Summary
여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.
Abstract
RNA 결합 단백질 (RBP)은 RNA의 운명을 결정합니다. 그들은 모든 RNA 생합성 경로에 참여하며 특히 mRNA (messenger RNAs)의 전사 후 유전자 조절 (post-transcriptional gene regulation, PTGR)에 기여합니다. 지난 몇 년 동안, 효모 및 포유류 세포주의 많은 mRNA 결합 단백질은 mRNA 결합 단백질 (mRBPs)의 동정을 가능케하는 "mRNA 상호 작용 체 포획 (interaction)"이라는 새로운 방법의 사용을 통해 성공적으로 분리되었다. 생리적 인 환경에서 직접적으로. 이 방법은 올리고 (dT) 비드에 의한 메신저 리보 뉴클레오타이드 복합체 (mRNP)의 생체 내 자외선 (UV) 가교 결합, 풀다운 및 정제, 및 질량 분석기 (MS)에 의한 가교 결합 단백질의 후속 확인으로 구성된다. 아주 최근에 같은 방법을 적용하여 여러 가지 식물 mRNA 결합 프로테옴이 다른 Arabidopsis 조직 공급원에서 동시에보고되었다 : 뿌리 뽑힌 묘목, 잎 조직,엽초 엽 모세포 및 배양 된 뿌리 세포를 포함한다. 여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형질에 대한 최적화 된 mRNA 인터랙티브 캡쳐 방법을 제시하는데, 이는 다양한 세포 분석을 포함하는 실험을위한 다용도 도구의 역할을하는 세포 유형이다. 최적의 단백질 수율을위한 조건에는 조직의 시작과 UV 조사 시간이 포함됩니다. 중간 규모 실험 (10 7 세포)에서 얻은 mRNA 결합 프로테옴에서 RNA 결합 능력을 가진 RBP가 과다하게 나타 났으며 많은 새로운 RBP가 확인되었다. 실험을 확대 (10 9 세포) 할 수 있으며 최적화 된 방법을 다른 식물 세포 유형 및 종에 적용하여 식물에서 mRNA 결합 단백질을 광범위하게 분리, 분류 및 비교할 수 있습니다.
Introduction
진핵 생물은 세포 생물학적 과정을 유지하기 위해 다중 RNA 생합성 조절 경로를 사용합니다. 알려진 종류의 RNA 중에서 mRNA는 매우 다양하며 단백질과 그 이소 형의 코딩 용량을 가지고 있습니다 1. PTGR 경로는 pre-mRNA 2 , 3 의 운명을 지시합니다. 서로 다른 유전자 군의 RBP가 RNA의 조절을 조절하고, PTGR에서는 특정 mRBP가 기능적 mRNP를 형성하는 직접적인 물리적 상호 작용을 통해 mRNA를 유도합니다. 따라서, 식별 및 mRBPs의 특성과 mRNPs 것은 지난 30 년 .Over 세포의 mRNA 대사 2의 규정을 이해하는 데 중요하다, 다양한 시험 관내 방법 - RNA 전기 영동 이동성의 변화 (REMSA) 분석, 지수 농축 분석에 의한 리간드의 체계적 발전을 포함하여 (RBNS), 방사성 표지 또는 정량 분석 (RNA Bind-n-Seq, RBNS)형광 RNA 결합 분석, X 선 결정학 및 NMR 분광법은 4, 5, 6, 7, 8, 9 - 널리 주로 포유 동물 세포에서 RBPs 연구에 적용되어왔다. 포유류 RBP에 대한 이러한 연구의 결과는 RNA-binding Protein DataBase (RBPDB)를 통해 검색 할 수 있으며, 이는 공개 된 관측치 10 을 수집합니다.
이러한 in vitro 접근법은 강력한 도구이지만 주어진 RNA 풀 시퀀스로부터 결합 된 RNA 모티프를 결정하므로 새로운 표적 RNA를 발견 할 수있는 능력이 제한적입니다. 계산 전략은 단백질 서열의 보존을 기반으로 게놈 전체의 RBPs을 예측하고 (15)를 구성하는 마찬가지입니다. 이를 극복하기 위해 새로운 실험 방법 인 ha이는 관심의 RBP가 상호 작용하는 RNA 모티프의 식별 및 결합의 정확한 위치 결정을 가능하게합니다. "crosslinking and immunoprecipitation"(CLIP)이라고 불리는이 방법 은 생체 내 UV 가교 결합 후 면역 침전 11로 구성 됩니다. 초기 연구에 따르면 245 nm보다 큰 자외선 파장에서 DNA 및 RNA 뉴클레오티드의 광 활성화가 발생할 수 있습니다. 티미 딘을 통한 반응이 선호되는 것으로 보인다 (광 반응성 감소 순서 : dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) 12 . 파장이 254 nm (UV-C) 인 UV 광을 사용하여 단 몇 옹스트롬 (Å) 범위에서 RNA 뉴클레오타이드와 단백질 잔기 사이의 공유 결합이 생성되는 것으로 관찰되었습니다. 따라서이 현상을 RNA와 RBP의 "zero-length"가교라고합니다. 이것은 엄격한 정화 과정 배경이 거의없는 채약 13 , 14 .
CLIP에 보완적인 전략은 RBP의 풍경을 기술하기 위해 단백질 확인과 생체 내 UV 교차 결합을 결합하는 것입니다. 이러한 게놈 전체 mRNA에 결합 된 프로테옴의 수는, "mRNA의 상호 작용 체 캡처"(18)라고, 효모 세포, 배아 줄기 세포 (는 ESC),이 새로운 실험 방법을 사용하여 인간의 세포 라인 (즉, HEK293와 헬라)에서 분리 된 19 , 20 , 21 . 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합과 mRNP 정제 및 MS 기반 프로테오믹스로 구성됩니다. 이 전략을 적용함으로써, 비표준 RBD를 포함하는 많은 새로운 "달빛"RBP가 발견되었고, 더 많은 단백질이 이전에 상상했던 것보다 RNA 결합 능력을 가지고 있음이 분명 해졌다"> 15, 16, 17.이 방법의 사용은 새로운 애플리케이션과 RBPs을 조사 할 때 새로운 생물학적 질문에 대답 할 수있는 기능을 허용합니다. 예를 들어, 최근의 연구는 mRNA에 결합 된 프로테옴 (핵심 RBP의 보존을 조사하고있다 proteome) 22 .
식물 RBP는 이미 성장과 발달에 관여하고있다 ( 예 : 개화시기의 후 전사 조절, 24 시간주기, 미토콘드리아와 엽록체의 유전자 발현) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . 또한, 그들은 비 생물 적 스트레스에 반응하는 세포 과정에서 기능을 수행하는 것으로 생각된다 ( 예, 감기, 가뭄, salinity 및 abscisic acid (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . RNA 인식 모티프 (RRM) 및 K 상 동성 (KH) 도메인 서열 모티프에 기초하여 애기 장대 게놈에 200 개 이상의 예측 된 RBP 유전자가 존재하며; 쌀에는 대략 250 개가 35 , 36 으로 기록되어있다. 예상되는 많은 RBP가 식물에만 고유 한 것으로 여겨지는 것은 주목할 만하다. ( 예를 들어, RRM 도메인을 포함하는 예측 된 Arabidopsis RBP의 약 50 %에 걸친 metazoan ortholog는 없다) 35) , 이는 많은 사람들이 새로운 기능을 수행 할 수 있음을 시사한다. 대부분의 예측 RBPs의 기능은 23지지 않은 남아있다.
