Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativa lokalisering av ett Golgi Protein av Imaging Center av fluorescens massan

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/55996
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1
1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 2Bioinformatics Institute, 3School of Computing, National University of Singapore

Summary

Exakt lokalisering av Golgi invånare är viktigt för att förstå de cellulära funktionerna i Golgi. Konventionella optisk mikroskopi är dock inte kan lösa strukturen sub-Golgi. Här beskriver vi protokollet för en konventionell mikroskopi baserat super-resolution metod att kvantitativt bestämma sub-Golgi lokaliseringen av ett protein.

Abstract

Golgi komplexet består av seriellt staplade membran cisternae som ytterligare kan kategoriseras in i sub-Golgi regioner, inklusive cis-Golgi, mediala-Golgi, trans-Golgi och trans-Golgi nätverk. Cellulära funktioner av Golgi bestäms av karakteristiska fördelningen av dess hemvist proteiner. Den rumsliga upplösningen i konventionella ljusmikroskopi är för låg för att lösa sub-Golgi struktur eller cisternae. Den immuno-guld elektronmikroskopi är alltså en metod som väljer att lokalisera ett protein på sub-Golgi nivå. Teknik och instrument är dock utöver kapaciteten hos de flesta cellbiologi labs. Här beskriver vi vår nyutvecklade super-upplösning metod kallas Golgi protein lokalisering av imaging centra av massan (GLIM) för att systematiskt och kvantitativt lokalisera ett Golgi-protein. GLIM är baserad på standard fluorescens märkning protokoll och konventionella wide-fältet eller confocal Mikroskop. Det handlar om kalibrering av kromatisk-shift aberration av mikroskopiska systemet, bild förvärv och efter förvärvet analys. Sub-Golgi lokaliseringen av ett protein som test är kvantitativt uttryckt som lokalisering kvoten. Det finns fyra huvudsakliga fördelar med GLIM; Det är snabba, baserat på konventionella metoder och verktyg, lokalisering resultatet är kvantitativa och det ger ~ 30 nm praktisk upplösning längs Golgi-axeln. Här beskriver vi de detaljerade protokollet av GLIM att lokalisera ett test Golgi protein.

Introduction

Golgi komplexet spelar viktiga roller i sekretoriska/endocytic handel av proteiner och lipider (härefter cargos) i däggdjursceller1,2,3. På Golgi, är laster inte bara sorteras till olika sub cellulära fack men också av olika typer av glycosylation. Däggdjur Golgi komplexet består av ett flertal sido anslutna Golgi stackar, som vanligtvis består av 4-11 tätt intill och platt membran säckar kallas cisternae. De seriellt staplade Golgi-cisternae ytterligare kategoriseras, från ena änden till den andra, som cis, mediala och trans-cisternae. På den transen-sida av en Golgi stack, trans-de flesta membran sac utvecklas till ett nätverk för tubulär och nätmagen membran som kallas den transen-Golgi nätverk (TGN)4. Utsöndringsvägarna, laster som härrör från det endoplasmatiska retiklet (ER) ange en Golgi stack på dess cis-sida och sedan sekventiellt passera genom mediala och trans-cisternae. Cargos så småningom avsluta Golgi på trans-Golgi eller TGN destining till plasmamembranet, endosomes eller sekretoriska granuler.

De molekylära och cellulära mekanismerna för hur cargos transitering en Golgi stack och hur Golgi underhåller dess cisternal organisation förblir mystiska och är för närvarande fortfarande under en hetsig debatt1. En av svårigheterna på detta område är att Golgi cisternae endast kan lösas under elektronmikroskopi (EM) sedan upplösningen av ett optiskt mikroskop (~ 200 nm) är otillräckliga för att lösa enskilda Golgi cisternae (< 100 nm i båda cisternal tjocklek (och avstånd). Därför bestäms konventionellt sub-Golgi localizationen av bosatta proteiner och transit laster av immuno-guld EM. Men den immuno-guld EM är mycket tekniskt krävande och det är bortom kapaciteten hos de flesta cellbiologi labs. Även om upplösningen på EM kan vara sub nanometer, resolutionen ges av immuno-guld EM hämmas kraftigt av storleken av antikropp komplexa (primär samt sekundär antikroppen) och guld partikeln och det kan vara värre än 20 nm. Dessutom erhålls EM bilder från 2D tunn-avsnitten i stället för en 3D övergripande bild av den Golgi, vilket kan resultera i felaktiga slutsatser beroende på den relativa position och orientering av 2D avsnitt5. Studera ett EM singel-avsnitt är exempelvis inte kan på ett tillförlitligt sätt skilja en vesikler från ortogonala beskåda av en tubuli eftersom båda kan visa identiska runda membran profiler. Senaste tillkomsten av super-resolution mikroskopi tekniker, såsom 3D-strukturerade belysningen mikroskopi (3D-SIM), stimulerat utsläpp utarmning (STED), photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) och stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi ( STORM), gör det möjligt att lösa sub-Golgi strukturer under ljus Mikroskop6. Men finns det minst fyra nackdelar som avsevärt kan begränsa deras användning i cell biologiska studier av Golgi. (1) nuvarande super-upplösning tekniker kräver dyra och särskilda maskinvarukonfiguration som är bortom de flesta cellbiologi labs. (2) särskilda fluorescens märkning protokoll behövs för några super-upplösning-tekniker. (3) även om, enligt bästa skick, hävdar dessa tekniker 20-110 nm i rumslig upplösning, kan den praktiska resolution erhållits i riktiga prover vara mycket värre. (4) i jämförelse med konventionella mikroskopi, dessa super-upplösning tekniker fortfarande har svårigheter att bedriva multicolor, 3D eller live cell imaging, antingen ensamma eller i kombination. Förmodligen viktigast av allt, både immuno-guld EM och super-resolution mikroskopi teknikerna ger kvalitativa i stället för kvantitativa localization data.

