su ve % 70 etanol doldurmak.
- Oluştur yeni bir protokol
- Açık ' iletişim kuralları ' sayfa ve sonra ' iletişim kuralları ' sekmesini " yeni ProtocolŔ oluşturmak ' ayarları ' sekme açılacaktır.
- İçinde ' adı ' iletişim kuralı adını yazın.
- Bir açıklama kutusunun sağına yazın ' adı ' kutusu.
- İçinde ' sürüm ' iletişim kuralı sürüm yazın.
- İçinde ' üretici ' iletişim kuralı için üretici bilgi yazın.
- Tanımla ayarlarında ' satın alma ayarları ' aşağıdaki gibi bölüm. Ayarla ' birim ': 100 µL, ' zaman aşımı ': 60 s; ' DD çoğunluğuna ': 8.000 15.000; ' Muhabir kazanç ': Standart Devresel_ödeme; ' Boncuk türü ': manyetik boncuk.
- Tanımla ayarlarında ' çözümlemesi ayarlarını ' bölüm, seçme ' kantitatif ' analiz türü olarak. Ayarla ' standartları dizi ': 6; ' Denetim sayısı ': 0; Kene ' çoğaltır demek ' kutu;
Kene ' örnekleri alınıyor ise sonuçlarını analiz ' kutusu. - 'I tıklatın " NextŔ ' analitler ' sekmesinde açılır, numaralandırılmış analit kılavuzunda (Boncuk kimliği) istenen analitler üzerinde tıklatın.
- Tıklat ve yaz karşılık gelen analit adı ' adı ' analit Kılavuz sütunu (analitler ' isimleri ve onların karşılık gelen boncuk bölge bilgilerini Tablo 1 ' de belirtilen).
- Tıklayın ve istenen ölçü (Yani pg/mL) yazın ' birim ' kutusunun solundaki ' uygulamak tüm ' düğmesi. Ardından " uygulamak tüm ".
- İstenen boncuk saymak (Yani 50) içinde her analit için Tıklat ve yaz ' sayısı ' kutusu. ' I tıklatın " tüm geçerli ".
- Tıklama " NextŔ plaka Düzen sekmesini açar. Wells standartlar ve Seç için vurgulamak " 2 " küçük çoğaltmak sayısı ve tıkırtı üstünde " S " standart düğme. Arka plan için bu adımı yineleyin " B " ve örnekleri " U " wells.
- 'I tıklatın " kurtarmak ".
- Oluşturmak yeni standartlar/denetim çok
- Açık ' iletişim kuralları ' sayfa ve sonra ' standartları & denetimleri ' sekmesini " yeni standart/denetim çok oluşturmak ".
- Aç ' Protokolü Seç ' kutusu. 1.5.3 adımda oluşturulan iletişim kuralını seçin.
- Buna göre standartların bilgilerinde anahtar: Std/Ctrl kiti numarası, Std/Ctrl kit adı, süre sonu ve üretici.
- Anahtar (Yani 10000 pg/mL) her analit için en yüksek standart değeri. Tıklayın ve seyreltme altında 5 tuşuna " uygulamak tüm " beklenen konsantrasyonları standartları geri kalanı için otomatik olarak oluşturmak için.
- 'I tıklatın " kurtarmak ".
- Oluştur yeni bir toplu işlemi varolan bir iletişim kuralı üzerinden
- Açık ' toplu işlemleri ' sayfa ve tıkırtı " mevcut bir protokol yeni toplu iş sekmesini oluşturmak ".
- Toplu işlem adına yazın ' toplu işlem adı ' kutu ve toplu iş iş işlemde hakkında bir açıklama yazın ' isteğe bağlı bir açıklama girin ' kutusu.
- Daha önce (Adım 1.5.3) oluşturulmuş protokol tıklayın.
- 'I tıklatın " açar sonraki sekme NextŔ ' cinsel yolla bulaşan & Ctrls ' sekmesini seçin ve tahlil standartları detayları göster " sonraki ".
- Üzerinde ' plaka düzen ' tab, bu toplu işlem iyi komutlar atayın ve'ı tıklatın " kurtarmak " toplu bilgileri kaydetmek için ' bekleyen toplu ' listesi.