Arabidopsis 에서 발현 된 mRNA- 결합 된 프로테옴의 분리는 모종, 잎 조직, 배양 된 뿌리 세포 및 잎의 엽초 원형질체를mRNA의 상호 작용 체 캡처은 최근 39 (38)보고되었다. 이 연구는 가까운 장래에 식물에서 기능적 RBP를 체계적으로 목록화할 강력한 가능성을 보여줍니다. 여기, 우리는 식물 protoplasts ( 즉, 세포 벽이없는 세포)에서 mRNA interactome 캡처에 대한 프로토콜을 제시한다. Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형 엽 세포는 잎 세포의 주요 유형이다. 분리 된 원형질체는 세포에 자외선을 최적으로 닿게합니다. 이 세포 유형은 기능적 특성을 위해 단백질을 일시적으로 발현하는 분석법에서 사용할 수 있습니다 40 , 41 . 또한 protoplasting 다른 여러 식물 세포 종류 및 종을 42, 43, 44에 적용되어왔다 (., Bargmann 바움 및 2010; 예를 들어, 피터슨 등, 2009 년 홍콩 등, 2012)..
<p class = "jove_content">이 방법은 총 11 단계 ( 그림 1A )를 포함합니다. Arabidopsis 엽초 엽 원형체를 먼저 단리하고 (단계 1) UV 조사를하여 가교 결합 된 mRNP를 형성한다 (단계 2). 원형질체가 변성 조건 (단계 3) 하에서 용해 될 때, 가교 결합 된 mRNP는 용해 / 결합 완충액에서 방출되고 oligo-d (T) 25 비드에 의해 당겨진다 (단계 4). 몇 차례의 엄격한 세척 후에, mRNP를 정제하고 추가로 분석한다. mRBPs의 변성 펩티드는 가교 결합 mRNA가 정제되기 전에 프로 테이나 제 K에 의해 분해되고 RNA 품질은 qRT-PCR (단계 5 및 6)에 의해 검증된다. RNase 처리 및 단백질 농도 (단계 7) 후에, 단백질 품질은 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 및은 염색 (단계 8)에 의해 조절된다. 단백질 밴드 패턴의 차이점은 가교 샘플 (CL)과 비가 교 샘플 (non-crosslinked sample) 사이에서 쉽게 시각화 될 수 있습니다.UV 조사를받지 않은 원형질체로부터의 음성 대조군 샘플). 단백질의 확인은 MS 기반 프로테오믹스를 통해 이루어집니다. CL 샘플의 단백질은 1 차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (1D-PAGE)으로 분리되어 가능한 배경 오염을 제거하고, 트립신을 사용하여 짧은 펩타이드로 "in-gel digestion"되고 정제됩니다 (9 단계). 질량 분광기 (nano-LC-MS)에 결합 된 나노 역상 액체 크로마토 그래피는 mRNA- 결합 프로테옴에서 결정적인 단백질의 양을 결정할 수있게합니다 (단계 10). 마지막으로, 확인 된 mRBPs는 생물 정보학 분석을 사용하여 특성화되고 목록 화됩니다 (11 단계).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arabidopsis Leaf Mesophyll 원형질체 단리
참고 : 유 등의 알에 의해 설명 된 애기 장대 잎의 엽육의 원형질체는 기본적으로 격리되어, 2007, 몇 가지 수정 (40)..
- 식물의 성장
- 성층화를 위해 어둠 속에서 4 ℃에서 2 일 동안 약 200 개의 애기 장대 Col-0 에코 타입 종자를 멸균 수에 담근다.
참고 :이 시드 수는 비 CL 샘플과 CL 샘플 하나에 충분합니다 (1.3 단계 참조). - 토양과 질석의 50 % ( v / v ) 혼합물로 냄비를 준비하고 쟁반에 증류수로 냄비를 담가 토양을 적시십시오.
- 젖은 토양에 뿌려 씨를 뿌리십시오. Arabidopsis 종자가 발아를 위해 빛을 필요로하기 때문에 추가 토양으로 씨앗을 덮지 마십시오.
참고 : 식물 성장 조건은 23 ° C에서 12 시간 밝기 / 12 시간 암주기이며,개화하기 전에 5 주 동안 성장 실에서 100 μmol m -2 s -1 의 광도를 갖는. 4 주된 식물도 사용할 수 있습니다 40 .
참고 : 1.2.1에서 3.2.3 단계의 설명 된 모든 재료와 시약은 2 개의 시료 ( 즉, 1 개의 비 CL 시료 (UV-C 조사를받지 않은 대조 시료)와 1 개의 CL 시료 (연구 UV-C 조사를받는 샘플)).
- 성층화를 위해 어둠 속에서 4 ℃에서 2 일 동안 약 200 개의 애기 장대 Col-0 에코 타입 종자를 멸균 수에 담근다.
- 등장 성 효소 용액의 제조
- 1 차 등장액 효소 용액 (400 mM 만니톨, 20 mM KCl 및 20 mM MES 완충액 (pH 5.7)) 80 mL를 만들어 즉시 10 분 동안 60 ° C 배양기에서 용액을 가열한다.
- 따뜻한 1 차 등장액에 Cellulase R10 ( w / v 1.5 %) 1.2 g과 Macerozyme R10 ( w / v 0.4 %) 분말 0.32 g을 넣는다.
- 부드럽게 저어 준 효소 분말을 조심스럽게 용액에 넣습니다. 랩10 분 동안 60 ° C 배양기에서 용액을 가열하고 효소 용액이 깨끗한 밝은 갈색이 될 때까지 기다리십시오.
- 얼음에서 3 분 동안 용액을 냉각시키고 1 M CaCl 2 800 μL와 10 % ( w / v ) BSA 800 μL를 용액에 첨가한다.
- 0.22 μm 필터를 통해 피펫 팅하고 필터링하여 용액을 균질화하십시오. 두 개의 대규모 페트리 접시 (150mm x 20mm)에이 최종 등장액 효소 용액을 분액합니다.
- 애기 장대 장미 잎 줄기의 제조
참고 : 각 페트리 접시 150 잎은 비 CL 샘플 또는 CL 샘플 하나에 권장됩니다.- 새롭고 날카로운 면도날을 사용하여 완전히 확장 된 두 번째 또는 세 번째 진정한 잎 (평균 : 장미 당 3 ~ 4)을 0.5 ~ 1mm 잎 스트립으로 선택하여 잘라냅니다.
- isotonic 효소 솔루션에 즉시 스트립을 전송하고 잠수함.
참고 : 빛에 닿지 않도록 항상 덮개를 덮으십시오그는 알루미늄 박과 페트리 접시. 나뭇잎을 부수 지 마십시오. 모든 스트립이 용액에 잠기고 표면에 떠 다니지 않았는지 확인하십시오.
- Arabidopsis 엽초 엽 원형체의 분리
- 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시를 진공 데시 케이 터에 넣고 30 분 동안 진공하에 리프 스트립에 침투시킵니다. 그 후, 실온에서 2.5 시간 동안 흔들지 않고 어둠 속에서 페트리 접시를 품어 라.
- 부드럽게 그리고 간략하게 접시를 수평으로 손으로 흔들어, 원형질체를 효소 용액으로 완전히 방출하려고 시도한다.
- 원형질 수확 및 계수
- 35 ~ 75 μm 나일론 메쉬를 통해 원형질체 현탁액을 걸러냅니다. 각 시료의 여액을 두 개의 50 mL 둥근 바닥 튜브 (각 튜브에 약 20 mL의 여액)에 나누어줍니다.
- 각 페트리 접시를 10 ML의 W5 버퍼 (154 MM NaCl, 125 MM CaCl
- 총 4 개의 튜브를 100 xg에서 5 분간 회전시켜 원형질체를 펠렛으로 만든다. 뜨는을 삭제하고 부드럽게 W5 버퍼 10 ML와 각 튜브에 원형질체 알약을 resuspend.