Försök att delvis lösa problem som nämns ovan, har vi nyligen utvecklat en konventionell ljusmikroskopi baserat metod, som heter Golgi protein lokalisering av imaging centra av massan (GLIM), att systematiskt och kvantitativt lokalisera en Golgi protein med en upplösning som är likvärdig med den immuno-guld EM7. Den här metoden är Golgi hos odlade däggdjursceller utspridda som Golgi mini-stackar genom behandling av nocodazole, en mikrotubulära depolymerizing drog. Omfattande studier har visat att nocodazole-inducerad Golgi mini-stackar (härefter Golgi mini-stackar) liknar infödda Golgi stackar i både organisation och cellulära funktioner8,9,10, 11. Lokalisering kvoten (LQ) av en test-protein kan förvärvas genom GLIM och det betecknar den kvantitativa sub-Golgi lokaliseringen. De numeriska värdena av LQs kan jämföras och en LQ databas med mer än 25 Golgi markörer har varit tillgänglig.

I GLIM är Golgi mini-stackar triple-märkt av endogent eller exogent uttryckt GM130, GalT-mCherry och proteinet test (x). GM130 och GalT-mCherry, cis- och trans-Golgi markörer respektive12,13, tillhandahålla referenspunkter. Den trippel fluorescensen, röd (R), grönt (G) och mån B, artificiellt visas som rött, grönt och blått, respektive. Masscentrum fluorescens (härefter center) antas för att uppnå sub PIXELupplösning. Golgi axeln definieras som vektorn från centrum av GM130 med GalT-mCherry. Golgi mini stacken modelleras som en cylindrisk struktur med oändlig rotational symmetri runt Golgi-axeln. Därför kan en Golgi mini stack modelleras vidare som en endimensionell struktur längs Golgi-axeln. LQ av proteinet test x definieras som dxd1, där dx är avståndet från mitten av x som GM130, medan d1 är avståndet från centrum av GalT-mCherry med GM130. Om x ligger off-axeln, används dess axiella Projiceringsavstånd för beräkningen. Variabler, inklusive Golgi axis, axiell vinkel, dx, d1, vinkeln α och vinkeln β, för GLIM illustreras schematiskt i figur 1. LQ är oberoende av Golgi axiell vinkel men Golgi mini-stackar orientera slumpmässigt i en cell.

Golgi mini-stackar visas inhomogena i bilder. Vi utvecklat tre kriterier för att välja analyserbart Golgi mini-stackar att GLIM. (1) signal-brusförhållande kriteriet, där förhållandet mellan den totala intensiteten av en Golgi mini stack att standardavvikelsen (SD) för bakgrunden är ≥ 30 i varje kanal. Detta kriterium är att säkerställa positionering riktigheten av centrum av massan, som beror på de signal-brus-förhållanden av Golgi mini-stackar. (2) axiell vinkel eller avstånd kriteriet, som kräver d1≥ 70 nm. d1 minskar med ökningen av Golgi axiell vinkel. När axiell vinkel närmar sig 90° eller vertikal, mini stacken blir icke-matchas som d1 närmar sig 0. d1≥ 70 nm kan effektivt utesluta nära vertikala Golgi mini-stackar. (3) co-linjäritet kriteriet, i vilken antingen | tan α | eller | tan β | är ≤ 0,3. Detta kriterium säkerställer att de tre centra för en mini stack är tillräckligt co-linjär för vår endimensionell modell av Golgi mini stacken. Alla ljus Mikroskop lider kromatisk aberration som kan allvarligt snedvrida de relativa positionerna för rött, grönt och mån fluorescens centra. Kromatisk aberration av Mikroskop system är experimentellt kalibrerad av imaging 110 nm pärlor, som är triple-märkt av röda, gröna och mån fluorescens. För varje pärla bild, centrera av röda definieras som pärlan sanna position och kromatiska-förskjutningar av grön- och mån monteras av första ordningens polynom functions. Centrerar av Golgi mini-stackar utsätts för polynom funktioner att korrigera kromatisk-Skift i grönt och mån kanaler.

Genom GLIM kan vi uppnå en upplösning på ~ 30 nm längs Golgi axeln under standart villkorar. Ännu viktigare, ger det en systematisk metod för att kvantitativt karta något Golgi-protein. GLIM kan utföras av konventionella Mikroskop, till exempel wide-fält eller confocal Mikroskop, använder gemensamma fluorescens märkning protokoll. Den imaging och databehandling kan ta så kort som en timme. Genom GLIM, vi har direkt visat den progressiva övergången av sekretoriska lasten från cis- till trans-sida av Golgi7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Nedan är en steg för steg protokollet av GLIM för att bestämma den LQ av andra-taggade tyrosylprotein sulfotransferas 1 (TPST1), en Golgi bosatt enzym, i HeLa cells.

