Summary
כימות של תאי התורם-derived נדרש לעקוב אחר engraftment לאחר השתלת תא גזע בחולים עם פתולוגיות של המוגלובין. שילוב של מיון תא מבוססי cytometry זרימה המושבה היווצרות assay, לאחר מכן ניתוח של טנדם קצר חזרה ניתן להשתמש כדי להעריך את התפשטות ובידול של אבות בתוך התא erythroid.
Abstract
הנוכחות של chimerism לא שלם הוא לציין אחוז גדול של חולים לאחר השתלת מח עצם תלסמיה הגדולות או מחלה חרמשית. התבוננות זו השלכות עצומות, כפי immunomodulation טיפולית עוקבות אסטרטגיות יכול לשפר את התוצאה הקלינית. כמקובל, ניתוח המבוסס על תגובת שרשרת פולימראז של טנדם קצר חזרה משמש לזיהוי chimerism בתאי הדם נגזר התורם. עם זאת, שיטה זו מוגבל לתאים nucleated, מסוגל להבחין בין שושלות תא בודד חלופה מועדפת. אנו החלת הניתוח של טנדם קצר חזרה לזרום ממוין cytometric hematopoietic ובתאים, לעומת זה הניתוח של חזרה קצרה טנדם המתקבל שנבחר להיוות פרץ יחידה - מושבות erythroid, שניהם שנאסף העצם מח. בשיטה זו אנו מסוגלים להפגין את התפשטות שונה ואת התמיינות תאי התורם בתוך התא erythroid. טכניקה זו זכאי להשלמת ניטור הנוכחי של chimerism ב השתלת תא גזע הגדרת וייתכן לפיכך מחקרים קליניים עתידיים יישומית, מחקר תאי גזע ועיצוב של ג'ין טיפול משפטי.
Introduction
השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic (HSCT) היא גישה המרפא זמין רק עבור מגוון רחב של הפרעות גנטיות מולדת של המערכת hematopoietic, להשגת שיעורי ההישרדות ללא מחלה של למעלה מ-90% עבור אחרת מאוד בסכנה, מטופלים חיים מוגבל1. היעילות של כלי טיפולי חשוב זה הותאם על ידי הגבלת הרעילות של טרום-שלאחר ההשתלה משטרי2, אך גם על ידי התערבויות שמטרתה לקיים תפקוד שתל יציב, אשר הוא לכמת על ידי מעקב צמוד של תאי התורם-derived3,4,5.
באופן כללי, בו מלאה chimerism (CC) מרמז על התחליף הכולל של תא lymphohematopoietic על ידי התורם-derived תאים, ואילו המונח מעורב chimerism (MC) משמש כאשר תאי התורם, נמען-נגזר נוכחים בו זמנית שונות הפרופורציות. פיצול chimerism (SC) מציין קיום של מעורבות chimerism הנהוגות שושלות מתא בודד, כגון בתוך התא erythroid. בקש התאקלמות chimerism בעקבות HSCT היא קריטית, כמו זה יכול לעזור לזהות חולים חשופה התדרדרות המחלה, אסטרטגיות immunomodulatory הבאים אתחול, כמו חליטות לימפוציט התורם או הפחתת לדיכוי המערכת החיסונית טיפולים6.