참고 : 원형질체 펠릿을 재현 할 때, 튜브를 거꾸로 뒤집어서 펠렛이 사라질 때까지 손으로 부드럽게 돌리십시오. 셀을 손상시키지 않도록 직접 펠렛을 피펫하지 마십시오.- 1.5.3 단계를 한 번 반복하고 각 샘플의 두 개의 튜브에있는 원형질체 현탁액을 하나의 50-mL 둥근 바닥 튜브와 결합시킵니다. 얼음에 튜브를 보관하십시오.
- hemocytometer를 사용하여 원형질체를 계산합니다.
참고 : 25 큐브 내의 각 20 세포는 2 x 10 5 protoplasts / mL와 같습니다. 150 잎은 대략 1 x 10 7 세포를 산출해야한다.non-CL 및 CL 샘플에서 동일한 총 원형질 수를 갖도록 조절하십시오.- 30 분 동안 얼음 위에 원형질을 보관하십시오. 그 후, 100 x g에서 5 분 동안 튜브를 회전시킵니다. 뜨는을 삭제하고 MMg 솔루션 (400 MM 만니톨, 15 MM MgCl 2 및 4 MM MES 버퍼 (산도 5.7)) 20 ML와 각 튜브에 protoplasts을 resuspend.
- 총 4 개의 튜브를 100 xg에서 5 분간 회전시켜 원형질체를 펠렛으로 만든다. 뜨는을 삭제하고 부드럽게 W5 버퍼 10 ML와 각 튜브에 원형질체 알약을 resuspend.
2. UV 조사에 의한 Vivo mRNA- 단백질 가교
참고 : 비 CL 샘플 튜브는 얼음에 보관하십시오. CL 샘플은 즉시 자외선을 조사해야합니다.
- CL 샘플 튜브에서 1 x 10 7 셀을 포함하는 원형질체 현탁액을 새로운 대형 페트리 접시 (150mm x 20mm)로 옮기고 플레이트 표면을 덮기 위해 30ml의 빙냉 MMg 용액을 첨가합니다. 부드럽게 pipetting하여 전체 MMg 버퍼에있는 세포를 확산. 즉시 UV 가교 장치에 상단 덮개없이 페트리 접시를 놓습니다.
참고 : UV 램프 사이의 높이페트리 접시는 8cm입니다. - 1 분, 3 분 또는 5 분 동안 254 nm 파장 자외선 및 0.00875 W / cm 2 자외선 강도로 샘플을 조사하십시오. 방사선 조사 후, 원형질체 현탁액을 2 개의 새로운 50 mL 둥근 바닥 튜브로 신속하게 나누어줍니다. 접시의 바닥을 씻어서 얼음처럼 차가운 MMg 용액 5mL를 추가하여 원형질체의 나머지를 모으고이 두 개의 튜브에이 세포 현탁액을 첨가합니다.
참고 : 1 분이 최적 조건으로 선택되었습니다. 설명은 대표 결과 에서 찾을 수 있습니다.
3. 변성 조건 하에서의 원형질체 용해
- 용해 용 원형질체 펠렛의 제조
- 2 분의 2 CL 샘플 튜브와 함께 non-CL 샘플 튜브를 100 xg에서 5 분간 스핀하고 상등액을 버립니다. 비 CL 샘플 원형질 펠릿의 튜브를 얼음에 다시 놓습니다.
- 각 CL 시료 튜브에 ice-cold MMg 용액 10 mL를 넣는다.펠릿을 다시 걸러 내고 다시 50 mL 둥근 바닥 튜브에 넣으십시오. 튜브를 100xg에서 5 분간 회전시킵니다. 상등액을 제거한 후 CL 샘플 튜브 원형질체 펠렛을 얼음에 보관하십시오.
- 원형질체 용해 및 원형질체 용 해물 균질화
- 빙냉 용해 / 결합 완충액 (500mM LiCl, 0.5 % ( w / v ) 리튬 도데 실 설페이트 (LiDS), 5mM 디티 오 트레이 톨 (DTT), 20mM 트리스 -HCl (pH 7.5) 및 1mM EDTA (pH 8.0))를 각 샘플의 세포 펠릿에 첨가 하였다. 현탁액이 균일하게 밝은 녹색이 될 때까지 대략 20 회 위 / 아래로 pipetting하여 원형질체를 대략 녹여 라.
- 균질화를위한 좁은 바늘 (0.9 x 25mm 2 ) 50 ML 유리 주사기를 통해 protoplast의 lysate 두 번 통과하십시오. 얼음에 lysate를 10 분 동안 품어 낸다. 액체 질소로 lysate를 동결시키고 -80 ° C에서 최대 3 주 동안 보관하십시오.
4. mRNP 풀다운 및 정제Oligo-d (T) 25 개의 비즈
참고 : 다음의 설명 된 모든 재료 및 시약은 단계 4.1에서 단계 4.4까지 하나의 샘플 ( 즉, CL이 아닌 샘플 또는 CL 샘플)에 대해서만 사용됩니다. 비드 상청액 용해 / 결합 완충액을 버린 후에는 원형질체 용 해물을 비드가 들어있는 튜브에 즉시 첨가해야합니다.
- 올리고 (dT) 캡쳐를위한 올리고 -d (T) 25 자성 비드의 제조
- 냉동 된 원형질체 용해 액을 실온에서 해동. lysate가 완전히 녹을 때, lysate 튜브를 얼음 위에 놓아 둔다.
- 얼음에 6 개의 새로운 2 mL 둥근 바닥 미세 원심 분리 튜브에 oligo-d (T) 25 자석 비드 (5 mg / mL)를 나누어줍니다. 각 튜브에서 600 μl의 용해 / 결합 완충액으로 비드 현탁액을 부드럽게 씻고 4 분 동안 부드럽게 4 분 동안 위아래로 pipetting하여 pipetting하십시오. 구슬을 얼음에 붙이십시오.
- 제본
- 장소구슬을 자기 캡쳐하고 현탁액을 제거하는 3 분 동안 4 ° C의 자기 랙에 구슬을 담은 6 개 튜브.
참고 : 튜브를 자성 선반에 넣을 때 구슬이 완전히 포착 될 때까지 기다리십시오. 최소 3 분이 걸립니다. - 상등액을 버리고이 6 개 튜브에 즉시 프로토 박스트 용 해물 9 mL를 나누어 준다. 균질 갈색 현탁액이 나타날 때까지 pipetting하여 잘 섞어 부드러운 회전을 적용하여 1 시간 4 ° C에서 원형질체 용 해물에있는 비즈를 품어.
참고 : 30 분에서 1 시간까지의 배양 시간을 권장합니다.
- 장소구슬을 자기 캡쳐하고 현탁액을 제거하는 3 분 동안 4 ° C의 자기 랙에 구슬을 담은 6 개 튜브.
- 세탁
- 3 분 동안 4 ° C에서 자기 랙에 튜브를 다시 놓습니다. 모든 구슬이 튜브의 측면에 캡처되면 6 개의 새로운 2 ML 둥근 바닥 microcentrifuge 튜브에 protoplast의 lysate를 수집하고 일시적으로 4 ° C에 저장하십시오. protoplast lysate를 즉시 폐기하지 마십시오. lysate 유지4 ° C.
- 구슬에 빙냉 완충액 1 (500mM LiCl, 0.1 % ( w / v ) LiDS, 5mM DTT, 20mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 1mM EDTA (pH 8.0)) 1.5mL를 첨가한다. 각 튜브에. 구슬을 Resuspend하고 1 분 부드러운 회전을 적용합니다. 3 분 동안 4 ° C에서 자기 랙에 튜브를 다시 놓고 뜨는 폐기하십시오. 세척 버퍼로이 세척 단계를 한 번 반복하십시오.
- 얼음 세척 버퍼 2 (500 MM LiCl, 5 MM DTT, 20 MM 트리스 - HCl (pH 7.5) 및 1 MM EDTA (pH 8.0)) 1.5 ML을 사용 하여이 세척 단계의 동일한 절차를 두 번 반복하고 얼음 - 차가운 저염 완충액 (200mM LiCl, 20mM 트리스 -HCl (pH 7.5) 및 1mM EDTA (pH 8.0)) 1.5mL.