1. beredning av fluorescens-märkt Golgi Mini-staplar

  1. Förbereda glas coverslips
    1. Alikvotens 0,3 mL steril Dulbecco modifierade örnens Medium (DMEM) till en brunn ett 24-väl plåt i vävnadsodling huva.
    2. Torka en bit av Φ 12 mm No.1.5 täckglas använder mjuk vävnad papper dabbed med 70% etanol för att avlägsna skräp på ytan av täckglaset. Använd ett par vassa pincett kort blöta täckglaset i 70% etanol, överför det till 24-väl plattan och sjunker den till botten av den väl som innehåller steril DMEM.
      Obs: Glas coverslips är konventionellt steriliserade med flambering. Dock spricka coverslips under sådan behandling lätt under senare hantering. 70% etanol blötläggning är effektivt i sterilisering glas coverslips utan att skada dem.
    3. Med locket täcks, lämna 24-väl plattan i 37 ° C CO2 inkubator fram till användning.
  2. Utsäde celler
    1. Kultur HeLa cells (härefter celler) i en T-25 kolv i DMEM kompletteras med 10% fostrets bovint Serum (FBS) (nedan kallad komplett medium) i en 37 ° C CO2 inkubator levereras med 5% CO2. Antibiotika behövs inte här.
    2. När celler nå ~ 80% konfluens, aspirera odlingssubstratet. Tillsätt 1 mL av 0,25% Trypsin-EDTA i kolven och inkubera cellerna i en 37 ° C CO2 inkubator för 2 min. Tillsätt 1 mL komplett medium i kolven och spola försiktigt cellerna från kolven väggen av pipettering.
    3. Överföring fristående celler till en steril centrifugering tube och spinn på 500 x g i 2 min till pellet cellerna. Aspirera supernatanten och centrifugerade cell i 1 mL komplett medium.
    4. Aspirera mediet i brunnen av 24-väl plattan som innehåller steriliserad täckglas och utsäde ~ 1 x 105 celler i brunnen. Top upp volymen på brunnen med komplett medium till 0,5 mL. Inkubera i en 37 ° C CO2 inkubator levereras med 5% CO2. Odla cellerna till ~ 80% konfluens.
  3. Transfect celler
    Obs: Väl spridda celler är fördelaktiga för imaging spridda Golgi mini-stackar.
    1. Transfect ~ 80% konfluenta celler med 80 ng GalT-mCherry7 och 320 ng TPST1-andra (se Tabell för material) DNA plasmider använder en transfection reagens enligt protokollet som tillhandahålls av tillverkaren. Inkubera i en 37 ° C CO2 inkubator. Ändra mediet efter 4-6 h inkubation. Cellerna är redo ~ 12 h senare.
  4. Nocodazole behandling att generera Golgi mini-staplar
    1. Förbereda en nocodazole stamlösning (33 mM) genom upplösning 10 mg nocodazole pulver i 1 mL dimetyl sulfoxid. Alikvot stamlösning och förvaras vid-20 ° C för långtidsförvaring.
    2. Späd 1 µL nocodazole stamlösning (33 mM) i 1 mL 37 ° C komplett medium (slutlig koncentration 33 µM). Centrifugera vid toppfart ta bort partiklar.
    3. Aspirera mediet i brunnen och tillsätt 0,5 mL 33 µM nocodazole som innehåller komplett medium. Inkubera cellerna i en 37 ° C CO2 inkubator för 3 h. Fortsätt till immunofluorescens märkning (avsnitt 1.5).
  5. Immunofluorescens märkning
    Obs: Håll celler i mörkret att undvika fotoblekning GalT-mCherry och TPST1-andra.
    1. Förbereda reagenser för immunofluorescens märkning
      1. För att förbereda 4% PARAFORMALDEHYD lösning, lös 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD pulver i heta 1 X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och filtrera lösningen genom 0.45 µm filter. Lösningen kan förvaras vid-20 ° C.
        FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD är giftigt och cancerframkallande och kan orsaka hudirritation. Bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE).
      2. För att förbereda fluorescens förtunningsbuffert (FDB), blanda i 5% (v/v) FBS och 2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS. Filtrera lösningen genom 0.45 µm filter och lagra lösningen vid-20 ° C.
      3. Lös upp 5.35 g NH4Cl pulver i 1 L vatten att förbereda 100 mM NH4Cl och lagra lösningen vid rumstemperatur.
      4. Lös upp 10% (w/v) saponin pulver i vatten för att förbereda 10% saponin, alikvotens och lagra lösningen vid-20 ° C.
    2. Fixering
      1. Skölj den väl en gång med 0,5 mL 1 x PBS lösning och tillsätt 0,5 ml 4% PARAFORMALDEHYD. Inkubera i 20 min i rumstemperatur. Skölj väl två gånger med 0,5 mL 1 x PBS och två gånger med 0,5 mL 100 mM NH4Cl. Skölj väl två gånger med 0,5 mL 1 x PBS. Celler kan förvaras i 1 x PBS vid 4 ° C över natten i mörkret.
    3. Fluorescens märkning
      1. Späd 1 µL musen anti-GM130 primär antikropp i 500 µL FDB som innehåller 0,1% saponin. Omvända locket Skyltens 24-väl och applicera 10 µL primär antikropp blandningen på locket.
      2. Använd ett par vassa pincett att extrahera och överföra täckglaset på släpp av antikropp blandning att säkerställa att sidan cellen är i kontakt med blandningen. Inkubera cellerna med primär antikropp blandningen för 1 h i rumstemperatur.
        Obs: Locket med täckglaset kan placeras i en fuktad plastpåse i mörkret.
      3. Använd en vass pincett att extrahera och överföra täckglaset till brunnen med den cell-sidan upp och skölj den i 0,5 mL 1 x PBS för tre gånger i ≥ 30 min. skaka är onödigt.
      4. Späd 1 µL mån fluorophore konjugerade get antimus IgG (sekundär antikropp) i 500 µL FDB som innehåller 0,1% saponin.
      5. Tvätta och rengör omvänd ytan av locket på 24-väl plattan. Applicera 10 µL mån sekundär antikropp blandningen på locket. Upprepa steg 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Montering
      1. Förbered montering mediet genom att blanda 1 g glycerol, 2,2 g poly(vinylalkohol) (MW ~ 31.000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) och 8,8 mL H2O. Lös upp blandningen i 60 ° C vattenbad med emellanåt omskakas. Förvara lösningen vid-20 ° C.
      2. Tina monteringsmedium och överföra 10 µL på en glasskiva. Överlagra täckglaset (cell nedåt) på droppen monteringsmedium. Inkubera i glas bilden vid 37 ° C i 30 min eller rumstemperatur för 1 h att härda monteringsmedium. Försegla täckglaset med färglös-nagellack och lagra glasskiva vid-20 ° C.

