Summary
Kvantifisering av donor-avledet celler er nødvendig for å overvåke engraftment etter stamcelletransplantasjon hos pasienter med hemoglobinopathies. En kombinasjon av flyt cytometri-baserte celle sortering, koloni formasjon analysen og påfølgende analyse av kort tandem gjentar kan brukes til å vurdere spredning og differensiering av progenitors i erythroid rommet.
Abstract
Tilstedeværelsen av ufullstendig chimerism er nevnt i en stor andel av pasienter etter benmarg transplantasjon for talassemi store eller sigdcelleanemi. Denne observasjonen har enorme implikasjoner, som etterfølgende terapeutiske immunomodulation strategier kan forbedre kliniske utfallet. Konvensjonelt, brukes polymerase kjedereaksjon-basert analyse av kort tandem gjentar til å identifisere chimerism i donor-avledet blodlegemer. Men denne metoden er begrenset til kjerne celler og ikke kan skille mellom dissosiert encellede overleveringslinjer. Vi søkt analyse av kort tandem gjentar å strømme cytometric-sortert blodkreft stamfar celler og sammenlignet dette med analyse av kort tandem gjentar fra valgt burst-forming enhet - erythroid kolonier, begge fra benet benmarg. Med denne metoden er vi i stand til å demonstrere ulike spredning og differensiering av donor cellene i erythroid rommet. Denne teknikken er kvalifisert til å fullføre gjeldende overvåking av chimerism i det stilk celle transplantasjonen innstilling, og dermed kan være brukt i fremtiden kliniske studier, stamcelleforskning og design av gene terapi studier.
Introduction
Allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (HSCT) er bare tilgjengelig helbredende tilnærming for en rekke medfødt genetiske lidelser av blodkreft systemet, oppnå sykdomsfri overlevelse av mer enn 90% for ellers svært svekket og livet-begrenset pasienter1. Effekten av dette viktige terapeutiske verktøyet er optimalisert ved å begrense toksisitet av pre- og etter transplantasjon regimer2, men også av intervensjoner rettet opprettholde stabil pode-funksjonen, som er kvantifisert ved tett oppfølging av donor-avledet celler3,4,5.
Generelt, innebærer komplett chimerism (CC) total utskifting av lymphohematopoietic kupé av donor-avledet celler, mens begrepet blandet chimerism (MC) brukes når donor - og mottaker-avledet celler finnes samtidig i forskjellige proporsjoner. Delt chimerism (SC) betegner en sameksistens av blandet chimerism observert i én celle linjene, som i erythroid rommet. Spør fastsettelse av chimerism status etter HSCT er kritisk, som det kan bidra til å identifisere pasienter utsatt for sykdommen tilbakefall og starte etterfølgende immunmodulerende strategier, som giver lymfocytt infusjoner eller reduksjon av suppressive terapi6.
Flere metoder har blitt utviklet for å overvåke engraftment etter HSCT. Isotyping av immunglobuliner og analyse av cytogenetics har dårlig følsomhet og begrenset i sin evne til å oppdage polymorfisme7,8. Innføring av fluorescerende i situ hybridisering (fisk) kan forbedre følsomhet chimerism overvåke etter HSCT, men er begrenset til sex-feil allografts9. Foreløpig polymerasekjedereaksjons (PCR) er den vanligste metoden brukes til å oppdage chimerism og er basert på konvensjonelle agarose-akrylamid gel geleelektroforese av variabelt antall tandem gjentar (VNTRs) eller kort tandem gjentar (STRs). Rutinemessig brukes er kvantitative PCR kjøpedyktig merker en svært liten andel av rester donor cellene etter HSCT. Stor begrensning av studiene så langt er at MC gjenkjenning er nesten utelukkende begrenset til tilstedeværelsen av kjerne celler, i stedet for eldre erytrocytter, nemlig celler at funksjonelt viktig for pasienter påvirkes av hemoglobinopathies. Pasienter med ulike blodtypene er det verdt å huske at cytofluorometric analyse er identifisere chimerism