- Plaka dayalı boncuk multiplex tahlil plaka okuyucu yüklemek için 5 dk salla ve bekleyen toplu iş listesinden toplu işlem çalıştırıldıktan. Alınan veri .csv dosyası biçiminde kaydedilecek.
- Veri analizi
- rbx dönüştürme yazılımı kullanarak .rbx dosyasını (sonuçları veri dosyası) biçimine göre boncuk multiplex tahlil yazılımı oluşturulan .csv dosyasını dönüştürmek. Dönüştürme yazılımı başlatmak, select xPONENT dosyalar altında .csv dosyasını seçin ve tıklayın " oluşturmak " düğme; .rbx dosyası seçili çıktı klasöründe kaydedilir.
- Analiz yazılımı başlatmak ve .rbx dosyasını açın.
- Uygun 4PL/5PL eğrisi kullanarak standart eğrileri en iyi duruma getirme.
- Seçin aşağıda, ' standart eğri ' sekmesi: ' regresyon türü ': ' lojistik-5PLƆ ' eksen dönüştürme ': ' Log(x) - doğrusal (y) Ɔ kene ' konsantrasyon aralığı satırlarını göster ' kutu; kene ' göster: bilinmeyen Örnekleri ' kutu; Kene ' kontrol örnekleri göstermek ' kutu; Kene ' Uygula bütün analitler arasında ' kutu; kene ' sonra optimizasyon raporu göster ' kutusu.
- 'I tıklatın " en iyi duruma getir " düğmesi otomatik optimizasyon için.
- Örnek kimlikler altında etiket ' örnek bilgi girin ' sekmesini
- Gözlenen konsantrasyonlarda elde ' rapor tablo ' etiket ve tıkırtı üstünde " rapor tablo verme " daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tablo dosyasındaki verileri oluşturmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4 sağlıklı deneklerin gözyaşı akışı şeritler kullanarak 8 gözlerinden gözyaşı örneği toplanmıştır ve sitokin düzeyleri yukarıda belirtilen iletişim kuralı kullanılarak analiz edildi. Tüm konular erkek ve dört konu yaş 36, 42, 44 ve 52 idi sırasıyla. Oküler yüzey sağlık ve kuru göz hastalığı göre klinik testler (gözyaşı film kıracak zaman, Schirmer'ın testi, kornea boyama, Konjonktival boyama, kapak/meibomian bezinin muayene, kornea gözyaşı işaretler ve görsel işaretler ve belirtiler) tarafından değerlendirilmesi yapıldı. Uluslararası kuru göz atölye, 2007 Rehberler ve konularda hiçbiri herhangi bir belirti ve kuru göz hastalığı belirtileri gösterdi. 31
Analiz 41 sitokinler dışında 31 sitokinler algılandı tüm gözyaşı örnekleri, IL-17A, MIP-1β ve TNF-α 4 konular, 7 gözünde Il-4 IL-1A 5 3 konu gözünde algılandı 3 konular, 6 gözünde algılanan IFN γ 4 konular, 6 gözünde algılandığı algılandı ECTS, eotaxin ve IL-9 IL-3 1 göz ve MIP-1α örneklerin hiçbiri algılandı 2 konular, 3 gözünde algılandı. 41 sitokinler dayalı boncuk multiplex tahlil (Şekil 2) kullanarak sağlıklı bireylerde algılanan acımasız ± SD konsantrasyonları Tablo 2' de bahsedildi. Analiz 41 sitokinler dışında IL-1ra son derece tüm örneklerinde 203.9 ± 52,6 ng/mL ortalama ± SD ile ifade edilecek bulundu ve 129.64 ng/mL 271.7 ng/mL arasında değişiyordu. Sitokinler IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, Il-8, EGF, PDGF-BB, VEGF ve G-CSF vardı aynı zamanda son derece sağlıklı gözyaşları içinde (ng/mL miktarları) ifade ve kalan sitokinler pg/mL miktarlarda (Tablo 2) ifade edildi. Gözyaşı sitokin ölçülen en düşük konsantrasyon ve TNF-α oldu 27.25 ± 19.97 pg/mL ortalama ± SD ile 10.75 pg/mL 56.02 pg/mL arasında değişiyordu. Tüm örneklerinde tespit edildi 31 sitokinler, hiçbiri konsantrasyon istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermiştir (p> 0,05) t-Testi (şekil 3) tarafından sağ ve sol göz arasında.