2. beredning av fluorescerande pärlor för kromatisk-shift korrigering

  1. Täckglas rengöring
    1. Placera försiktigt en bit av 25 mm No.1.5 täckglas på en plast rack.
    2. Överföring racket med täckglaset till en 400 mL-bägare fylld med 300 mL 1 M NaOH och Sonikera i ett bad någon sonikator (35 watt) för 15 min. kort skölj racket i en 400 mL-bägare fylld med 300 mL avjoniserat vatten. Överföra racket till en 400 mL-bägare fylld med 300 mL 99% etanol och Sonikera i den bad någon sonikator för 15 min. kort skölj racket i en 400 mL-bägare fylld med 300 mL avjoniserat vatten.
    3. Upprepa steg 2.1.2 två gånger.
    4. Skölj racket med täckglas i 300 mL avjoniserat vatten i en 400 mL-bägare för 10 min. upprepa steget två gånger. Överföra racket till en 60 ° C ugn och torka täckglaset för 1 h. Store det torkade täckglaset i en dammfri petriskål.
  2. Immobilisering av fluorescerande pärlor på täckglaset
    1. Späd 110 nm flerfärgade fluorescerande pärlor 80-fold i 1 x PBS som innehåller 0.1 µg/µL BSA. Kort vortex röret att skingra pärla aggregat. Sprida 60 µL utspädd pärlor på det rengjorda Φ 25 mm No.1.5 täckglaset (se avsnitt 2.1) använder en pipettspetsen. Torka täckglaset i exsickator ansluten till en vakuumpump i mörkret och montera täckglas på en glasskiva i 50 µL monteringsmedium (se steg 1.5.4.2).

3. bild förvärv

Obs: GLIM kräver bilder av hög signal-brus-förhållande (SNR) för hög precision masscentrum beräkning. Bilden kan förvärvas av konventionella Mikroskop såsom laser scanning confocal, spinning disk confocal eller wide-fält Mikroskop. Wide-fält Mikroskop utrustat med plan-apokromatiska objektiv och en låg ljudnivå bildsensor, såsom en avgift – tillsammans enhet (CCD) och vetenskapliga kompletterande metal-oxide semiconductor (sCMOS) kan användas. Parametrar för bildsensorn justeras för att säkerställa en låg Läs-buller och höga dynamiska omfånget. Mikroskopet måste utrustas med optimal konfiguration av fluorescens filter för grön, mCherry och mån fluorophore, och det måste ha försumbar fluorescens överhörning. Idealiskt, imaging systemet uppnår en Nyquist samplingsfrekvens i x, y och z-axeln, som vanligtvis kräver x, y och z storleken på en voxel vara mindre än 100, 100 och 200 nm, respektive. X och y storleken på voxel är alltid lika och kallas pixel_size. Pixel_size kan beräknas genom att dividera kamera sensorstorlek med systemet förstoringen.

  1. Bild flera färger pärlor
    1. Bild flerfärgade pärlor i gröna, röda och mån kanaler i början och slutet av varje bildsession.
      Obs: Här, bilder förvärvades genom en konventionell wide-fältet epi-fluorescens Mikroskop (inverterad) utrustade med 100 X NA 1.4 plan-apokromatiska mål, motoriserad scenen, 200 watts metallhalogen ljuskälla och 16-bitars sCMOS kamera. Våglängderna för excitationsfilter (band passera), dichroic spegel (långa pass) och utsläpp filter (band passera) av gröna kanalen filter kuben är 465-495, 505 och 515-555 nm. de för den röda kanal filter kuben är 528-553, 565 och 578-633 nm. och de för mån kanal filter kuben är 590-650, 660 och 663-738 nm. Under förvärv, storleken på en voxel längs x, är y och z-axeln 64, 64 och 200 nm, respektive.
    2. Hitta ett synfält med bra pärla densitet.
    3. Förvärva 3D bildstaplar i grönt, rött och mån kanaler (kanalG, kanalR, kanalB, respektive). Ta 3 sektioner ovanför och nedanför bäst fokalplanet (7 avsnitt per stapel). Spara de tre högarna som tre TIFF-filer.
      Obs: Exponeringstiden för varje kanal bestäms empiriskt att maximera det dynamiska omfånget, undvika pixel mättnad och minimera fotoblekning. Andra parametrar, såsom filter och x, y och z storleken på voxel, väljs som diskuterats ovan.
  2. Bildstaplar Golgi mini-
    1. Använd TPST1-andra och GalT-mCherry transfekterade och fluorescently märkt (avsnitt 1.5) diabilder att hitta celler som express TPST1-andra och en låg eller medelhög nivå av GalT-mCherry. Förvärva 3D bildstaplar som beskrivs i steg 3.1.3.