참고 : mRNPs가 protoplast lysate에서 효율적으로 분리 된 경우 세척 버퍼 2 ( 그림 1B )로 세척하는 단계에서 CL 샘플의 비드 펠렛 주변에 "후광"이 보이게됩니다.
- 용출
- 500 μL 추가용출 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 1 mM EDTA (pH 8.0))을 각 튜브 내의 비드에 첨가 하였다. 부드럽게 구슬을 resuspend하고 poly (A) -tailed RNAs를 공개하기 위해 3 분 50 ° C에서 품어. 부드럽게 pipetting하여 구슬을 resuspend. 5 분 동안 4 ° C에서 자기 랙에 튜브를 다시 놓습니다.
- 모든 용리액 (총 약 3 mL)을 깨끗하고 멸균 된 RNase가없는 15 mL 원뿔형 바닥 튜브에 옮기고 혼합하십시오.
참고 : RNA의 품질과 양은 분광 광도계 장치를 사용하여 즉시 결정할 수 있습니다.
참고 : 각 시료의 RNA 농도는 약 10 ng / μL이며 A 260 / A 280 비율은 1.9입니다. 단리 된 폴리 (A) -tailed RNA는 일반적으로 70 % 이상의 순도를 갖기 때문에 A 260 / A 280의 비율은 1.6과 2.0 사이 여야합니다. RNA 농도가 너무 낮 으면 시작 원형질 세포의 수를 최대 10 9 개로 늘립니다. 견본액체 질소에서 얼려 장기 보관을 위해 80 ° C에서 보관할 수 있습니다. - 추가 2 라운드에 대해 4.2 단계에서 4.4 단계를 반복하고 oligo - d (T) 25 구슬을 다시 사용하여 원형질체 용 해물에서 poly (A) -tailed RNA를 고갈시킵니다.
참고 : 3 회의 풀다운 절차 후, 각각의 non-CL 또는 CL 샘플에 대해 총 9 mL의 용리액이 있어야합니다. RNA 분해를 피하기 위해 4 ° C에서 모든 작업을 수행하십시오. 구슬을 재사용 또는 재생하려면 4.5 또는 4.6 단계를 수행하십시오.
- 재사용 된 올리고 -d (T) 25 비드의 제조
- 얼음 - 차가운 용리 완충액 1 ML과 빙냉 용해 / 바인딩 버퍼 1 ML와 비즈를 두 번 씻어 500 ML에 다시 소금 LiCl 농도를 조정합니다.
- 4.1 단계를 따르고, 상등액을 버리고, 각 튜브에 저장된 원형질체 용해 액을 옮기고, 4.2 단계에서 4.4 단계까지의 모든 과정을 2 회 더 반복하십시오.
참고 : 구슬을 저장하여 다른 실험에 사용할 수 있습니다 (최대 재사용 횟수는 3 회).- 4.4 단계에 따라 0.1 M NaOH 1 mL를 넣고 5 분 동안 실온에서 회전하여 배양한다. 각 튜브에 대해 1 mL의 세척 완충액 1으로 2 회 세척하고 평형을 위해 0.1 % Tween-20이 포함 된 1x PBS (pH 7.4)로 3 회 세척합니다. 4 ℃에서 0.1 % Tween-20을 함유하는 무균 RNase-free 1x PBS (pH 7.4) 300 μL로 각 튜브의 비드를 보관하십시오.
참고 :이 실험에서 Arabidopsis CL 샘플에 사용 된 비즈는 다음 번에 동일한 식물 샘플에만 사용할 수 있습니다.
- 4.4 단계에 따라 0.1 M NaOH 1 mL를 넣고 5 분 동안 실온에서 회전하여 배양한다. 각 튜브에 대해 1 mL의 세척 완충액 1으로 2 회 세척하고 평형을 위해 0.1 % Tween-20이 포함 된 1x PBS (pH 7.4)로 3 회 세척합니다. 4 ℃에서 0.1 % Tween-20을 함유하는 무균 RNase-free 1x PBS (pH 7.4) 300 μL로 각 튜브의 비드를 보관하십시오.
5. 단백질 분해 효소 K 처리 및 mRNA 정제
- 프로 테이나 제 K 처리
- 자외선 가교 단백질을 소화하기 위해 각 시료의 용리액 1 mL에 8 μL의 Proteinase K 용액 (2 μg / μL)을 첨가합니다. Br등불 소용돌이.
- mRNA 정제
- 용리액을 37 ° C에서 1 시간 동안 인큐베이션하십시오. 잔류 오염물을 제거하기 위해 RNA 정제 키트를 사용하여 RNA를 정제하십시오.
참고 : 정제 후 RNA는 qRT-PCR 분석을 사용하여 RNA 품질 검사를 할 준비가됩니다.
참고 : RNA mini kit 및 TRIzol 시약과 같은 다른 키트도 사용할 수 있습니다 14 .
- 용리액을 37 ° C에서 1 시간 동안 인큐베이션하십시오. 잔류 오염물을 제거하기 위해 RNA 정제 키트를 사용하여 RNA를 정제하십시오.
6. qRT-PCR 분석
- 역전사
- 1 μg의 RNA를 주형으로하여 역전사 시스템을 사용하여 1 차 cDNA의 효율적인 합성을 달성하십시오. 시료를 nuclease가없는 물로 5 ng / μL로 희석하십시오.
- qRT-PCR을 이용한 cDNA 정량
- 주형으로 cDNA의 10 NG와 qPCR 마스터 믹스 및 실시간 PCR cycler를 사용하여 cDNA를 증폭하고 계량. 다음 PCR 프로그램을 사용하십시오 : 95 ° C에서 10 분(1 단계, 1주기) 및 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 1 분 (2 단계, 40주기).
참고 : 여기에 사용 된 참조 유전자는 내인성 내부 통제 유전자 인 UBQ10 (AT4G05320)입니다. UBQ10 및 18S rRNA에 대한 qRT-PCR 프라이머는 Li 등 , 2014 및 Durut 등 , 2014, 45 및 46에 기재되어있다 . Primer sequence는 Material Table에 나열되어 있습니다.
- 주형으로 cDNA의 10 NG와 qPCR 마스터 믹스 및 실시간 PCR cycler를 사용하여 cDNA를 증폭하고 계량. 다음 PCR 프로그램을 사용하십시오 : 95 ° C에서 10 분(1 단계, 1주기) 및 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 1 분 (2 단계, 40주기).
7. RNase 처리 및 mRBP 농도
- RNase 처리
- RNase A와 RNase T1을 함유 한 RNase 칵테일을 약 100 U의 용리액 8 mL에 넣으십시오. 용리액을 nuclease가없는 물로 대체 한 RNase 칵테일이 포함 된 음성 대조 시료를 포함시킵니다. 간단히 보텍스하고 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
- mRBP 농도
- RNase 분해 후, 용리액을 농축하십시오g 원심 분리 필터 장치. 최종 부피는 75 μL이며, 총 단백질 수율은 농축 후 각 시료 약 2 μg입니다. 장기 보존을 위해 샘플을 -80 ° C에 두십시오.
8. SDS-PAGE 및은 염색
- SDS-PAGE
- 25 μL의 농축 된 용리액 (CL 샘플) 또는 대조 샘플 (비 CL 샘플)을 2 x loading dye 15 μL와 섞으십시오. 샘플을 95 ° C에서 5 분간 가열하고 단백질 마커를 포함하여 5 % 스태킹 겔과 12 % 분해 겔이 들어있는 SDS-PAGE 젤에 넣습니다.
- 단백질을 60V에서 40 분간 압축하고 약 1 시간 동안 160V에서 분리 염료가 분해 겔의 끝에 도달 할 때까지 분리합니다.