Şekil 1: gözyaşı sitokin profil oluşturma şematik akış diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: gözyaşı sitokin profilleri sağlıklı insanlarda. Temsilcisi günlük ortalama ± SD konsantrasyonları 41 sitokinler gösterilen scatterplot sağlıklı bir konu toplanan örnekleri gözyaşı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: arası göz gözyaşı sitokin profil farklılıklar sağlıklı bireylerde. Temsilcisi istatistiksel olarak anlamlı bir fark gösterilen scatterplot (p> 0,05) arası göz ortalama 31 konsantrasyonlarda sitokinler sağlıklı bireylerde gözyaşı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| S. No | Analitlerin | Boncuk bölge |
| 1 | EGF | 12 |
| 2 | FGF-2 | 13 |
| 3 | Eotaxin | 14 |
| 4 | TGF-α | 15 |
| 5 | G-CSF | 18 |
| 6 | Flt - 3L | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | Fractalkine | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | GRO | 26 |
| 12 | IL-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | IL - 12P 40 | 29 |
| 15 | MDC | 30 |
| 16 | IL - 12P 70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17A | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1β | 46 |
| 27 | IL-2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | IL-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | IL-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1α | 72 |
| 37 | MIP-1β | 73 |
| 38 | RANTES | 74 |
| 39 | TNFα | 75 |
| 40 | TNFβ | 76 |
| 41 | VEGF | 78 |
Tablo 1: Analitler adları ve karşılık gelen boncuk bölge ayrıntıları.
| S. No | Sitokin | Gözleri sayısı | Konu sayısı | Konsantrasyonları demek | SD |
| 1 | EGF | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | Eotaxin | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | FGF-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | Flt - 3L | 8 | 4 | 475.4 | 133.6 |
| 5 | Fractalkine | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | G-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28,1 |
| 8 | GRO | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641.4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76.6 | 42.81 |
| 11 | IL-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41.52 |
| 12 | IL-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | IL-12 |
Tablo 2: Gözyaşı sitokin profilleri sağlıklı bireylerde. ± SD konsantrasyonları 41 sitokinler dayalı boncuk multiplex tahlil kullanarak sağlıklı bireylerde tespit demek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sitokinler küçük hücresel salgılanan proteinler ve bağışıklık yanıtı düzenleyen güçlü bağışıklık modülatörler vardır. 32 ifade profilleri çeşitli sitokinlerin gözyaşı örnekleri çeşitli patolojik şartları göz ve sitokin hastalık patogenezinde mekanizmaları anlamak, oküler sağlık durumunu belirlemek için yardımcı profilleri üzerinde çalışmalar ile ilgili olarak, hastalık şiddeti, tanı ve ilerleme. 2 , 5 daha düşük protein konsantrasyonları ve küçük örnek birimleri geleneksel yöntemler, gözyaşı sitokin profilleri analizi için deneyleri gibi ELISA kullanımını sınırlama ana sorunları vardır. 33 farklı ELISA üstünlükleri vardır uzun dayalı boncuk multiplex deneyleri var. Dayalı boncuk multiplex deneyleri daha küçük örnek birimler birden çok analitler analizi için gerektiren ve son derece hassas, protein konsantrasyonları picogram biyolojik sıvısının içinde algılama yeteneğine. 34