פותחו מספר שיטות לניטור engraftment לאחר HSCT. Isotyping של immunoglobulins וניתוח של ציטוגנטיקה יש רגישות המסכן, מוגבלים ביכולתם לזהות פולימורפיזם7,8. המבוא של פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דגים) יכול לשפר רגישות בפיקוח chimerism לאחר HSCT, אך מוגבלת תואמים-סקס allografts9. כיום, תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) היא השיטה הנפוצה ביותר המשמשים לזיהוי chimerism והוא מבוסס על agarose קונבנציונלי-אקרילאמיד בג'ל של משתנה מספר טנדם חזרה (VNTRs) או טנדם קצר חוזר (STRs). בשימוש שגרתי PCR כמותי הוא מסוגל לזהות של אחוז קטן מאוד של תאים שיורית התורם בעקבות HSCT. המגבלה העיקרית של המחקרים עד כה הוא כי זיהוי MC מוגבל באופן כמעט בלעדי על נוכחות של תאים nucleated, יותר מאשר בוגר אריתרוציטים, כלומר תאים כי מבחינה פונקציונלית מכריע עבור חולים הושפעו פתולוגיות של המוגלובין. בחולים עם קבוצות דם שונות, אך חשוב לזכור כי ניתוח cytofluorometric הוא מסוגל לזהות chimerism בתאי דם אדומים על ידי ניצול נוגדנים חד-שבטיים מכוונים כדוריות דם אדומות אנטיגנים ABO ו- C, c, D, E ו- e10 , 11. אמצעי שונה, אבל מאוד מעניין הערכת chimerism בשושלת erythroid הוא השילוב של זרימה cytometric מיון של אבות erythroid, מבחר סוגים שונים של קדמון erythroid לפי culturing במבחני clonogenic, בעקבות ניתוח של סטראדה12. גישה זו היא היכולת לכמת כמויות יחסיות של chimerism התורם-נגד-נמען בתא erythroid, עשוי להיות מנוצל האסטרטגיה כדי לקיים את השתלת מח עצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד של Hematopoietic תאים במח העצם על ידי מופעל מרובה פרמטר קרינה פלואורסצנטית מיון תא
- מכתים מדגם
- לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים צריכים להיות שנאספו מוכן:
- צבע מדיה עבור הכנת תאי תאי (GM), 50 מ ל חרוט צינורות
- 12 x 75 מ מ צינורות זרימה עבור צביעת תאים
- Staining מאגר: פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) + 3% עגל עוברית סרום (FCS)
- פיפטות < /l אני >
- FC לחסום ו מכתים נוגדנים (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD החיים). עם השילוב fluorochrome והתאמת זניח לתוך ערוצים אחרים, אבל כל שילוב fluorochrome מתאימים אחרים אפשרי גם.
- חרוזים פיצוי (במקרה הצורך)
- מאגר ההשעיה: האנק ' s מאוזנת פתרון מלח (HBSS) + 25 מ מ HEPES + 3% FCS
- Trypan blue ו- hemocytometer
- צינורות איסוף: ניתן להשתמש בכל אמצעי עשיר עם צינורות גבוהה סרום (מכיל 1 מ"ל FCS + 25 מ מ HEPES) עבור האוסף של תאים ממוינים. מדגם
- מח עצם: הסכמה מדעת עבור ביופסיה מח עצם מן האגן של החלק האחורי של עצם הירך נדרש בדרך כלל. המדגם מח עצם הוא יותר שמרה במזרקים heparinized ב RT עד מכתים. בשלבים הבאים פרוטוקול מבוצעות בהתאם להנחיות של המוסד ' ועדת האתיקה האנושית מחקר s לרווחת האדם.
- ליצור השעיה תא בודד של המדגם מח עצם. להוסיף 3 מ"ל של ג'נרל מוטורס הצינור צנטריפוגה. בזהירות שכבה mL 4 של התליה תא בודד על הפתרון GM. צנטריפוגה-550 גרם במשך 30 דקות ב 20 ° צלסיוס (C) (בלם מבוטלת). צייר של השכבה העליונה המכיל פלזמה ולבנים וטסיות דם באמצעות פיפטה סטרילי, עוזב את שכבת תאי תא ללא הפרעה על הממשק. להעביר את שכבת תאי תאי שפופרת צנטרפוגה סטרילי באמצעות פיפטה סטרילי של.
- אחרי כביסה עם 5 מ"ל מכתים מאגר, resuspend את התאים במאגר ההשעיה 2 מ"ל ולקבוע את הריכוז תא. מקום 5 µL תא השעיה במבחנה פקקי בורג. הוסף µL 95 של 0.2% Trypan blue כתם. מערבבים ביסודיות. אפשר לעמוד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מילוי של hemocytometer לגבי ספירת תאים. תחת מיקרוסקופ, להתבונן אם כלכלית מוכתמים ולספור את התאים קיימא.