- 은 염색법
- 매회 5 분 동안 초순수로 SDS-PAGE 젤을 두 번 씻으십시오. 상업 실버 은색 얼룩 키트를 사용하여 단백질의 은색 얼룩을 수행합니다.
참고 : 단백질 밴드는 5 분 이내에 보여 져야합니다. 밴드가 매우 밝은 색으로 5 분을 넘어서 보일 경우 시작 원형질의 수를 최대 10 9 개까지 늘리는 것이 좋습니다.
- 매회 5 분 동안 초순수로 SDS-PAGE 젤을 두 번 씻으십시오. 상업 실버 은색 얼룩 키트를 사용하여 단백질의 은색 얼룩을 수행합니다.
9. 트립신 다이 제스트 단백질 밴드 및 펩타이드 정제
- 트립신 소화
참고 : mRBP 식별을 위해 각 샘플에서 농축 된 mRBP 용액을 25 μL 취하여 두 번째 1D-PAGE 젤을 실행하십시오. 실버 스테인드 젤은 MS 분석과 호환되지 않기 때문에 사용할 수 없습니다.- 1D - PAGE 젤을 실행 후, 고정 솔루션 (50 % ( V / V ) 메탄올과 10 % ( V / V ) 아세트산)에 겔을 1 시간 동안 고정하십시오. 부드럽게 흔들어 얼룩 용액 (0.1 % ( w / v ) Coomassie Brilliant Blue R-250, 50 % ( v / v ) 메탄올 및 10 % ( v / v ) 아세트산)에서 20 분 동안 젤을 염색하십시오. 탈염 용액 (40 % ( v / v ) 메탄올 및 10 % ( v)/ v) 아세트산)로 1 시간 동안 처리 하였다. 폐기 후 젤을 5 % ( v / v ) 아세트산에 보관하십시오.
참고 : 삭제 중에는 배경이 완전히 소멸 될 때까지 새로운 destain 솔루션을 교체 할 수 있습니다. - 관심있는 밴드를 젤 밖으로 잘라냅니다. 이어지는 최적의 트립신 소화 및 펩타이드 추출을 위해 밴드를 약 1 mm 3 조각으로 더 잘라냅니다. 10 분 동안 100 MM 암모늄 중탄산염 (NH 4 HCO 3 ) 50 μL로 겔 조각을 수화. 젤 조각을 완전히 덮으십시오.
- 수화 솔루션을 조심스럽게 제거하고 10 분 동안 아세토 니트릴 (CH 3 CN)로 겔 조각을 탈수하십시오. 조심스럽게 아세토 니트릴 용액을 제거하십시오.
- 수화에서 탈수까지 두 번 반복하십시오. 마지막으로 아세토 니트릴 용액을 제거하십시오.
참고 : 겔 실행 시간은 실험 목적에 따라 다릅니다. 장기간에 걸쳐 단백질을 잘 분리 할 수 있으므로 염색 된 특정 젤 금지추가 분석을 위해 ds를 잘라낼 수 있습니다. 단백질을 유지하고 오염 물질을 제거하는 것이 목적이라면, 짧은 시간이면 충분합니다.
- 6.6 MM DTT 솔루션의 500 μL를 추가하고 10 분 동안 겔 조각을 품어. DTT 솔루션을 제거하고 95 % ( V / V ) 아세토 니트릴 솔루션 500 μL로 겔 조각을 두 번 씻으십시오.
- 세척 후, 아세토 니트릴 용액을 제거하고 어둠 속에서 10 분 동안 55 mM iodoacetic acid (IAA) 용액 500 μL와 겔 조각을 품어 라.
- 배양 후, 용액을 제거하고 95 % ( v / v ) 아세토 니트릴 용액 500 μL로 겔 조각을 다시 씻으십시오. 젤 조각을 말리십시오.
- 소화 완충액 (50 MM NH 4 HCO 3 , 5 mM CaCl 2 및 6 ng / μL 트립신) 25 μL로 겔 조각을 완전히 삽입하고 트립신이 젤로 침투하도록 45 분 동안 얼음에 보관하십시오. 37 ° C에서 밤새 젤 조각을 품어 zymatic 소화.
- 1D - PAGE 젤을 실행 후, 고정 솔루션 (50 % ( V / V ) 메탄올과 10 % ( V / V ) 아세트산)에 겔을 1 시간 동안 고정하십시오. 부드럽게 흔들어 얼룩 용액 (0.1 % ( w / v ) Coomassie Brilliant Blue R-250, 50 % ( v / v ) 메탄올 및 10 % ( v / v ) 아세트산)에서 20 분 동안 젤을 염색하십시오. 탈염 용액 (40 % ( v / v ) 메탄올 및 10 % ( v)/ v) 아세트산)로 1 시간 동안 처리 하였다. 폐기 후 젤을 5 % ( v / v ) 아세트산에 보관하십시오.
- 펩타이드 정제
- 트립신 펩타이드를 추출하기 위해 소화 완충액과 맴돌이의 겔 조각에 50 mM NH 4 HCO 3 80 μL를 반복 첨가한다. 추출물을 수집하십시오. 50 % 80 μL (V / V) CH 3 CN, 5 % (v / v)의 포름산 (FA)로 두번 추출 단계를 반복한다.
참고 : 총 최종 추출물은 약 240 μL이어야합니다. - 진공 농축 또는 동결 건조하여 약 10 μL로 추출물을 풀 및 농축하고 0.1 % ( v / v ) 수성 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 수용액 25 μL를 첨가한다. 제조자의 프로토콜에 따라 샘플을 μ-C18 컬럼으로 탈색한다.
- 4 - 10 μL의 60 % ( w / v ) CH 3 CN 및 0.1 % ( v / v ) FA로 펩티드를 용출시킨다. 펩타이드를 동결 건조시키고 분석 할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 트립신 펩타이드를 추출하기 위해 소화 완충액과 맴돌이의 겔 조각에 50 mM NH 4 HCO 3 80 μL를 반복 첨가한다. 추출물을 수집하십시오. 50 % 80 μL (V / V) CH 3 CN, 5 % (v / v)의 포름산 (FA)로 두번 추출 단계를 반복한다.
- 나노 역상 액체 크로마토 그래피
참고 : 액체 크로마토 그래피 장비와 온라인으로 결합 된 질량 분석기로 LC-MS 분석을 수행하십시오. 이기구는 C18 컬럼 (2 μm 입자, 100Å 공극 크기, 50 μm x 15 cm 크기)을 갖추고 있어야합니다.- 용액 (2 % ( V / V ) CH 3 CN 및 0.1 % ( V / V ) FA) 16 μL에 동결 건조 펩티드를 Resuspend. C18 precolumn (3 μm의 입자 크기, 100 Å의 기공 크기, nanoviper 및 75 μm의 X 2 cm의 차원)에 5 μL / 분의 유속에서 펩타이드 솔루션 5 μL를 삽입하고로드합니다.
- 10.1.2. 300nL / min의 유속으로 95 분의 기울기를 사용하여 펩타이드를 분리합니다. 이 분리 구배 동안 5 분, 50 분 및 18 분에 각각 이동상 B를 4 %에서 10 %, 10 %에서 25 % 및 25 %에서 45 %로 증가시킵니다. 마지막으로, 1 분 안에 이동상 B를 95 %까지 급격히 증가시킵니다. 후각 95 분 분리 구배는 5 분에 4 %에서 95 %까지의 10 분 구배가 포함 된 고유의 헹굼 단계를 적용합니다.
주 : 이동상 A는 19.92 %의 H 2 O 80 % 99.9 % H 2 O, 0.1 % (v / v)의 FA 및 이동상 B이다 CH 3 CN, 0.08 % (V / V (/ V w) ) FA.