i røde blod celler ved å benytte monoklonale antistoffer rettet mot de røde blodlegemer antigener ABO og C, c, D, E og e10 , 11. en annen, men veldig interessant måte å vurdere chimerism i erythroid avstamning er kombinasjonen av flyt cytometric sortering av erythroid progenitors og utvalg av ulike erythroid stamfar typer av dyrking i clonogenic analyser, etterfulgt av analyse STR12. Denne tilnærmingen er kunne kvantifisere relative proporsjonene i donor-versus-mottaker chimerism i erythroid skuffen og kan benyttes i strategien for å opprettholde bein margtransplantasjon graftet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolasjon av blodkreft bein margtransplantasjon celler av flere parameter fluorescens-aktivert celle sortering
- eksempel flekker
- før du starter prosessen, følgende elementer må hentes og forberedt:
- Gradient media for utarbeidelse av mononukleære celler (GM), 50 mL konisk rør
- 12 x 75 mm flyt rør til farging celler
- Beising buffer: fosfat bufret saltvann (PBS) + 3% fosterets kalv serum (FCS)
- Pipetter < /l Jeg >
- FC blokk og flekker antistoffer (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD biovitenskap). Med denne fluorochrome kombinasjonen er ubetydelig ringvirkninger i andre kanaler, men en annen passende fluorochrome kombinasjon er også mulig.
- Kompensasjon perler (om nødvendig)
- Suspensjon buffer: Hank ' s balansert Salt løsning (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
- Trypan blå og hemocytometer
- Samling rør: noen rike medium med høy serum rør (inneholder 1 mL FCS + 25 mM HEPES) brukes for innsamling av sorterte celler.
- Bein margtransplantasjon eksempel: informert samtykke for benmarg biopsi fra iliaca bølgetopp på baksiden av hip bein er vanligvis nødvendig. Benmarg prøven er holdt i heparinized sprøyter på RT til farging. Følgende protokollen utføres i samsvar med retningslinjene i institusjonen ' s menneskelige forskning etikk for menneskelig velferd.
- Genererer en enkeltcelle suspensjon av benmarg prøven. Legge til 3 mL GM sentrifuge røret. Nøye laget i 4 mL enkeltcelle suspensjon på GM løsningen. Sentrifuger 550 g i 30 min ved 20 ° Celsius (C) (brems er slått av). Tegne av det øvre laget som inneholder plasma og blodplater bruker en steril pipette, forlater mononukleære celle laget uforstyrret på grensesnittet. Overføre laget av mononukleære celler slik sterilt sentrifuge med en bakteriefri pipette.
- Etter vask med 5 mL flekker buffer, resuspend cellene i 2 mL suspensjon buffer og bestemme cellen konsentrasjonen. Sted 5 µL av cellen suspensjon i et reagensrør skrukork. Legge til 95 µL av 0,2% Trypan blå flekken. Bland godt. La stå i 5 minutter ved romtemperatur. Fyll en hemocytometer for celle teller. Under et mikroskop, observere hvis ikke-levedyktige er farget og telle levedyktig celler.
- Sentrifuge cellene på 250 g i 10 min ved 20 ° C, forkaste nedbryting og resuspend cellene i flekker buffer ved en konsentrasjon av opptil 1 x 10 6 per 100 µL.
- Blokk FcR ved bruk av 2,5 µg Fc blokk per 1 x 10 6 celler på 10-15 min. is
- Legg til passende kombinasjon av 10 µg mAb flekken 1 x 10 6 celler og ruge etter 20 min på 4 ° C i mørket, etterfulgt av en vask steg med 3 mL flekker buffer. For riktig kompensasjon, er liten dele cellene (eller helst kompensasjon perler) farget med enkelt antistoffer hver; en aliquot gjenværende unstained kvinne.
- Juster til konsentrasjonen til 20 x 10 6 celler/mL.
- Sett opp og optimalisere cellen sorter. Prosessen med å sette opp en flyt cytometer og programvare er standardisert med en detaljert instruksjoner gitt av selskapet og må utføres av kvalifiserte personell.
- før du starter prosessen, følgende elementer må hentes og forberedt:
- Sortering på cellen sorter
- forberede samling rør fra trinn 1.1.1.9.