- Centrifuge התאים ב- 250 גרם 10 דקות ב- 20 ° C, למחוק את תגובת שיקוע, התאים מכתים מאגר-ריכוז של עד 1 x 10 6 לכל 100 µL resuspend.
- בלוק ה-FcR על ידי שימוש µg 2.5 בלוק Fc לכל עונה 1 פרק 10 תאים 6 על קרח במשך 10-15 דקות
- הוסף השילוב המתאים של 10 µg mAb כתם עונה 1 פרק 10 6 תאים ו תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך, ואחריו צעד כביסה עם 3 מ"ל מכתים מאגר. פיצויים הנכון, מוכתמים aliquots קטן של תאים (או רצוי חרוזי פיצוי) יחיד נוגדנים לכל; aliquot אחת שנותרה וללא רבב.
- להתאים את הריכוז 20 x 10 6 תאים/מ ל....
- סט למעלה ולמטב את סדרן התא. התהליך של הגדרת זרימת cytometer עם תוכנה יתוקנן עם הוראה מפורטת שמספקת החברה וצריך להתבצע על ידי צוות מיומן כראוי.
- לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים צריכים להיות שנאספו מוכן:
- מיון ב סדרן התא
- להכין אוסף טורפדו מהשלב 1.1.1.9.
- להגדיר תבנית הכולל מגרש bivariate להצגת פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס).
- להפעיל את התאים ולהתאים FSC/האס להצבת האוכלוסייה עניין בקנה מידה
- להקליט את הצינור שליטה שלילי.
- להפעיל את הצינורות בקרה חיובית בודדת; לרשום את הנתונים לכל שפופרת.
- לחשב פיצוי באופן ידני או באופן אוטומטי עם הפונקציה המסופקים על ידי רכישת התוכנה-
- לרכוש מדגם ניסיוני, שער אותם על bivariate FSC/האס נקודה מגרש ( איור 1 א') כדי לכלול תאים לימפוציטית והן מיאלואידית. אל תכלול doublets ו אגרגטים על-ידי השוואת האותות שונים של FSC (קרי, גובה, רוחב ואזור) ( איור 1B). דמיינו את התאים גופיה על מגרש נקודה bivariate הצגת CD45 ו CD36 ( איור 1C). אירועים חיוביים עבור CD45 הם leucocytes (כולל אבות שלהם), אלה שלילי CD45 חיובי עבור CD36 שבאוכלוסיה erythroid. השתמש המגביל כלים להגדרת CD36 + (אם הרצויה, תאים אלה ניתן לחלק נוספת ב CD36 גבוהה לבטא נמוך תאים) ו- CD45 + תאים. דמיינו CD45 + אירועים בעלילה נקודה נוספת הצגת פרמטרי CD34 והאס. שימוש gating כלים להגדרת CD34 + תאים (ליקוציט אבות) ותאים האס גבוהה (התאים מיאלואידית בשלבים שונים של בידול).
- , ברגע שנקבע גייטס, השערים ניתן לבחור לצורך מיון לתוך צינורות איסוף חיצוני.
- להמשיך עם מיון ב 4 ° C עד המספר הנדרש של תאים התקבל
- לבצע ניתוח שלאחר מיון כדי לקבוע את הטוהר של אוכלוסיות תאים ממוינים ( איור 1E, 1F).
2. Clonogenic Assay
- הכנה של ריאגנטים
לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים צריך להיות שנאספו והכין:- מדי סוכר, 100 מ מ צלחות
- Trypan blue ו- hemocytometer
- לשקם אריתרופויאטין רקומביננטי אנושי (EPO) ב- U/mL 500 ב- PBS סטרילי המכיל לפחות 0.1% אלבומין אנושי. לחלק את הפתרון הזה aliquots קטן ולשמור ב-20 ° C כדי להימנע ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.