4. bildanalys

  1. Förvärva centrerar av fluorescerande pärlor
    1. I ImageJ, öppna en uppsättning pärla bilder bestående av tre TIFF-filer (fil > Bild > Öppna).
    2. Genomsnitt 3 på varandra följande sektioner runt bäst fokuserad avsnittet i kanalR av bild > staplar > Z Project. Ingång avsnittsnumret för ”Start skiva” och ”Stop slice” och bland alternativ av ”projektionstyp”, Välj ”genomsnittliga intensitet”.
    3. Rita områden av intresse (ROIs) som innehåller inga pärlor i bilden med ”Polygon val”. I ”Analyze > Set mätningar”, kolla bara ”grå medelvärdet” och ”standardavvikelse”. Då utföra ”Analyze > åtgärd” att få det medelvärdet och SD av ROI.
    4. Beräkna bakgrund intensiteten som ”genomsnittlig + 6 × SD”. Subtrahera bilden med motsvarande bakgrund intensitetsvärden av ”Process > matematik > subtrahera”, mata in bakgrunden intensitetsvärdet som motsvarar denna kanal.
    5. Upprepa steg 4.1.2 till 4.1.4 för kanalG och kanalB bildstaplar med samma start och stop skiva och samma bakgrund ROI. Observera att ROI använde i steg 4.1.3 kan kopieras till kanalG och kanalB bilder.
    6. Sammanfoga tre bakgrund-subtraheras bilder (bild > färg > Lägg samman kanaler) genom att välja kanalR som rött, kanalG som grön och kanalB som blå. En enda sammansatt bild som består av tre kanaler kommer att erhållas.
    7. Starta ROI manager (Analyze > Verktyg > ROI Manager). Rita en kvadrat ROI runt enstaka pärlor säkerställer att det finns bara en pärla inom varje ROI. Lägga till ROI ROI manager genom att trycka på ”t” på tangentbordet. Upprepa denna process och lägga till så många ROIs som möjligt.
    8. I ”Analyze > Set mätningar”, kolla bara ”masscentrum”.
    9. Välj kanalR, i ROI Manager, klicka på ”mäta” för att få centra; två kolumner motsvarande att x och y koordinat av centrerar av ROIs visas i fönstret ”resultat”. Kopiera och klistra in de två kolumnerna i ett kalkylblad.
    10. Upprepa steg 4.1.9 för kanalG och kanalB.
    11. Ordna koordinater av centra i ett kalkylark i följande ordning: xR,R, y xG, yG, xB, och yB. Spara kalkylbladet i ”CSV” format som ”beads.csv”. Lämna inget utrymme i filnamnet.
  2. Välj och mät Golgi mini-staplar
    1. Installera två makron (bifogas i Kompletterande material) i ImageJ, ”makro-Golgi ROI inspektion” och ”makro-3 kanaler utdata” av Plugins > Installera ”. Tydlig ROI manager och resultatfönstret.
    2. Öppna en uppsättning Golgi mini stack bilder bestående av tre TIFF-filer (fil > Bild > Öppna).
    3. Upprepa steg 4.1.2 - 4.1.5 och spara tre bakgrund-subtraheras bilder för senare användning. Posten bakgrunden SDs för kanalR, kanalG och kanalB som SDR, SDG och SDB, respektive, för senare användning.
    4. Duplicera de tre bakgrund-subtraheras bilder som genereras från steg 4.2.3 (Ctrl + Skift + D).
    5. I ”Process > bild kalkylator”, lägger du först till den bakgrund-subtraheras kanalG kanalR bilder. Lägger till den resulterande bilden i bakgrunden-subtraheras kanalB -bilden. Att den resulterande bilden, i ”bild > Justera > tröskel”, Välj ”set” för att mata in ”1” som ”lägsta tröskelnivå”. Efter att trycka på ”Apply”, är en svart och vit binär bild resulterade.
    6. I ”Analyze > analysera partiklar”, mata in storleksintervallet för ”storlek (pixel ^ 2)”. Mata in ”50-oändligheten”. Kontrollera ”omfattar inte på kanterna” och ”Lägg till Manager”. ROIs innehållande Golgi mini-stackar läggs nu till chefen ROI.
      Obs: Storleksintervallet skall bestämmas empiriskt att utesluta ljud som är i allmänhet små.
    7. Sammanfoga tre bakgrund-subtraheras bilder (bild > färg > Lägg samman kanaler) från steg 4.2.3 genom att välja kanalR som rött, kanalG som grön och kanalB som blå. En enda sammansatt bild som består av tre kanaler genereras.
    8. Kör makrot ”makro-Golgi ROI inspektion” genom att välja ”Plugins > makro-Golgi ROI inspektion”. I dialogrutan interaktiva inspektera visuellt varje ROI för att behålla eller förkasta den. Välj ROIs som innehåller ett enda objekt i alla tre kanaler.
      Obs: Efter att ha kört detta verktyg, avvisade ROIs elimineras från chefen ROI.
    9. Kontrollera bara ”område”, ”grå medelvärdet” och ”masscentrum” ”Analyze > Set mätningar”. Uppkopplingstyp genom att lansera verktyget makro ”makro-3 kanaler utdata” (Plugins > makro-Output 3 kanaler data).
      Obs: Områden, menar stödnivåer och centrerar (x och y) av ROIs i kanalR, kanalenG och kanalB visas i fönstret ”resultat”.
    10. Kopia x och y koordinaterna för centra i ett kalkylblad och ordna dem i följande ordning: xR,R, y xG, yG, xB, och yB. Spara kalkylbladet som en ”CSV” fil (ministacks.csv). Lämna inget utrymme i filnamnet. Gå vidare till kromatiska-shift korrigering av centrerar (avsnitt 4.3) och LQ beräkning (se avsnitt 4.4).
  3. Kromatisk-shift korrigering av centra
    1. Installera Matlab Compiler Runtime (MCR).
    2. Installera följande filer i en dedikerad arbetsmapp: my_train.exe och my_test.exe. Kopiera och klistra in ”beads.csv” och ”ministacks.csv” filer i samma mapp.
    3. Starta ”Kommandotolken” Windows och gå till arbetsmappen genom att skriva följande kommando ” cd path_of_working_folder”.
    4. Generera en kromatisk-shift kalibrering-fil med hjälp av centrerar av pärlor. Skriv följande kommando ”my_train.exe pärlor.csv kalibrering.mat 1”. En fil med namnet ”kalibrering.mat” skapas i arbetsmappen. Ignorera andra filer som genereras.
    5. Korrigera kromatisk-skiftet av centrerar av Golgi mini-stackar genom att skriva följande kommando ”my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv kalibrering.mat 1”.
      Obs: En fil som heter ”corrected_ministacks.csv” skapas i arbetsmappen. Den innehåller kromatiska-shift korrigerade koordinater Centers, som är ordnade i ordning xG, yG, x yBochB . Ignorera andra filer som skapas. Observera att den röda kanalen definieras som fri från kromatisk aberration och därför xR och yR är samma som rådata.
  4. Beräkning av LQs
    1. Starta data analys programvara och kopiera och klistra in, i den nedanför sekvens, menar gråvärden, områden, bakgrund SDs erhållits från steg 4.2.3 (placera dem på rad 1) och kromatiska-shift korrigerade x och y koordinater av Golgi mini-stackar i kanalR till en kalkylblad som kolumnerna A till E. På samma sätt överföra motsvarande data för kanalG och kanalB till kolumn F till J och K-O, respektive.
    2. Lägga till åtta nya kolumner P W, heter ”integrerad intensiteten av kanal R”, ”integrerad intensiteten av kanal G”, ”integrerad intensiteten av kanal B”, d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) och LQ.
      1. Högerklicka på toppen av den respektiva kolumnen och välj ”Ange kolumnvärden” för att beräkna värdena i varje kolumn. För kolumnen P, mata in ”Col(A)Col(B)”; för kolumnen Q, mata in ”Col(F)Col(G)”; för kolumnen ingång R, ”Col(K)Col(L)”; för kolumnen S, ingång ”pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))” där ”pixel_size” är storleken på pixeln i nm. för kolumnen T ingång ”pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))”; för kolumnen U, ingång ”Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) ”; för kolumnen V ingång ”Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) ”; för kolumnen W, ingång ”Col (T) / Col (S)”.
    3. Filtrera de Golgi mini-stackarna efter de tre kriterier som beskrivs i inledningen.
      1. I data analys programvara, gå till ”kalkylblad > kalkylblad fråga” och välj kolumn Variabler för ”om” test. Tilldela följande alias I1, I2, I3, d1, A och B för kolumner ”integrerad intensiteten av kanal R”, ”integrerad intensiteten av kanal G”, ”integrerad intensitet kanal B”, d1, ABS(tan a) och ABS (tan b), respektive. I den ”om villkoret” rutan, ingång ”I1 > =30*cell(1,3) och I2 > =30*cell(1,8) och I3 > =30*cell(1,13) och d1 > = 70 och (A < = 0,3 eller B < = 0,3)”.
      2. Välj ”extrahera till nya kalkylblad”, klicka ”Apply”. Kolumnerna A-W analyserbart Golgi mini-stackar extraheras till ett nytt kalkylblad.
    4. I det nya kalkylbladet, höger klicka överst i kolumnen W, Välj ”statistik om kolumnen > Öppna dialogen”. Kontrollera ”N totalt”, ”Mean”, ”SE betyder”, ”histogram”. Den statistiska analysen av LQs visas sedan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den moderna forskningen grade ljusmikroskop utrustad med ett plan apokromatiska objektiv, såsom den som används i vårt lab visar minimal kromatisk aberration (figur 2A). En noggrann undersökning av flerfärgade fluorescerande pärla bilden kan dock avslöja förskjutningen av olika färgbilder av samma pärla (figur 2B). Vi definierar att den röda kanalen är fri från kromatisk aberration och därför centrerar av röd fluorescens sant positionerna för pärlor. De relativa kromatisk-förskjutningarna av grönt och mån fluorescens kan representeras av gröna och blå vektorer med ursprung från mitten av röd fluorescens (figur 2C). Den kromatiska-förskjutningen inom imaging-planet illustreras empiriskt av gröna och blå vektorn för varje pärla (figur 2D). För våra Mikroskop, de kromatiska-Skift är inte enhetliga både magnituder och riktningar av Skift förändring enligt x och y-positioner. Den kromatiska-shift kan påverka riktigheten i GLIM som förskjutningen av mån centra kan vara så mycket som 50 nm. Kromatiska-Skift måste därför rättas. När centrerar av pärlor förvärvas, anställer vi första ordningens polynom passande att kalibrera och därefter rätta de kromatiska-förskjutningarna av centra. Kromatiska-shift aberration förbättras avsevärt av detta tillvägagångssätt (figur 2 D-G).