- Definere en mal som inneholder en bivariate plan for å vise frem scatter (FSC) og siden xy (SSC).
- Kjøre cellene og justere FSC/SSC å plassere befolkningen rundt på skala
- Ta opp negativ kontroll røret.
- Kjøre enkelt positiv kontroll rør; registrere data for hver rør.
- Beregne kompensasjon manuelt eller automatisk med funksjonen gitt av oppkjøpet.
- Kjøpe eksperimentelle prøven og gate dem på en bivariate FSC/SSC dot tomt ( figur 1A) å inkludere både lymfatisk og myeloide celler. Utelukke doublets og aggregat ved å sammenligne ulike signaler av FSC (dvs., høyde, bredde og området) ( figur 1B). Visualisere singlet cellene på bivariate dot tomten CD45 og CD36 ( figur 1 c). Hendelser positivt for CD45 leukocytter (inkludert deres progenitors), de negative for CD45 og positivt for CD36 er erythroid progenitors. Bruk gating verktøy til å definere CD36 + (hvis ønskelig, disse cellene kan deles i CD36 høy og lav uttrykke celler) og CD45 + celler. Visualisere CD45 + hendelser i en annen dot tomt viser CD34 og SSC. Bruk gating verktøy for å definere CD34 + celler (leukocytter progenitors) og SSC høy celler (myeloide celler på ulike stadier av differensiering).
- Når har blitt bestemt porter, portene kan velges for sortering i eksterne samling rør.
- Fortsett med sortering ved 4 ° C før det nødvendige antallet celler er innhentet
- Utfører en post Sorter analyser for å avgjøre renheten av sorterte celle populasjoner ( figur 1E, 1F).
2. Clonogenic analysen
- forberedelse av reagenser
før du starter prosessen, følgende elementer må samles inn og forberedt:- Pipetter, 100 mm plater
- Trypan blå og hemocytometer
- Rekonstituer menneskelige rekombinant erytropoietin (EPO) på 500 U/mL i sterilt PBS inneholder minst 0,1% menneskelige serum albumin. Del denne løsningen i små dele og holde på 20 ° C å unngå gjentatte fryse-Tin.
- Forberede fullføre Iscove ' s endret Dulbecco ' s Medium (IMDM) med siste konsentrasjoner av 5% FCS, 2 mM glutamin, 100 enheter/mL Penicillin/Streptomycin (PS). Legge til menneskelig rekombinant erytropoietin (EPO) i ulike konsentrasjoner i separate brønner komplett IMDM mediet: 3 enheter EPO/Vel, 6 enheter EPO/godt og 12 EPO enheter/vel (1 x, 2 x, 4 x EPO henholdsvis).
- Utarbeidelse av bein margtransplantasjon celler
- 10 mL av benmarg prøven fortynnet med 20 mL PBS er langsomt lagvis oppå 15 mL tetthet gradert medium i en 50 mL konisk tube, opprettholde klare grensesnitt mellom de to fasene og deg nder sterile forhold. Deretter sentrifuge 15 mL konisk rør 550 x g i 30 min ved romtemperatur (RT) med akselerasjon som 9 og retardasjon som 0 (eller brems av).
- Etter sentrifugering, fjerner grensesnittet til en ny 50 mL tube og legge PBS til et endelig antall 50 mL.
- Etter sentrifugering med 250 g for 10 min på 10 ° C fjerne nedbryting og resuspend cellene i fullstendig IMDM medium på ca 0,5 x 10 6 celler/mL. Ta 10 µL av cellen suspensjon i en microtube, bland med samme volum Trypan blå løsning (0,4%) og telle ved hjelp av en hemocytometer.
- Optional: CD34 + celler er beriket med magnetiske celle sortering med Milteny CD34 perler i henhold til instruksjonene gitt av produksjon. Den største fordelen med dette berikelse trinnet er å oppdage kvaliteten på blodkreft stamceller, som er dyrket på en halvfaste matrise lagt med 50 ng/mL stamcelleforskningen faktor (SCF), 20 ng/mL granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), 20 ng/mL interleukin-3 (IL-3), 20 ng/mL interleukin-6 (IL-6), 20 ng/mL granulocytt koloni-stimulerende faktor (G-CSF) og 3 ulike konsentrasjoner av EPO i 1.4.