- הכן להשלים Iscove ' s שונה Dulbecco ' s בינוני (IMDM) עם ריכוזים הסופי של 5% FCS, 2 מ מ גלוטמין, 100 יחידות/mL פניצילין/סטרפטומיצין (PS). להוסיף האנושי אריתרופויאטין רקומביננטי (EPO) בריכוזים שונים בבארות נפרד המדיום IMDM מלאה: 3 יחידות EPO/טוב, 6 יחידות EPO/טוב, 12 EPO יחידות/טוב (1 x, 2 x, 4 x EPO בהתאמה).
- הכנה של תאים במח העצם
- 10 מ"ל של המדגם מח עצם מדולל עם 20 מ ל PBS מוצבות לאט מעל 15 מ"ל צפיפות בינונית הדרגתיות צינור חרוטי 50 מ ל, שמירה על ממשק ברור בין את שני השלבים אוי בתנאים סטריליים. ואז centrifuge 15 mL הצינורות חרוט ב 550 גרם x במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם הגדר 9 האצה והאטה בתפאורת 0 (או בלם לבטל).
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את הממשק לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף PBS נפח סופי של 50 מ ל.
- לאחר צנטריפוגה עם 250 גרם 10 דקות ב 10 ° C להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים במדיום IMDM מלאה כ 0.5 x 10 6 תאים למ"ל. לקחת 10 µL של התליה תא microtube, לערבב באותו אמצעי אחסון של פתרון Trypan blue (0.4%), נחשב שימוש hemocytometer.
- Optional: תאי CD34 + מועשרים ידי תא מגנטי מיון עם חרוזים Milteny CD34 על פי ההוראות שניתנו על ידי הייצור. היתרון העיקרי של שלב זה העשרה הוא לזהות את האיכות של תאי גזע hematopoietic, אשר גדלים על מטריצה מוצק למחצה נוסף עם 50 ng/mL תאי הגזע מקדם (SCF), 20 ng/mL גרנולוציט-מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (GM-CSF), 20 ng/mL אינטרלוקין-3 (IL-3), ng/mL 20 interleukin-6 (IL-6), 20 ng/mL גרנולוציט המושבה-מגרה פקטור (G-CSF) ו 3 ריכוזים שונים של EPO כמו 1.4.
- לדלל את התאים כדי 0.1 - 0.15 x 10 6 תאי תאים למ"ל או 2 x 10 3 CD34 + תאים למ"ל על-ידי הוספת בינוני IMDM מלאה בתוספת EPO והעברה µL 300 מ ל 3 Methocult H4434 בינונית. לאחר ודאגה דגירה קצרה עבור 5 דקות צלחת שלוש פעמים 1, 1 mL בצלחת 35 מ מ. שני הכלים האלה תרבות לצד שלישי - מלא במים - מוצבים לוחות 100 מ מ.
- תאים מתורבתים ב חממה humidified 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 14 ימים.
- ניתוח של המושבות
- המושבות אתה צובר על פי המורפולוגיה שלהם עם מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 40 בקערה תרבות המסומנים רשת הבקיע. למטרות שלנו assay, היחידות ויוצרים מושבה (CFU) מסווגים לקטגוריות 4: multipotential ובתאים (CFU-GEMM), ובתאים גרנולוציט-מקרופאג (CFU-GM), פרץ ויוצרים יחידה-erythroid (BFU-E) והמושבה ויוצרים יחידת-erythroid (CFU-E). לראות את יצרן ' s הנחיות נוספות המושבה subclassification.
- לצורך ניתוח נוסף, התאים מהצלחת assay CFU התאוששו בנפרד לפי קטגוריות 4 על ידי השעיית הטמפרטורה בחדר 4 מ"ל PBS המכיל 2% FCS/IMDM. לאחר צנטריפוגה-400 גרם 10 דקות ב 4 ° C, התאים resuspended ב- PBS, ספרתי הינם מעובד להפקת DNA-
3. ניתוח של Chimerism
- בידוד ה-DNA
- גלולה התאים על ידי צנטריפוגה-400 גרם במשך 10 דקות
- DNA לבודד באמצעות בדיקת דם ערכת חילוץ דנ א (ערכת חילוץ QIAmp דנ א דם). לחמם את המאגר • תנאי (AE) ב 37 ° C כדי לשפר את התשואה של דנ א eluted.