- 질량 분광 분석법
- 400에서 1,600 m / z 범위의 질량을 갖는 데이터 의존 모드에서 질량 분석기를 작동하십시오.
- 분열 스펙트럼을 생성하기 위해 MS1에서 최대 10 개의 가장 강한 이온을 선택하십시오. 해상도를 MS1의 경우 70,000, MS2의 경우 17,000, 자동 이득 제어 (AGC) 대상을 3,000,000 및 1,000,000 이온으로, 최대 이온 주입 시간 (IT)은 MS1의 경우 256 및 64ms로 설정하십시오 및 MS2를 각각 나타낸다.
- 가장 풍부한 이온의 반복 된 단편화를 피하기 위해 동적 인 제외를 10 초로 설정하십시오.
참고 : 여기서, 6 개 이상의 전하를 갖는 이온은 eMS2에 대해 xcluded.
- 정 성적 proteomics : 펩타이드 및 단백질 식별
- Peaks 스튜디오 소프트웨어 47 , 48 , 49 와 같은 소프트웨어를 사용하여 단편 스펙트럼을 분석하십시오.
참고 : NovoHMM 30 및 PepNovo 37 ( de novo sequencing) 및 SEQUEST 54 및 Mascot 55 ( 데이터베이스 검색 용)와 같은 기타 소프트웨어 패키지도 펩타이드 식별에 사용할 수 있습니다. - 동일한 질량 (<2 ppm 차이) 및 보유 시간 (<2 분)으로 스펙트럼을 결합하고 품질 임계 값이 0.65 이상인 스펙트럼 만 유지하여 모델링 할 분류 집합에 대한 Swiss-Prot 데이터베이스 (버전 : 2013 년 12 월)를 검색합니다. 식물 Arabidopsis thaliana . 다음 검색 매개 변수를 사용하십시오 : 몬의 사용을 통해 10 ppm의 전구 물질 질량 허용 오차동위 원소 질량; 20 mmu의 조각 질량 내성; 소화 효소로서 트립신 (trypsin)으로서 최대 2 개 분열 절단; 고정 된 변형으로서의 시스테인 카바 미도 메틸화; 메티오닌 산화를 변수 변경으로; 및 펩티드 당 최대 3 개의 가변적 인 번역 후 변형을 포함한다. 확인 후 FDR (False Discovery Rate) <5 %가 획득되도록 신뢰할 수있는 펩타이드 및 단백질 식별을위한 점수 임계 값을 수동으로 설정합니다.
- Peaks 스튜디오 소프트웨어 47 , 48 , 49 와 같은 소프트웨어를 사용하여 단편 스펙트럼을 분석하십시오.
- 정량적 프로테오믹스 : 질량 분석 데이터의 통계 분석
- proteomics 데이터의 라벨없는 정량을 위해 LC-MS ( 예 : Progenesis)를 사용하십시오.
참고 : MS1 펩티드 피크 영역 (또는 강도)은 질량에 따라 스튜디오 소프트웨어에 의해 확인 된 펩타이드와 연결되어 있으며 최대 허용 오차는 10ppm입니다.
참고 :이 소프트웨어는 모든 전하 상태의 피크 면적을 2 <+ 및 8 + . 정량적 데이터는 내부 스크립트 (PEAKS peptide identification)와 연결되어 있습니다 (최대 허용 오차는 10 ppm입니다). - 각 펩타이드의 평균 log2 배 변화 (CL / non-CL)를 계산하십시오. 독특한 펩티드의 fold-changes를 단백질별로 그룹화합니다.
참고 : 각 그룹에서 단백질의 최종 fold-change는 펩티드의 평균 fold-change와 같습니다. - 통계적 유의성을 평가하기 위해 각 그룹에 대해 Student 's t -test를 사용하여 p- 값을 계산합니다. R 소프트웨어 패키지 (버전 3.3.0)를 적용하여 Benjamini-Hochberg (BH) 방법을 사용하여 모든 그룹의 FDR에 대한 p- 값을 수정합니다.
- R 소프트웨어 패키지 (버전 3.3.0)와 호환되는 "보정"기능 패키지 (버전 1.7.2)를 사용하여 화산 플롯을 그립니다.
참고 : 여기에서 -log10 조정 p 값 (-log10 (adj. p 값))은 식별 된 모든 단백질의 log2 배 변화의 함수입니다. 단백질은log2 배의 변화가 2 이상인 경우 mRNA 결합 프로테옴에서 양성으로 판정된다.
- proteomics 데이터의 라벨없는 정량을 위해 LC-MS ( 예 : Progenesis)를 사용하십시오.
11. 확인 된 mRNA- 결합 Proteome의 카탈로그
- Gene Ontology (GO) 데이터베이스와 InterPro 데이터베이스를 통한 "family and domain"을 통해 "분자 기능과 생물학적 과정"항목을 기반으로 10 단계에서 확인 된 단백질을 3 가지 범주로 분류하십시오.
- 카테고리 I 또는 "Ribosomal proteins"은 검출 된 모든 리보솜 단백질을 포함하고 RNA와 상호 작용하거나 RNA 생물학에서 알려진 또는 알려지지 않은 기능과 결합하는 주석이 달린 단백질 도메인을 포함하는 카테고리 II의 단백질 또는 "주요 RBP"를 정의합니다 .
- 주석이 첨부 된 RNA 결합 도메인이없는 RNA 생물학에서 알려진 또는 알려지지 않은 기능을 가진 단백질이 카테고리 III 또는 "후보 RBPs"에 배치되면 I의 주석에 기반하여 카테고리 III의 효소를 정의합니다ntEnz 데이터베이스.
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Representative Results
우리는 세척 버퍼 2 ( 그림 1B )와 함께 세척 단계 4.3에서 CL 샘플의 비드 펠렛을 둘러싼 특징적인 후광을 관찰했습니다. 그것이 조사되지 않았지만,이 현상은 자성 포획 동안 가교 결합 된 mRNP 복합체가 비드 응집체와 간섭하여보다 확산 된 응집체가 형성되는 것으로 설명 될 수있다. 그것은 (T) (25)의 비드 포착 올리고 D 14 효과적이라는 것을 나타낸다.
비 CL 대조군과 CL 표본 모두에서 18S rRNA보다 유의하게 높은 UBQ10 기준 mRNA 수준이 도 1c에 제시되어 있다 . 이것은 poly (A) -tailed mRNA에만 결합 할 수있는 oligo-d (T) 25 비드의 포획으로 인해 용리액에서 mRNA가 풍부 해짐을 나타냅니다. 올리고 -d (T) 25 비드 포획의 효율은 추가로 suppRNase 처리 및 mRBP 농도 (단계 7) 후에도 1D에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 및은 염색법 (단계 8)에 의해 지시 하였다. 비 CL 대조구와 CL 표본 차선 사이의 단백질 밴드 패턴의 차이가 분명히 관찰 될 수 있으며, 비 CL 대조 샘플 레인에 존재하는 단백질 밴드는 RNase의 존재에 의해 설명 될 수있다. 이것은 CL 샘플에서 mRBPs의 강력한 농축을 설명합니다.
가교 결합의 효율은 UV 조사의 지속 시간을 변화시킴으로써 제어 될 수있다. 충분한 가교 결합은 있지만, 원형질체 손상 및 RNA 분해의 회피는 최적이다. 그림 1D 에서 모든 CL 샘플의 특정 단백질 밴드 패턴은 다른 UV 조사 시간 (1, 3, 5 분)을 비교할 때 얻어졌습니다. 동일한 자외선 강도 (0.00875W / cm 2 )에서, 가장 최적의 조건은 구별 할 수 없기 때문에 1 분 또는 3 분으로 나타났습니다단백질 밴드 강도. 더 긴 가교 시간 (5 분)으로 더 약한 밴드 강도가 관찰되었다. 가교 결합 기간이 짧으면 페트리 접시에서 원형질체를보다 쉽게 옮길 수 있고 수집 할 수 있다는 장점이 있기 때문에 1 분을 최적 조건으로 생각했습니다. 원형질은 접시 바닥에 붙어 있기 때문에 자외선을 조사하는 동안 페트리 접시의 바닥으로 빠르게 침전 될 수 있습니다. 이로 인해 UV 조사 시간이 길어지면 튜브를 수집하고 전달하기가 더 어려워집니다.