- Fortynne cellene til 0,1 - 0,15 x 10 6 mononukleære celler/mL eller 2 x 10 3 CD34 + celler/mL ved å legge til fullstendig IMDM medium supplert med EPO og overføre 300 µL til 3 mL Methocult H4434 medium. Etter agitasjon og en kort inkubasjonstiden for 5 min plate tre ganger 1,1 mL på en 35 mm-rett. To av disse kultur retter sammen med en tredje - fylt med vann - plasseres i 100 mm plater.
- Celler er kultivert i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO 2 i 14 dager.
- Analyse av koloniene
- koloniene er scoret i henhold til deres morfologi med en invertert mikroskopet på 40 X forstørrelse i en kultur parabol merket med et scoring rutenett. I forbindelse med våre analysen, klassifiseres kolonien danner enhetene (CFU) i 4 Kategorier: multipotential progenitor celler (CFU-GEMM), granulocytt-macrophage progenitor celler (CFU-GM), brast danner enhet-erythroid (BFU-E) og colony danner enhet-erythroid (CFU-E). Se produsent ' s instruksjoner for ytterligere koloni subclassification.
- For videre analyse celler fra CFU analysen platen gjenopprettes separat etter 4 kategoriene ved å stenge i 4 mL romtemperatur PBS som inneholder 2% FCS/IMDM. Etter sentrifugering 400 g for 10 min på 4 ° C, cellene er resuspended i PBS telt og behandlet for DNA utvinning.
3. Analyse av Chimerism
- DNA isolasjon
- pellets cellene med sentrifugering 400 g for 10 min.
- Isolere DNA ved hjelp av en blod DNA utvinning kit (QIAmp DNA blod utvinning kit). Forvarm elueringsbufferen (AE) på 37 ° C å forbedre avkastningen av elut DNA.
- Måle DNA konsentrasjonen med Nanodrop ND-1000 spectra fotometer. Eksempler med OD 260/280 mellom 1,8-2,0 brukes for videre analyse.
- Fortynne DNA med DNAase gratis H 2 O til 0,1 ng/µL i et totalt volum på 50 µL.
- STR-analyse
- satt opp PCR reaksjonen av blande reaksjonen blanding, AmplTaq gull DNA Polymerase og Profiler pluss Primer sett med 20 µL genomisk DNA (0,1 ng/µL) i henhold til veiledningen (primer kit inneholder den umerkede primere i buffer for å forsterke STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, og D7S820 og kjønn markør amelogenin). Inkluder nuclease-fritt vann som negativ kontroll og 9947A som positiv. Før transplantasjon DNA fra både giver og mottaker er også inkludert.
- Utføre PCR reaksjon med Eppendorf mastercycler gradering med følgende: 95 ° C i 11 min, 28 forsterkning sykluser av 95 ° C for 1 minutt, 59 ° C for 1 min og 72 ° C i 1 min, etterfulgt av 60° C i 45 min.
- Sett opp fragment analyse reaksjon ved å legge til 12 µL Hi-Di Formamid og 0,5 µL GeneScan 500 ROX størrelse Standard (alle brukt Biosystems) til 1 µL av PCR produkt. På første og siste posisjon en allel stigen (Genotyper Amp Fl STR blå, grønn II og gul, brukt Biosystems) kreves.
- Start geleelektroforese og oppkjøp med geleelektroforese instrumentet.