- מודדים את ריכוז הדנ א עם Nanodrop ND-1000 ספקטרה photometer. דוגמאות עם יתר 260/280 בין 1.8-2.0 משמשים לצורך ניתוח נוסף.
- DNA לדלל עם DNAase חינם H 2 O ל- ng/µL 0.1 ב הנפח הכולל של 50 µL-
- STR-אנליזה
- להגדיר את תגובת ה-PCR על ידי ערבוב תערובת התגובה, AmplTaq זהב DNA פולימראז ולקבוע Profiler פלוס תחל עם הדנ א 20 µL (0.1 ng/µL) על פי המדריך (ערכת פריימר מכיל ללא תווית תחל במאגר כדי להגביר את לוקוסים סטראדה D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, amelogenin סמן את המגדר). כוללים מים נטולי נוקלאז כפקד שלילי 9947A כפקד חיובי. לפני השתלת DNA התורם והן לנמען הינם כלולים גם.
- התגובה לבצע PCR באמצעות גלאים mastercycler מעבר צבע עם התנאים הבאים: 95 ° C עבור 11 דקות, 28 מחזורים הגברה של 95 ° C עבור 1 דקות, 59 ° C עבור 1 דקות ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, ולאחריו 60 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות
- קבע את הרסיס התגובה ניתוח על-ידי הוספת 12 µL Hi-Di Formamid ו- 0.5 µL GeneScan 500 רוקס בגודל סטנדרטי (ביוסיסטמס חלה כל) כדי µL 1 של מוצר ה-PCR. על המיקום הראשון והאחרון הסולם Allelic (כח Genotyper פל סטראדה כחול, ירוק II וצהוב, מתריעות חלה) יש צורך.
- להתחיל אלקטרופורזה ורכישה עם המכשיר אלקטרופורזה.
- לוקוסים לנתח, אללים, שיא לגבהים של הפקדים עם תוכנה 13 ודוגמאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרדת אבות lymphohematopoietic על-ידי מיון תא FACS
נדגים כאן תוצאות מיון האוכלוסיות תא הדרושים לניתוח סטראדה במורד הזרם. תאים במח העצם היו מוכתמים מצומדת V450 anti-CD45, FITC מצומדת אנטי-CD36, אנטי-CD34 מצומדת-APC. האוכלוסייה של עניין הוא התאים אבות (חבר הפרלמנט האירופי), nucleated erythroid מגקריוציט אחראי על הפיתוח של אריתרוציטים. תאים אלה אקספרס CD36 אך יצאו שליליות עבור אנטיגן משותף לויקוציטים CD45 (איור 1C). במידת הצורך, תאים אלה ניתן עוד להבחין מבוסס על רמת ביטוי CD36 שלהם. מספר אוכלוסיות נוספות ניתן למיין לשמש כפקדי. אנחנו מיון CD45 + CD34 + מבשרי הלימפה/מיאלואידית כמו עוד אוכלוסיה תא קדמון ותאים CD45 + קליטה האס גבוהה כמו התאים מיאלואידית בוגרים (איור 1D). מיון בוצעה עם FACSAria BD אני מכשיר.... לאחר מיון, היה erythroid קדמון תא טוהר > 85% (איור 1E) והיה התאים מיאלואידית טוהר > 95% (איור 1F).
איור 1 . מיון של Erythroid ובתאים, ובתאים מיאלואידית לאחר FACS. איור 1A/1B מציג על FSC-A לעומת SSC-A, FSC-H לעומת FSC-A את השימוש בכלי מצולע שער לבחירת האוכלוסייה של ריבית. 1 C מציין חבר הפרלמנט האירופי ב CD45 לעומת CD36; 1 י מציג התאים מיאלואידית בוגרים. אחוז תאים חיוביים 1E ו- 1F מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
דור של יוצרי פרץ יחידות - erythroid המושבות
כמה תאים שמקורם במח העצם, המופרדים beads מגנטי CD34 ספציפיים מופיעים כדי להתרבות, להבדיל. לאחר תקופת דגירה 14 יום על המושבות בינוני מוצק למחצה נוצרות. גירוי עם ריכוזים שונים של EPO מרובדת באופן משמעותי היווצרות של מושבות אדום בולט (erythroid) (איור 2).