Burada bir standart iletişim kuralı 41 gözyaşı sitokinler dayalı boncuk multiplex tahlil kullanarak sağlıklı kişilerde nicel analiz raporu. 41 sitokinler panelinde dayalı boncuk multiplex tahlil 40 sitokinler gözyaşı örneği algılandı ve MIP-1α algılayamadı. MIP-1α sağlıklı gözyaşı örneği veya gözyaşı küçük bir hacim nedeniyle tespit edilemez düzeyde olduğundan bu negatif sonuç olabilir. Schirmer şeritler kullanarak toplanan gözyaşı örnekleri microcapillary tüp ve sünger gibi diğer toplama yöntemleri üzerinde bir avantaj var. Örneğin, birkaç klinik koşullarda göz yaşartıcı sıvı cilt ölçülebilir Schirmer şeritler ve gözyaşı sıvısı aynı şerit ölçü sonra eluted olabilir ve sitokin çözümlemesi için kullanılan. 35 microcapillary tüpler rutin gözyaşlarını alın ve daha tutarlı gözyaşı profilleri üretmek için kullanılır rağmen yordamı şerit yöntemi daha fazla zaman alır, daha sıkıcı ve çocuk ve diğer hastalar için rahatsız olabilir. Ayrıca, bu yöntem da konjonktiva dokunarak refleks gözyaşı üretimi teşvik ve sitokin profilleri böylece etkileyen tekrarlanabilirlik testin bazal gözyaşlarına göre değişken sonuçlar üretmek. 36 bazı klinik durumlarda kuru göz hastalığı gibi gözyaşı örnek toplama Schirmer şeritler tarafından protein analizi için güvenilir ve biyolojik tanımlanmasına yardımcı olur. 37 , 38
Boncuk dayalı multiplex deneyleri Akış Sitometresi bir bileşimidir ve manyetik boncuklar veya mikroküreler ve biotinylated algılama antikor multiplex ELISA içinde analitler örnek spesifik antikor kaplı ve renk arasında gözükeceksin kodlu. Bu komplekslerin muhabir molekül Streptavidin-Phycoerythrin (PE) eşlenik ve sonraki çift lazer sistemi maruz bir değiştirilmiş Akış Sitometresi tabanlı araç ekleyerek tespit edilebilir. 39 çift lazer sisteminde, bir lazer iç boya heyecanlandıran ve onun sinyal kaplamalı spesifik antikor temsil eder. İkinci lazer karmaşık algılama antikor bağlı raporlama molekül PE eşlenik heyecanlandıran ve sinyallerin yoğunluğu analit konsantrasyonu temsil eder.
Mikroküreler değişen şiddetlerde boyalar ile kodlanmış yeteneği kadar 100 farklı analitler örnek tek bir kuyu içinde küçük bir hacim içinde algılamak tahlil etkinleştirin. Hızlı, tekrarlanabilir ve kanıtlanmış standart ELISA deneyleri, özel aletleri, bildiriyi34,40 değerlendirme kitleri ve iletişim kuralları için standardizasyonu için boncuk tabanlı multiplex deneyleri 39 çeşitli biyolojik örnekler. 39 Oto-antikorların klinik örneklerinde varlığı dayalı boncuk multiplex sonuçları etkileyebilir. 34 , 39 bu deneyleri klinik ayarları'nda rutin kullanımı için bu belirli bir üreticinin tahlil kitleri kullanmak için önerilir. Hassasiyet, sitokinler ve tekrarlanabilirlik, mutlak konsantrasyonlarının tespiti farklı kitleri ile değiştirmek için rapor edilmiştir. 41 antikor microarrays veya membran microarrays son derece duyarlıdır, hangi birden fazla analitler örnekleri küçük bir hacim içinde bulmak ve üzerinde başarıyla uygulanabilir ucuz alternatif yüksek işlem hacmi teknikleri örnekleri analizi için gözyaşı sitokinler ve diğer proteinler. 35 , 42 ancak, çok sayıda sınırlamalar var, bu deneyleri gibi zaman alıcı, yarı nicel, sinyal / gürültü oranı yüksek sergi ve standart protokolleri eksikliği. 19 , 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok. Finansal faiz ya da çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Araştırma çalışmaları Merkezi hibe Tan Tock Seng hastane kişiselleştirilmiş tohum finansman programı 2015 tarafından desteklenen; Singapur göz Araştırma Enstitüsü Pilot hibe fonu için Tan Tock Seng hastane adım grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