최적화 된 조건에 기초하여, 3 개의 생물학적 복제로부터의 단백질의 동정은 단계 9 및 10에서 기술 된 질적 및 양적 프로테오믹스에 의해 순차적으로 달성되었다. 정량적 프로테오믹스 ( 도 1E , 우측)에 의한 분석에서 총 341 개의 단백질 CL 샘플에서 확인되었으며, 그 중 36 개가 비 CL 대조군 및d CL 샘플에서 검출되었고, 단지 8 개의 단백질 만이 비 CL 대조 샘플에서 검출되었다. SDS-PAGE와 silver-staining 분석은 oligo-d (T) 단백질의 효율을 확인하는 좋은 도구라는 아이디어를 뒷받침하는 두 단백질 간의 식별 된 단백질 수의 엄청난 차이가 다른 단백질 밴드 패턴 ( 그림 1D ) 25 구슬 캡처. 정량적 프로테오믹스 ( 그림 1E , 왼쪽)에 의한 분석에서, 총 325 개의 단백질 (청색 및 녹색으로 착색 된)은 log2 배의 변화가 2보다 큰 것을 나타냈다. 이들 단백질 중에서, 100 개의 단백질 (청색) 값은 유의 수준보다 높습니다. 따라서 그들은 또한 긍정적 인 히트로 정의되었습니다. 또 다른 225 개의 단백질 (녹색)의 p- 값이 데이터 희박성 (data sparsity)으로 인해 유의 수준보다 낮은 0.05보다 컸다는 것이 주목할 만하다. 다른 말로하면, 펩티드 농도의 높은 가변성을 가진, 각 단백질에 대해 존재하는 낮은 펩타이드가 존재한다는 것이다es. 그러나, 이들 모두는 CL 샘플에서만 정 성적으로 검출 되었기 때문에 양성으로 간주되었다.
GO 및 InterPro 데이터베이스 50 (11 단계)에 따라이 325 개의 단백질을 범주 I (리보솜 단백질), 범주 II (주 RBP) 및 범주 III (후보 RBP) ( 그림 1F )로 분류했습니다. 카테고리 I에는 123 개의 리보솜 단백질이 있었고 카테고리 II에는 70 개의 주석이 달린 클래식 RBP가 관찰되었다. 분자 RNA 결합과 RNA 생물학 ( 그림 1F , 오른쪽)과 연결되어 있으며 전체 mRNA 결합 프로테옴의 약 38 %와 22 %를 차지하는 주석이 달린 대부분의 단백질을 포함하는이 두 범주는 최적화 된 mRNA 상호 작용의 높은 효율을 나타냅니다 포착. 마지막 40 % (132 후보 RBP)는 기존 RBD가 없기 때문에 카테고리 III에 분류되었습니다. 또한, 대부분의RNA 결합 및 RNA 생물학적 과정에서의 역할은 검증되지 않았다 ( 그림 1F , 왼쪽). 우리는이 카테고리의 단백질이 RNA 규정에서 새로운 기능을 나타낼 수 있다고 가정합니다.
그림 1 : Arabidopsis Leaf Mesophyll Protoplast의 mRNA 결합 단백질 발견을위한 최적화 된 방법의 순서도와 결과. ( A ) 전체 방법의 주요 단계는 1에서 11까지이다. 세포와 분자의 추정 과정은 사진과 만화로 설명된다. 각 단계에 대한 세부 사항은 의정서에 집중적으로 기술되어있다. ( B ) 세척 단계 4.3 동안 CL 샘플에서 비드 펠렛을 둘러싸고 있지만 비 CL 대조 샘플에서는 보이지 않는 후광이 관찰되었다. ( C ) 상대적 UBQ10 mRNA와 18S rRNA 레벨의 비교q는 CLR이 아닌 대조군에서, CL은 qRT-PCR (값은 평균 ± SD (n = 3), * 및 **는 p <0.05 및 <0.01)과 유의 한 차이가 있음. ( D ) 0.00875 W / cm 2 의 자외선 강도로 1, 3, 5 분 동안 연속파 UV 소스에 의해 조사 된 CL 샘플과 비교 된 비 CL 대조 샘플의 농축 된 단백질 용리액. ( E ) proteomics에 의한 mRNA- 결합 단백체의 동정. Progenesis 소프트웨어 패키지 (왼쪽)에 의해 수행 된 정량적 프로테오믹스에서 화산 플롯은 평균 log2 배 변화 (CL / non-CL) 및 관련 조정 된 P 값 (-log10 (adj. p 값))을 표시합니다. 모든 단백질. Peaks 소프트웨어 패키지 (오른쪽)에 의해 수행 된 정성 proteomics에서 샘플의 단백질은 벤 다이어그램에 설명되어 있습니다. 단백질의 양은 숫자로 나열되어 있습니다. 펩티드와 단백질 수준에 FDR는 5 %의 밑에있다. 밝은 갈색 프레임 안의 단백질 수는 양성으로 간주됩니다. (
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Discussion
우리는 성공적으로 효모 및 인간 세포를 위해 개발 된 mRNA 상호 작용 포획을 엽초 엽 원형 엽록체에 적용했다. 잎 초 필 세포는 식물 잎의 지상 조직의 주요 유형입니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 생체 환경에서 단백질을 발견하기 위해 생체 내 가교 결합을 사용한다는 것입니다.