באיור 2. מהדור יוצרי פרץ יחידה-erythroid (BFU-E). המוצג הוא photomicrograph חשמל נמוכה נציג של מושבה BFU-E. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| MNC: | |||
| 1 X אריתרופואיטין | 2 X אריתרופואיטין | 4 X אריתרופואיטין | |
| CFU-E | 2 | 2 | 2 |
| BFU-E | 9 | 10 | 8 |
| CFU-GM | 30 | 30 | 29 |
| CFU-GEMM | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ תאים: | |||
| 1 X אריתרופואיטין | 2 X אריתרופואיטין | 4 X אריתרופואיטין | |
| CFU-E | 1 | 1 | 0 |
| BFU-E | 5 | 11 | 6 |
| CFU-GM | 25 | 26 | 32 |
| CFU-GEMM | 0 | 2 | 3 |
טבלה 1. ניתוח של מושבות תאים במח העצם ממוינת ו- CD34 + נבחרים תאים. המושבות אתה צובר על פי המורפולוגיה שלהם עם מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 40 בקערה תרבות המסומנים רשת הבקיע. למטרות שלנו assay, מסווגים את המושבות בארבע קטגוריות: המושבה יוצרי יחידה-erythroid (CFU-E), ויוצרים פרץ יחידה-erythroid (BFU-E), ובתאים גרנולוציט-מקרופאג (CFU-GM), ובתאים multipotential (CFU-GEMM).
ניתוח של chimerism
ניתוח chimerism מתבצעת באמצעות כחפלסטראדה Profiler פלוס הערכה (ביוסיסטמס מוחל, קליפורניה) לפי הפרוטוקול של היצרן על גליה פריזמה 310 המאבחן הגנטי (ביוסיסטמס מוחל, קליפורניה). הניתוח מבוצע בעזרת תוכנת GeneMapper (ביוסיסטמס מוחל, קליפורניה). D21S11 לוקוסים, D7S820, FGA, vWA שימשו לחישוב תוצאות (אחוז של הנמען התורם ספציפיים או דנ א).
| מדגם | הנמען דנ א | התורם דנ א |
| CD45 | 25% | 75% |
| CD36hi | 25% | 75% |
| CD36lo | 55% | 45% |
| CD34 | 25% | 75% |
בטבלה 2. אחוז התורם ונמען ה-DNA בתאים המתקבל תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון תאי מח העצם. Chimerism של התורם תאים ספציפיים הסלולר שושלות של תא lymphohematopoietic ניתנת.
| מדגם | הנמען דנ א | התורם דנ א |
| BM-MNC | 24.71% | 75.29% |
| BM-CD34 |
בטבלה 3. התורם ונמען אחוז ה-DNA בתאים המתקבל וזמינותו Clonogenic. Chimerism של התורם תאים ספציפיים הסלולר שושלות של תא lymphohematopoietic ניתנת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי היא כדי לספק לקהל שילוב של שתי גישות ניתוח chimerism התורם/נמען בבית אבות erythroid בעקבות HSCT בחולים שטופלו על פתולוגיות של המוגלובין: 1.) תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון של hematopoietic ובתאים דגימות מח עצם שלאחריה יבוא ניתוח של חזרה טנדם קצר ו- 2.) המושבה יוצרי יחידת גידול של תאים במח העצם, סיווג של המושבות בסוגים שונים של קדמון ואחריו ניתוח של חזרה קצרה טנדם. החידוש של גישה זו טמון את טכניקות של פרוטוקול כדי להעריך את התורם/המקבל chimerism במושבות בודדים.