- Analysere Loci, alleler og topp høyder av prøver og kontroller med programvare 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Separasjon av lymphohematopoietic progenitors av FACS celle sortering
Her viser vi resultatene fra sortering nødvendig celle populasjoner for nedstrøms STR analyse. Bone margtransplantasjon celler var farget med V450-konjugerte anti-CD45, FITC-konjugerte anti-CD36 og APC-konjugerte anti-CD34. Befolkningen av interesse er megakaryocyte erythroid progenitors (MEP), nucleated celler ansvarlig for utviklingen av erytrocytter. Disse cellene express CD36, men er negativt for leukocytter felles antigen CD45 (figur 1 c). Hvis nødvendig, kan disse cellene videre differensieres basert på graden CD36 uttrykk. Flere ekstra befolkninger kan sorteres for å kontroller. Vi sorteres CD45 + CD34 + lymfoide/myelogen prekursorer som et annet stamfar celle befolkningen og CD45 + celler med høy SSC signal som modne myeloide celler (figur 1 d). Sortering ble utført med en BD FACSAria jeg bruke. Etter sortering, erythroid stamfar celle renhet var > 85% (figur 1E) og myelogen celle renhet var > 95% (figur 1F).
Figur 1 . Sortering av Erythroid stamfar celler og Myeloid Progenitor celler etter FACS. Figur 1A/1B viser FSC-A vs SSC-A, FSC-H vs FSC-A og bruk av en gate polygonverktøyet velge befolkningen av interesse. 1 C viser MEP på CD45 vs CD36; 1 D viser modne myeloide celler. Prosentandelen av positiv celler i 1E og 1F vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Generasjon av burst-forming enheter - erythroid kolonier
Noen celler avledet fra benmargen og atskilt med CD34-spesifikke magnetiske perler synes å spre og differensiere. Etter en 14-dagers inkubasjonstid på halvfaste middels koloniene er dannet. Stimulering med ulike konsentrasjoner av EPO utvidet sterkt dannelsen av fremtredende rød (erythroid) kolonier (figur 2).
Figur 2. Generering av en Burst-forming enhet-erythroid (BFU-E). Vist er en representativ lavt strømforbruk photomicrograph av BFU-E kolonien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| MNC: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| CFU-E | 2 | 2 | 2 |
| BFU-E | 9 | 10 | 8 |
| CFU-GM | 30 | 30 | 29 |
| CFU-GEMM | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ celler: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| CFU-E | 1 | 1 | 0 |
| BFU-E | 5 | 11 | 6 |
| CFU-GM | 25 | 26 | 32 |
| CFU-GEMM | 0 | 2 | 3 |
Tabell 1. Analyse av koloniene i usortert bein margtransplantasjon celler og CD34 + merkede celler. Koloniene er scoret i henhold til deres morfologi med en invertert mikroskopet på 40 X forstørrelse i en kultur parabol merket med et scoring rutenett. I forbindelse med våre analysen, koloniene klassifiseres i fire kategorier: colony-forming enhet-erythroid (CFU-E), burst-forming enhet-erythroid (BFU-E), granulocytt-macrophage progenitor celler (CFU-GM) og multipotential progenitor celler (CFU-GEMM).
Analyse av chimerism
Chimerism analyse utføres ved hjelp av AmpFlSTR Profiler pluss Kit (brukt Biosystems, California) i henhold til produsentens protokollen på ABI prisme 310 genetisk Analyzer (brukt Biosystems, California). Analyse utføres med GeneMapper programvare (anvendt Biosystems, California). Loci D21S11, D7S820, FGA og vWA ble brukt til å beregne resultatene (prosent av mottaker - og donor-spesifikke DNA).
| Eksempel | Mottaker DNA | Donor DNA |
| CD45 | 25% | 75% |
| CD36hi | 25% | 75% |
| CD36lo | 55% | 45% |
| CD34 | 25% | 75% |
Tabell 2. Prosent mottakeren og Donor DNA i celler fra fluorescens-aktivert celle sortering av bein margtransplantasjon celler. Chimerism av donor cellene i bestemte mobilnettet linjene av lymphohematopoietic kupé er gitt.
| Eksempel | Mottaker DNA | Donor DNA |
| BM-MNC | 24.71% | 75.29% |
| BM-CD34 |
Tabell 3. Prosent mottakeren og Donor DNA i celler fra Clonogenic analysen. Chimerism av donor cellene i bestemte mobilnettet linjene av lymphohematopoietic kupé er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne studien er å gi publikum en kombinasjon av disse metodene for analysere donor/mottaker chimerism i erythroid progenitors etter HSCT i pasienter behandlet for hemoglobinopathies: 1.) fluorescens-aktivert celle sortering blodkreft stamfar celler i benmargen prøver etterfulgt av analyse av kort tandem gjentar og 2.) Colony-forming enheten vokser beinmargen celleområde, klassifisering av koloniene i ulike stamfar etterfulgt av analyse av kort tandem gjentakelser. Nyheten av denne tilnærmingen ligger i å kombinere teknikkene i en protokoll for å evaluere donor/mottaker chimerism i enkelte koloniene.