이 프로토콜에서, 우리는 주로 최적의 실험 조건 (50) (예를 들어, 원형질체의 개수와 재료 UV 조사의 지속 시간을 시작으로 사용하기 위해)의 다수를 제시한다. CL 샘플에서 포획 된 단백질은 최소 10 7 개의 원형질체 (중간 규모)가 사용될 때 (단계 1.5.5) SDS-PAGE 및은 염색법으로 만 검출 될 수 있습니다. 농도가 낮 으면 SDS-PAGE에서 관찰 가능한 mRBP 패턴이 생성되지 않으므로 proteomics의 추가 분석에는 사용하지 않아야합니다. 실제로 10 7 개 이상의 세포를 사용합니다 ( 예 : 10 9 in대규모 실험)도 20있다. 실버 염색 분석 결과는 0.00875 W / 연속파 UV 소스에 의해 생성되는 강도 cm 2로 1 분간 UV 조사 최적 (도 1D)임을 시사한다. 임계 단계 ( 즉, mRNP 풀다운 및 올리고 -d (T) 25 비드에 의한 정제, 단계 4)에서의 높은 효율은 RT-qPCR,은 염색 및 MS 분석의 결과에 의해 뒷받침된다 ( 도 1C ; 1D 및 1E , 오른쪽). 질적 및 양적 proteomics의 조합은 비 CL 컨트롤과 CL 샘플 간의 중복 영역에서 양성 RBP를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다 ( 그림 1E ). 확인 된 단백질의 대부분은 이전에 데이터 세트에 주석이 달려 있지 않은 RBP였다 ( 그림 1F ). 우리는 범주 III에서 이전에 알려지지 않은 RNA 결합 단백질을 후보 RBP로 제시했다 <sup class = "xref"> 50 ( 그림 1F ). 후보 RBP의 결합 특이성을 탐색하려면 앞서 언급 한 CLIP 방법 23 과 같은 다른 방법을 사용해야합니다. CLIP 51 의 사용을 통해 RBP가 Arabidopsis 에서 표적 mRNA 전 사체를 조절하는 RBP의 결합 특이성을 조사한 한 가지 예가 Zhang et al ., 2015에서 발견 할 수있다. 또한 PAR-CLIP의 대안으로 수정 된 방법 인 photoactivatable- ribonucleoside-enhanced crosslinking (PAR-CL, 365-nm UV-A)은 또한 효모와 인간 세포에서 mRNA- 결합 된 프로테옴의 연구를 위해 이전에 권장되었다 14 , 23 . PAR-CL은 4Su를 필요로하는데, 이는 세포에 의해 흡수되어 RNA 대사 과정에서 초기 RNA에 통합되어 매우 반응성이있어 UV-A (365-nm) 조사 하에서 아미노산 52 와 공유 결합을 형성 할 수있다ation. 현재, 엽육 원형질체 (53)로 식물 세포 및 외인성 4sU의 효율적인 흡수에 4sU의 독성에 초점을 맞춘 연구는 없다. 그러나 기존의 CL (254-nm UV-C)와 PAR-CL (365 nm UV-A)를 식물에 사용하는 것이 가능해질 것으로 믿어 지는데, 이는 생리 학적으로 다양한 RBP의 발견과 검증에 기여할 것입니다 미래의 환경.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 기존 UV 램프가 장착 된 UV 가교 장치를 제공 한 Joris Winderickx 교수의 실험실을 인정합니다. KG는 KU Leuven 연구 기금이 지원하며 FWO 교부금 G065713N의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 0.8 M Mannitol | Sigma | M1902-500G | Primary isotonic Enzyme solution & MMg solution |
| 2 M KCl | MERCK | Art. 4935 | Primary isotonic Enzyme solution & W5 buffer |
| 0.2 M MES (pH 5.7) (4-morpholineethanesulfonic acid) |
Sigma-aldrich | M2933 | Primary isotonic Enzyme solution, W5 buffer & MMg solution, Filtration sterilization |
| Cellulase R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | CELLULASE “ONOZUKA” R-10, 10 g |
Final isotonic enzyme solution |
| Macerozyme R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | MACEROZYME R-10, 10g | Final isotonic enzyme solution |
| 10% (w/v) BSA (Bovine Serum Albumin) |
Sigma-aldrich | A7906-100G | Final isotonic enzyme solution & Filtration sterilization |
| 1 M CaCl2 | Chem-Lab NV | CL00.0317.1000 | Final isotonic enzyme solution, W5 buffer & Digestion buffer |
| 1 M NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | W5 buffer |
| 2 M MgCl2 | Sigma | M8266-100G | MMg solution |
| 1 M LiCl (Lithium Chloride) |
Acros | 199885000 | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2 & Low salt buffer |
| 5% (w/v) LiDS (Lithium Dodecyl Sulphate) |
Sigma-aldrich | L4632-25G | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1 & Filtration sterilization |
| 1 M DTT (Dithiothreitol) |
Thermo Fisher Scientific Wash buffer 1 & Wash buffer 2 |
307866 | Lysis/binding buffer, |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) | Acros & Fisher Chemical |
167620010 & H/1200/PB15 |
Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer & Elution buffer |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-aldrich | ED-500G | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer & Elution buffer |
| Tween 20 | MERCK | 8.22184.0500 | Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| 0.1 M NaOH | VWR PROLABO CHEMICALS | 28244.295 | Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| 1x PBS (pH 7.4) (Phosphate Buffered Saline) containing (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4) |
Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC |
S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230 |
Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| Proteinase K solution (2 μg/μL) | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Protein digestion |
| Loading dye | Invitrogen | LC5925 | SDS-PAGE |
| qPCR master mix | Promega | A6001 | qRT-PCR assay |
| RNase Cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | RNA digestion |
| Methanol | Sigma-aldrich | 322415 | Gel fixation and gel destaining |
| Acetic acid | Sigma-aldrich | 537020 | Gel fixation and gel destaining |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Fisher Scientific | 20278 | Gel staining |
| 1 M NH4HCO3 (Ammonium bicarbonate) |
Sigma-aldrich | 09830-500G | Gel hydration & Digestion buffer |
| CH3CN (Acetonitrile) |
Sigma-aldrich | 34851-100ML | Gel dehydration & Peptide dissolving solution |
| IAA (Iodoacetic acid) |
Sigma-aldrich | I4386-10G | Alkylating agent |
| TFA (Trifluoroacetic acid) |
Sigma-aldrich | 302031-10X1ML | Peptide dissolving solution |
| FA (Formic acid) |
Sigma-aldrich | 06554-5G | Peptide extraction |
| Trypsin solution (6 ng/μL) | Promega | V5280 | Digestion buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Soil | Peltracom | LP2D | Plant growth |
| Vermiculite 3 | Sibli AS | 05VERMICULIET | Plant growth |
| Petri dish (150 x 20 mm) | Sarstedt | 82.1184.500 | Carrier for protoplast suspension |
| 0.22 μm filter | Millipore | SE2M229104 | Homogenization of final isotonic enzyme solution |
| Razorblade | Agar Scientific | T585 | Rosette leaf strips |
| 35-75 μm nylon mesh | SEFAR NITEX | 74010 | Protoplast suspension filtration |
| 50 mL round bottom tubes | Sigma-aldrich | T1918-10EA | Carrier for protoplast suspension |
| Hemocytometer (Bürker hemocytometer) |
MARIENFELD | 650030 | Protoplast cell counting |
| UV crosslinking apparatus (HL-2000 HybriLinker) |
UVP, LLC | UVP95003101 | in vivo UV crosslinking |
| UV lamp (Sankyo-Denki G8T5) |
SANKYO DENKI |
SD G8T5 | in vivo UV crosslinking |
| 50 mL glass syringe | FORTUNA Optima | Z314560 | Homogenization of protoplast lysate |
| Narrow needle (0.9 x 25 mm) | Becton Dickinson microlance 3 | 2021-04 | Homogenization of protoplast lysate |
| Rotator Model L26 | Labinco BV | 26110912 | Sample incubation by rotating |
| Oligo-d(T)25 magnetic beads (5 mg/mL) |
New England BioLabs | S1419S | mRNPs and mRNAs binding and pull-down |
| Magnetic rack | Invitrogen | CS15000 | mRNPs and mRNAs binding and pull-down |
| Centrifugal filter units (Amicon Ultra-4 centrifugal filter units) |
EMD Millipore | UFC800308 | mRBP concentration |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | Silver-staining assay |
| RNA purification kit (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit) |
STRATEC Molecular | 1064100300 | RNA purification |
| Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | RNA quality and quantity |
| Real-Time PCR cycler (StepOne Real-Time PCR cycler) |
Thermo Fisher Scientific | 4376600 | cDNA quantification |
| µ-C18 columns (Millipore Zip Tip µ-C18 columns) |
Sigma-aldrich | 720046-960EA | Peptide purification |
| Mass spectrometer (Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer) |
Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Mass spectrometry-based proteomics |
| Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | Mass spectrometry-based proteomics |
| C18 column (Easy Spray Pepmap RSLC C18 column) |
Thermo Fisher Scientific | ES800 | Mass spectrometry-based proteomics |
| C18 precolumn (Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn) |
Thermo Fisher Scientific | 160321 | Mass spectrometry-based proteomics |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | Sequences | ||
| UBQ10 mRNA (Li et al., 2014) |
Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA |
||
| 18S rRNA (Durut et al., 2014) |
Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA |
References
- Jankowsky, E., Harris, M. E.
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
- Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
- Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
- Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
- Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
- Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, Database issue D301-D308 (2011).
- Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
- Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
- Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
- Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
- Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
- Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
- Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R.
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
- Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
- Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
- Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
- Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R.
- Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986 (2013).
- Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
- Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
- Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
- Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
- Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
- Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
- Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
- Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
- Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
- Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
- Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
- Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
- Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
- Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
- Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
- Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
- Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
- Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587 (2012).
- Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
- Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
- Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
- Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
- Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