ניתן למצוא את חשיבות מיוחדת של גישה זו בהקשר של chimerism מעורבת לאחר HSCT עבור חולים שטופלו על פתולוגיות של המוגלובין. מספר מחקרים הראו כי חלק ניכר מהחולים אקספרס אחוז נמוך של התאים מיאלואידית התורם להרכב של erythroid קודמן תאים und תוצאות באורווה לטווח ארוך מעורב hematopoietic chimerism3, 11; לעומת זאת, בחולים באותו אחוז גבוה של התורם, נגזר כדוריות דם אדומות (2 - ל 5 פי גבוה מזה של לויקוציטים בוגרת) יצויין, מציע כי יעילות אריתרופויזה מתרחש בשלב מאוחר יותר של התפתחות erythroid. תצפיות אלו יוחסו של הנטייה של אפופטוזיס מואצת erythroblasts התורם ואת התמדתו של T ו- B שיורית לימפוציטים אחראי על מתן אפשרות להשתלת מעורבות14,15. בהקשר של immunomodulation בעקבות השתלת תא גזע hematopoietic לאחרונה להדגים את השינוי של טיפול לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת hematopoietic לתוצאות ß-תלסמיה ב יתרון סלקטיבי עבור תא erythroid תוקן גנטית, נתינה 2 - ל 2.5 פי הגברה של הגזע התורם שיורית תאים12. התבוננות זו תומכת את התועלת של קביעת התורם-נגד-ממסר erythroid אבות, כפי שהוא מספק הבנה של תופעה זו תומכת בניסויים קליניים בעתיד ללמוד ריפוי גנטי לטיפול של פתולוגיות של המוגלובין. למעשה, חלקם של תאים nucleated שעבר שינוי גנטי הדרושים כדי להשיג רמה טיפולית של מחזורי כדוריות דם אדומות עשוי להיות דומה לזה שנצפה אצל חולים שטופלו השתלת תא גזע על פתולוגיות של המוגלובין.
על מנת לקבוע את התמונה המלאה של התורם אריתרופויזה אנחנו ששינה את הפרוטוקול, מספקים גישה ניסיוני מפורט שלב אחר שלב. השלב הקריטי פרוטוקול זה הוא התהליך של הגדרת cytometer של זרימה, תוכנה, אשר יתוקנן עם הוראות מפורטות חייב להתבצע על ידי צוות מיומן כראוי. המצגת של פרוטוקול שלנו בתבנית מטמיעים מאפשר לקהל לעקוב אחר הפרוטוקול שלנו בקלות. השווינו את התוצאות PCR שלנו באמצעות ה-DNA גנומי של אבות erythroid המתקבל המושבה יוצרי יחידות בדגימות מוניטור לעומת ה-DNA המתקבל erythroid ממוין FACS מח עצם אבות. מהנתונים engraftment תורם שתי הגישות הן די עקבי. עם זאת, בדרך כלל פחות וריאציה נמצאה בדגימות שהתקבלו המושבה יוצרי יחידות. . זה ככל הנראה בגלל ההישרדות משופרת של תורם תאי הדם האדומים סימנים מקדימים ב וזמינותו במבחנה לעומת עמיתיהם התורם אינו מטופל, ממוינים. באור הזה, פרוטוקול זה ניתן להרחיב על ידי באופן מלאכותי יצירת צירופים chimeric מעורבים עם הפרופורציות הידוע של אבות בריא, אבות מתוך מגוון רחב של חולים עם פתולוגיות שונות של המוגלובין. Clonogenic assay והערכה של chimerism לשקף במדויק בהניח הפרופורציות.
למרות הבנה מדויקת של המנגנונים המעורבים הגדרה מיוחדת זו לוקה בחסר, השיטה המובאת כאן היא בעלת חשיבות עליונה למתן מידע רלוונטי עבור ניטור שוטף של engraftment ומידע prognostic ב התמחות קלינית. הניסיונות להציל את תפקוד שתל מוגבלים על ידי הסיכון לפתח שתל – מול – מארח מחלות, יכול להיות מונחה על ידי ניטור engraftment סדרתי. לבסוף, שיטה זו עשויה גם לספק בסיס שטחי מחקר מחויבת לשיפור הטיפול בחולים עם פתולוגיות של המוגלובין, במיוחד אלה מושפעים חריפה שתל – מול – מארח מחלות ומחלות אוטואימוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי איטליה Regenbogen Kinderkrebshilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