I däggdjursceller aggregeras Golgi komplexet på området perinukleära som inte är oftast matchas i konventionella optiska mikroskop (figur 3A). Efter nocodazole behandling i 3 timmar, perinukleära Golgi komplexet försvinner och dussintals Golgi mini-stackar montera på endoplasmatiska retiklet exit platser i hela cytoplasman (figur 3B). Stora bitar av Golgi membran och aggregerade Golgi mini-stackar är närvarande och de är markerade inte för analys. En exempel-bild som illustrerar valet av Golgi mini-stackar visas i figur 3C. Med verktyget ”makro-Golgi ROI inspektion”, 40 valda Golgi mini-stackar visas i figur 3D. Efter tillämpning av de tre kriterierna, 21 Golgi mini-stackar var analyserbart och valt för beräkning av LQs av TPST1-andra (figur 3D; märkt som ”L”), med sin statistik som visas i figur 3E. Totalt 111 analyserbart Golgi mini-stackar valdes från 12 celler och LQ av TPST1-andra mättes för att vara 0,76 0,04 (medelvärde ± SEM; n = 111) (figur 3F). LQ av TPST1-andra placerar det mellan giantin (LQ = 0,59) och andra-Rab6 (LQ = 1,04)7. Det är nära GS15 (LQ = 0,83) och ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Vi har definierat sub-Golgi regionerna enligt LQs genom att beakta kvalitativa localization data från litteraturen: den ERES/ERGIC, < -0,25; cis, 0.00 ± 0,25; mediala, 0,50 ± 0,25; trans-Golgi, 1,00 ± 0,25 och TGN, 1,25-2.00. LQ av TPST1-andra därför anger dess trans-Golgi lokalisering, som är överens med en tidigare studie14.