Bestemt betydningen av denne tilnærmingen kan finnes i sammenheng med blandet chimerism etter HSCT for pasienter behandlet for hemoglobinopathies. Flere studier har vist at en betydelig andel av pasienter uttrykke en lav prosentandel av donor myeloide celler som samsvarer med at av erythroid forløper celler und gir langvarig stabil blandet blodkreft chimerism3, 11; i kontrast i samme pasientene en høy andel av donor-avledet røde blodlegemer (2 og 5 ganger høyere enn eldre leukocytter) er bemerket og foreslår at den ineffektive erythropoiesis finner sted på et senere stadium av erythroid utvikling. Disse observasjonene har blitt tilskrevet tilbøyelighet for akselerert apoptose i donor erythroblasts og utholdenhet av T- og B gjenværende lymfocytter ansvarlig for at en blandet allograft14-15. I sammenheng med immunomodulation etter blodkreft stilk cellen transplantasjon vi nylig viste at endring av suppressive terapi etter blodkreft transplantasjon for ß-talassemi resultater i en selektiv fordel for det genetisk-korrigert erythroid-rommet, gi en 2 - til 2.5 ganger forsterkning av rester donor stammen celler12. Denne observasjonen støtter verktøyet å bestemme donor-versus-gjenværende erythroid progenitors, som det gir en forståelse av dette fenomenet og støtter fremtidige kliniske studier studere genterapi for behandling av hemoglobinopathies. Faktisk, kan andelen av genet endret kjerne celler for å oppnå en terapeutisk sirkulerende røde blod celler være samme som observert hos pasienter behandlet med stilk cellen transplantasjon for hemoglobinopathies.
For å finne ut hele bildet av donor erythropoiesis vi endret protokollen og gi en detaljert, trinnvis eksperimentelle tilnærming. Det kritiske trinnet i denne protokollen er prosessen med å sette opp en flyt cytometer og programvare som er standardisert med detaljerte instruksjoner og må utføres av kvalifiserte personell. Presentasjon av våre protokollen visualisert format lar publikum til å følge våre protokollen enkelt. Vi sammenlignet PCR resultatene ved hjelp av genomisk DNA fra erythroid progenitors fra colony-forming enheter i BM prøver versus DNA innhentet fra FACS-sortert erythroid benmarg progenitors. Giveren engraftment dataene fra disse metodene er i utgangspunktet konsekvent. Men vanligvis mindre variasjon ble funnet i utvalg fra colony-forming enheter. Dette er sannsynligvis på grunn av de bedre donor røde blodlegemer forløpere i i vitro analysen sammenlignet med ubehandlet og sortert donor kolleger. I dette lys, kan denne protokollen utvides ved kunstig å lage blandede chimeric kombinasjoner med kjente andelen sunn progenitors og progenitors av en rekke pasienter med ulike hemoglobinopathies. Clonogenic analyse og vurdering av chimerism bør gjenspeile i sette proporsjoner.
Selv om en presis forståelse for mekanismene som er involvert i fengselsmiljøet mangler, er metoden som presenteres her av avgjørende betydning for å gi relevant informasjon for rutinemessig overvåking av engraftment og prognostiske informasjon i klinisk praksis. Forsøk på å redde pode funksjonen begrenses av risikoen for å utvikle graft - versus - host sykdom og kan bli guidet av føljetong engraftment overvåking. Til slutt, kan denne metoden gir også nyttig grunnlag for forskningsområder forpliktet til å forbedre omsorg for pasienter med hemoglobinopathies, spesielt de som rammes av akutt graft - versus - host sykdom og autoimmune sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