Figure 1
Figur 1 . Schematiska illustrationer visar variabler som används i beräkningen av GLIM. (A) xz vy av en Golgi mini stack som har co-axial centrerar av GM130, GalT-mCherry och protein x fluorescens visar Golgi axis, axiell vinkel, dx och d1. Bilden av Golgi mini stacken är dess projektion på bildplanet. (B) xy syn på en Golgi mini stack med off-axeln centrerar av protein x visar vinkeln α, vinkel β och projektion axiella avståndet dx. A och B är anpassade från figur 1E och figur 1F vår föregående publikation7, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Korrigering av kromatisk-skiftet. (A) tre färger sammanslagna bilden av 110 nm flerfärgade pärlor förvärvats av ett wide-fält Mikroskop. Varje pärla avger grönt, rött och mån (artificiellt färgad som blå) fluorescens. Skala bar, 10 µm. (B) förstorad bild av ett sammanslagna singel-pärla bilden med en märkbar kromatisk-shift. Skala bar, 200 nm. (C), en schematisk bild som visar att förskjutningar av grönt och mån pärla bilder kan representeras av vektorer från mitten av bildens röda pärlan (0,0) till centra för grön (grön vector) och mån (blå) pärla vektorbilder, respektive. (D, E) Effekten av den kromatiska-shift korrigeringen. Inom samma bild, gröna och blå vektorer är ritade före och efter Skift korrigering. För att visualisera det lilla skiftet, förstärks omfattningen av varje vektor 200-fold. (F, G) Scatter tomter visar centrerar av green (gröna prickar) och mån (blå prickar) pärlor före och efter Skift korrigering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Ett typiskt exempel på GLIM, här förvärva LQ av TPST1-andra. En HeLa cellen uttrycker TPST1-andra (grön) och GalT-mCherry (röd) var färgas för endogen GM130 (blå). (A) A typiska cell. (B, C, D, E) En cell som behandlats med nocodazole fotograferades (B). Från bilden valdes analyserbart Golgi mini-staplar som visas i C. Valda Golgi mini-stackar är märkta av identifikationsnummer. Bilder av dessa maskerade Golgi mini-staplar visas nedan i D med deras identifikationsnummer. ”L” betecknar att Golgi mini stacken är giltig för beräkning av LQ (analyserbart Golgi mini staplar). Histogram över LQs 21 mini-stackar från cellen visas i E. (F) Histogram av LQs 111 mini-stackar från 12 celler. Värdet som visas i histogrammet är medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Kompletterande material: Makro-Golgi ROI inspection.ijm, makro-Output 3 kanaler data.ijm, Matlab koder, My_train.exe, My_test.exe och kalkylblad template.opj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lokaliseringen av ett Golgi protein under ljusmikroskopi kvantifierades tidigare, främst av graden av korrelation eller överlappande bilden av proteinet med bilden av en Golgi markör kända lokalisering15,16, 17. Den resulterande korrelation eller överlappande koefficient återspeglar hur nära testning proteinet är till Golgi markör rumsligt. Det finns minst tre varningar för detta tillvägagångssätt. Först den korrelation eller överlappande koefficient är linjärt och det indikerar inte direkt rumsliga avstånd. Andra är graden av korrelation kritiskt beroende på upplösning av det mikroskopiska systemet. Koefficienten mellan två Golgi proteiner därför inte en systemoberoende konstant. Tredje, två Golgi proteiner med samma axiella lokalisering, men olika laterala fördelning längs cisternae kan ha olika koefficienter. Därför indikerar den korrelation eller överlappande koefficient inte axial lokaliseringen av ett protein som Golgi. I en alternativ metod som föreslagits av Dejgaard et al., cis, trans-Golgi markörer och proteinet av intresse är triple-märkt i nocodazole behandlade Golgi mini-stackar, liknar GLIM. Inom varje Golgi mini stack, positioner på de tre högsta stödnivå pixlarna förvärvas och den relativa positionen av proteinet test beräknas som en avstånd baserat på18. Deras metod är dock oförmögen att uppnå sub pixel upplösning, vilket kraftigt begränsar dess tillämpning. Jämfört med tidigare kvantitativa metoder, GLIM, som utvecklades självständigt men bär ett liknande koncept som Dejgaard et al., kunna kvantifiera axiella lokaliseringen av ett Golgi protein med oöverträffad noggrannhet och konsekvens.

Vi presenterade GLIM att förvärva LQ exogent uttryckt GFP-märkta protein - TPST1-andra protokoll. LQ endogen protein kan bestämmas om dess antikropp är tillgänglig. Beroende på arten av den primär antikroppen, mus eller kanin, sedan en kanin eller musen anti-GM130 antikropp, respektive kan användas i protokollet triple-märkning. Antikroppar mot både kanin och mus-anti-GM130 för immunofluorescens märkning är kommersiellt tillgängliga. Vi har tidigare visat att kanin och musen anti-GM130 antikroppar ger samma resultat i GLIM7. Om proteinet test är egensäkra röd fluorescens utsläpp, såsom mCherry fusion, en GFP-märkta Golgi markör protein med kända LQ i kombination med GM130 antikropp märkning kan användas till triple-etikett celler och indirekt härleda LQ av proteinet test. Förutsatt att markör proteinets LQ är LQm och avståndet från centrum av proteinet markör som GM130 är dm, LQ av proteinet test x kan beräknas som (dxdm) × LQm. En av de största fördelarna med GLIM jämfört med super-resolution mikroskopi är att det enkelt kan tillämpas på den levande cellen imaging i konventionella mikroskopiska uppställningar. Vi har försökt en kombination av tre fluorescens proteiner, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 och GalT-iRFP670, för att dynamiskt övervaka den LQ av GFP-Golgin84 i enda Golgi mini-stackar7.

I GLIM är det mest tidskrävande steget efter förvärvet analys, särskilt på valet av analyserbart Golgi mini-stackar. Golgi mini-stackar är heterogena i både storlek och molekylära sammansättning19, det är oklart om fördelningen av LQs (figur 3F) representerar den heterogena arkitekturen av Golgi mini-stackar eller osäkerheten i vår beräkning av den LQ. Oavsett orsakerna hittade vi att det är viktigt att ha ett stort antal analyserbart Golgi mini-stackar (n) att säkerställa riktigheten av LQ, som äventyras när n är liten. Vanligtvis ger data med n ≥ 100 från flera celler tillförlitlig LQs. Därför ger GLIM ensemble-genomsnitt localization data, skymma egenarten av Golgi mini-stackar. En annan begränsning av GLIM är att det förutsätter att alla Golgi proteiner har smala fördelning runt ett enda centrum. Vissa Golgi proteiner, såsom COPI subenheter, ARF1 och lösliga N-ethylmaleimide-känslig faktor fastsättning protein receptor (snaror)20,21, har rapporterats att distribuera i stora drag från cis till trans- Golgi och TGN. Det är nog olämpligt att studera deras Golgi lokalisering av LQ. Som GLIM för närvarande innebär manuellt val av Golgi mini-stackar, som är både mödosam och subjektiva, blir den framtida utvecklingen av GLIM att genomföra ett verktyg för att automatiskt välja Golgi mini-stackar med minimal mänsklig inblandning.

Vad är den rumsliga upplösningen i GLIM? Eftersom LQ är förhållandet, som är unitless, tyder det inte på rumsliga distans. Här försöker vi ge en mycket grov uppskattning. Den rumsliga upplösningen i GLIM kan definieras som det minsta axiella avståndet mellan två matchas Golgi proteiner. Att undersöka LQs av olika Golgi proteiner7, fann vi att SEMs av datamängder med n ≥ 100 spänna runt 0,03. Förutsatt att två Golgi proteiner har samma n = 100 och SEM = 0,03, de två Golgi proteiner har betydande olika lokalisering av t-test (p < 0,05), dvsmatchas, om skillnaden mellan deras LQs är ≥ 3 × SEM = 0,09. Från EM data, kan vi uppskatta att den axiella längden av Golgi mini stacken, som också är avståndet från GM130 till GalT-mCherry i GLIM, är ~ 300 nm8. Därav, upplösningen på GLIM uppskattas till 0,09 × 300 = 30 nm längs Golgi-axeln. I GLIM ger en större n generellt mindre SEM, vilket i sin tur resulterar i högre upplösning.

Det är nog olämpligt att direkt jämföra GLIM upplösning som immuno-guld EM eftersom den sistnämnda tekniken inte ger direkt kvantitativa localization data. Liknar GLIM, upplösningen av immuno-guld EM längs Golgi-axeln kan definieras som det minsta avståndet mellan två matchas Golgi markörer. För att mäta sin resolution kräver studier av dual-immuno-guld märkning av två Golgi-proteiner som är nära intill varandra längs Golgi-axeln. Sådana systematiska studie är förmodligen inte tillgänglig enligt vår kunskap. Som diskuterats i inledningen, en av de begränsande faktorerna i den rumsliga upplösningen i den immuno-guld EM är den stora storleken av antikropp komplexa, vilket gör den resolution som sämre än ~ 20 nm. En annan viktig begränsande faktor av bildens upplösning är märkning tätheten av antigen molekyler. Enligt Nyquist provtagning teorin, måste det finnas minst två guld partiklar per upplösning enhet. I de flesta immuno-guld EM studier, avstånden mellan granne guld partiklar inte < 15 nm på grund av den mycket låga märkning energieffektivitet Detta gör det svårt för denna teknik för att uppnå en upplösning som är mindre än 30 nm. Från denna synpunkt uppskattar vi att upplösningen på GLIM är minst jämförbar med immuno-guld EM.

GLIM är en robust metod som ger mycket konsekvent resultat. Det är oberoende av vilken typ av Mikroskop används. Vi har testat de wide-området och roterande disk confocal Mikroskop gav samma resultat. LQs av samma Golgi proteiner förvärvats på olika partier av experiment var också bra överens med varandra. En LQ-databas som består av ett varierat utbud av Golgi bosatt proteiner har genererats för jämförelse och tolkning. Vi förväntar oss att mer användning av GLIM i forskarvärlden avsevärt kommer att expandera databasen. En mer komplett databas kvantitativt beskriva localizationen av ett stort antal Golgi proteiner hjälper följaktligen kraftigt förstå organisationen och funktionen av Golgi komplexet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi vill tacka D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Storbritannien) för såväl TPST1-andra DNA plasmid, som Lakshmi licette Gun för att hjälpa till med optimering programvara. Detta arbete stöds av bidrag från de nationella medicinska forskningsrådet (NMRC-CBRG-007/2012), Undervisningsministeriet (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 och RG132/15 och AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) till L.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).

Tags

Cellular Biology fråga 126 Golgi Golgi mini stack protein lokalisering kvantitativa lokalisering fluorescensmikroskopi super-upplösning imaging.
Kvantitativa lokalisering av ett Golgi Protein av Imaging Center av fluorescens massan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tie, H. C., Chen, B., Sun, X.,… More

Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter