Summary
합성, 특성, 및 성인 zebrafish 조직학 분석 및 탐지 하는 Alzheimer의 질병 모델을 설정 하에 아 밀 로이드 독성을 생성 하기 위한 단위체 아 밀 로이드-β42 펩 티 드의 사출이이 프로토콜에 설명 합니다. 집계입니다.
Abstract
Alzheimer의 질병 (광고) 이며 독성 아 밀 로이드-β42의 어떤 축적에 펩 티 드 (Aβ42) 시 냅 스 변성, 염증, 신경 죽음에 이르게 하는 신경 퇴행 성 질병을 쇠 약하게 적자를 학습. 인간 신경 줄기/뿌리 세포 (NSPCs)와 감소 된 성체의 장애인된 증식 능력 때문에 광고의 경우 손실된 신경을 재생성 수 없습니다. 따라서, 효율적인 재생 치료 또한 확산을 강화 한다 neurogenic 용량의 NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) 재생 유기 체, 그리고 우리는 설계할 수 있는 기본적인 분자 프로그램을 배울 수 있는 광고를 태 클에 치료 접근입니다. 이러한 이유로, zebrafish에 광고와 같은 모델의 생성이 필요 했다. 우리의 방법론을 사용 하 여, 성인 zebrafish 뇌 조직 관통 기능 Aβ42 펩 티 드의 합성 파생 상품을 소개 하 고 질병 병 리 및 재생 응답 분석 수 있습니다 우리. 기존의 방법 또는 동물 모델에 장점은 그 zebrafish 수 우리를 가르쳐 어떻게 척추 뇌 수 자연스럽 게 재생성, 따라서 생 NSPCs를 대상으로 하 여 더 나은 인간의 신경 퇴행 성 질환을 치료 하는 데 도움이. 따라서, 성인 zebrafish 뇌에 아 밀 로이드 독성 모델의 신경 과학 및 임상 의학 분야에서 연구를 위한 새로운도 열 수 있습니다. 또한,이 방법의 간단한 실행 비용 효과적이 고 효율적인 실험 평가 대 한 수 있습니다. 이 원고는 합성 zebrafish 두뇌에 Aβ42 펩 티 드의 주입을 설명합니다.
Introduction
광고 뉴런의 손실에 의해 특징 만성 진보적인 질병 이며 대뇌 피 질1,2,3,,45synapses. 광고의 고전 neuropathological 특징 녹말 체 펩 티 드의 증 착 이며 형성 된 neurofibrillary tangles (NFTs)6. 치 패, 녹말 체 패로 알려진 뇌 실질5β 주름을 잡은 구조를 형성 하는 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드 구성 됩니다. 광고 환자에서 Aβ42의 축적 질병의 진행에는 초기 하 고 중요 한 역할을 하고있다. 광고의 시 냅 스 기능 장애, 장애인된 소성 및 신경 손실7,8,,910이벤트를 트리거합니다.
Teleost zebrafish의 두뇌의 줄기 세포가 소성11,12,13,,1415, 의 규칙을 공부 하는 우수한 모델 역할 16,,1718,,1920 및 광고21,22,23 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 다양 한 질병 ,24. 사용할 수 있는 실험 방법을19,20,25,26,,2728,29, 의 광대 한 배열을 때문 30 , 31이 학문은 유익 하 고 실현. Zebrafish는 CNS13,15,32,33,,3435,36,37, 보충 수 있습니다. 38, 일부 신경 손실19,39,40,41,,4243, 후에 활성화 하는 분자 프로그램을 사용 하 여 44. 따라서, zebrafish neurodegenerative 질병 모델 수립 척 추가 있는 두뇌에서 재생 능력 및 줄기 세포 생물학에 관한 주소 소설 질문을 도울 수 있다.
최근에, 우리는 합성 Aβ42 펩 티 드 (표 1)39를 주입 하 여 성인 zebrafish 뇌에 아 밀 로이드 독성 모델 개발. 이 주입 발생 neurodegeneration 고기 (예를 들어, 세포 죽음, microglial 활성화, 시 냅 스 변성 및 메모리 적자), 인간의 두뇌 병 리를 연상 시키는 그 zebrafish 도출을 위해 사용할 수 있습니다 나타내는 zebrafish 뇌에서 neurodegeneration, 펩 티 드 immunohistochemical stainings, 및 CNS 수 성인 zebrafish에 중생의 분자 메커니즘으로 검출 될 수 있다 Aβ4239식별. 이 프로토콜에서 사용 하는 cerebroventricular 주입 (CVMI) 방법27,39,,4546 제 브라 두뇌에 합성 녹말 체 펩 티 드의 주입 시연 모방 녹말 체 증 착 (그림 1). CVMI 주입 β 장 구조에 따라 집계 하 고 독성을 발휘 펩 티 드를 제공의 새로운 방법을 제공 합니다. 펩 티 드 전체 rostro 꼬리 축45를 따라 심 실 지역 대상으로 뇌에 걸쳐 균등 하 게 배포 됩니다. 또한이 메서드는 녹말 체 포함에 따라 성인 zebrafish 두뇌에 있는 NSPCs의 형태학 및 분자 응답을 분석 하기 위한 수 있습니다. 이러한 연구 결과 제공할 것입니다 우리에 게 통찰력 포유류에서 성공적인 뇌 수리에 대 한. 광고 같은 증상이 보충 손실 된 신경 세포의 기능 회복을 유도 후 성공적인 재생 응답의 필요한 분자 메커니즘을 이해 하 우리의 메서드를 사용할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 EU 지침에 의해 제안 된 표준 절차 (2010/63) 및 생물학 및 의학 (EuFishBioMed)에서 칼 스루 Insitute의 기술 (KIT)에서 물고기 모델에 대 한 유럽 사회. 여기 후 설명 하는 모든 메서드 (Landesdirektion 드레스덴; 문서 번호 TVV-52/2015) 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. Aβ42 펩 티 드의 준비
- 종합 펩 티 드 (표 1 참조) 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-와 표준 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 화학을 사용 하 여 tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) 자동화 된 단단한 단계 펩 티 드 합성기 52에 결합 시 약으로. 합성의 규모는 100 µmol.
- 단단한 단계 (0.2 m m o l/g의 용량 로드)로 자동된 펩타이드 합성기 Fmoc 보호 수 지의 500 mg와 로드. 녹은 Fmoc 보호 아미노산 농도 0.5 M에 로드에 필요한 볼륨 및 각 합성기에 대 한 계산으로.
참고: 계산 수 지 47 각 빌딩 블록의 5 배 초과로 두 번 각 보호 Fmoc 아미노산의 결합 수 있도록 만들어집니다. - 는 Dimethlyformamide (DMF)에 펩 티 드 합성에 필요한 시 약 분해. 예를 들어 비 반작용 하는 아미노 그룹 모자는 활성 제, HBTU, 0.48 M, 45 %v / v N-Methylmorpholine (NMM) (베이스), 그리고 5 %v / v 아세트산 무수 물 (상한 혼합물)의 농도에 준비.
- Trifluoroacetic 산 (TFA)의 구성 된 갓된 분열 혼합물에 교 반기를 사용 하 여 고체 지원 지속적으로 혼합 하 여 수 지에서 모든 펩 티 드를 쪼개 다: Triisopropylsilane(TIS): 물: 90 (v/v)에 Dithiothreitol (DTT): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v), 4 헤 사용 10 mL 100 µmol의 합성 규모.
- 100 mL 차가운 diethyl 에테르를 분열 혼합물을 추가 하 여 쪼개진된 제품 침전. 0.45 μ m의 기 공 크기와 소계 (PTFE) 필터와 20 mL 차가운 diethyl 에테르와 세척을 포함 하 여과 장치를 통과.
- 필터 종이에서 필터링 된 펩 티 드를 수집 하 고 디졸브 100mg 5 mL에 침전 된 펩타이드의 이온을 제거 된 증류수: 1: 1에서 이기.
- 구슬 크기 10 µ m의 다공성 폴리스 티 렌 divinylbenzene 열을 갖춘 반 대리점 HPLC에 역 상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 Purify.
- 전 열이 열 하 고 열 난방 장치를 사용 하 여 50 ° C에서 유지 합니다. 5%에서 100% 용 매 B 4 mL/분에서 25 분 이상으로 그라디언트를 적용 하 여 자동된 분수 수집기를 사용 하 여 모든 주요 분수 수집
참고: 용 매 A는 0.1 %TFA 물과 용 매 B에는 0.1 %TFA 이기 52. - 220에서 크로마 모니터링, 적절 한 봉우리를 수집 및 LC-씨를 사용 하 여 분석
- 전 열이 열 하 고 열 난방 장치를 사용 하 여 50 ° C에서 유지 합니다. 5%에서 100% 용 매 B 4 mL/분에서 25 분 이상으로 그라디언트를 적용 하 여 자동된 분수 수집기를 사용 하 여 모든 주요 분수 수집
- 확인 분석 역에 의해 순도 단계 초고 압력 액체 크로마토그래피 (UPLC)에서 220 nm UV 검출기 분석 C18 열 (구슬 크기 1.7 µ m)를 통해 샘플을 전달 하는 동안 모니터링 하 여. 질량 분석에 의해 펩 티 드 제품을 확인.
참고: 있는 UPLC 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)와 협력 하 여 사중 극 자 검출기를 결합 이다. - 무성 한 분말 0.052 mbar의 진공을 적용 하 여 둥근 바닥 플라스 크에 원하는 펩 티 드의 정확한 분수를 lyophilize. -80 ° C에서-78 ° C. 점에서 무기한 유지 냉동 장치에 진공 펌프를 커플.
- 이기의 혼합물에 1 mM의 재고 솔루션을 준비 하는 동결 건조 된 펩 티 드를 사용 하 여: DMF: 분석 학년 물 1:1: 1은 실험에 대 한. 이 솔루션으로는 펩 티 드가이 솔루션에서 집계 하지 않는 6 개월 이상 저장 될 수 있다.
2. 사출 혼합물의 준비
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나 2 HPO 4, 2mm KH 2 포 4, pH 7.4) 동결 건조 된 펩 티 드를 diluting에 대 한 준비.
- 는 PBS에서 20 µ M의 최종 농도에 펩 티 드를 분해. 이 솔루션 신선한 준비. 잘 혼합 하 고 주사까지 얼음에 저장 합니다. 솔루션에서 집계를 방지 하기 위해 30 분을 초과 하지 마십시오.
3. 마 취
- 준비 마 취약, 0.1% 에틸-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB)는 순환에서 일반 물고기 물에서의 재고 솔루션 시스템. 0.0025% (v/v)의 최종 농도에 anaesthetization 솔루션 준비.
- 시스템 물 5 l 운송 컨테이너에 그들의 탱크에서 물고기의 원하는 번호를 제거.
- 절반 채우기 플라스틱 페 트리 접시 (90mm) 40 mL 마 취약. 이 접시를 사용 하 여 주사.
- Opercular 운동 정지 했습니다 때까지 마 취약에 물고기를 품 어.
4. Cerebroventricular Microinjection
- 사출 기구 준비
- 준비 유리 주입 모세 혈관 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여 다음 매개 변수: 난방 사이클, 537, 당기 주기, 250, 속도, 1.5 s; 시간, 80 양
- 25 psi 압력 소스에 압력 설정을.
- 다음에 microinjector 매개 변수를 설정: 보류 20 psi 압력, 압력 추출 10 psi; 기간 값 2.5 제어 값 100 양
- 주입 솔루션 유리 모 세관을 로드합니다. Microinjection 홀더에 유리 모 세관을 삽입 합니다. 45 ° 분사 각도 조정.
참고: 참조 27 , 46에 설명 된 대로 찾을 수 있습니다 더 자세한 프로토콜.
- Anaesthetization 솔루션 (3.3 단계)로 가득한 장소 새로운 배양 접시에 생선.
- 집게와 주입에 대 한 동양 물고기 잡고.
- 생성 사용 하 여 30 G 바늘의 팁 두개골에 광섬유 tectum에 두 개의 측면 판 만나는 슬릿. 뇌 조직에는 팁을 삽입 하지 마십시오,이 출혈과 손상을 일으킬 것입니다. 27 , , 45 46 대 한 자세한 내용은 참조 하는 참조 하십시오.
- 슬릿 유리 모 세관 삽입.
- 바늘의 팁만을 사용 하 고 두개골을 통해 1 m m 이상 침투 하지 않습니다. 물고기를 잡고 유지 하 고 유리 절 개 사이트를 통해 모 세관의 끝을 삽입.
- 동양 유리 쪽으로 45 ° 각도로 telencephalon 모 세관의 끝. 솔루션의 1 µ L을 주입. 액체 주입 직후 분 광.
5. 복구
- 물고기 다시 복구 될 때까지 전송 컨테이너 장소. 최적의 수 질을 보장 하기 위해 정기적으로 순환 물고기 물에 컨테이너를 연결.
참고: 복구를 일반적으로 1 분 소요 됩니다. 오래 걸리면, 물고기는 마 취약에서 (이 실험에 의해 최적화가 필요한) 짧은 시간에 대 한 보관 해야 합니다.
6. 조직 준비 및 단면화
- 물고기를 희생 하기 전에 원하는 기간에 대 한 대기.
참고:이 실험 질문에 따라 달라 집니다. 아 밀 로이드 증 착 주입 후 1 일 일찍 볼 수 있습니다. - 윤리 규정에 따라 적절 한 방법을 사용 하 여 물고기를 희생 (예, 0.1 M MESAB 물고기 치료).
- 지적된 forcep 등 쪽 측에 사용 하 여 광섬유 tectum 위에 두개골을 자르면 고 메스를 사용 하 여 가슴 지 느 러 미 바로 뒤에 머리 부.
- 수정 2 %paraformaldehyde (PFA)를 사용 하 여 머리 하룻밤 플라스틱 튜브에 인당 PFA의 4 ° C. 사용 3 mL에 나사 뚜껑.
주의: PFA를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용. - Cryoprotection, decalcification, 0.1 m M에서 세 번 머리를 세척에 대 한 인산 염 버퍼 (pH 7.4), 20% sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 솔루션으로 그들을 전송 그리고 4에서 밤새 품 어 ° c. 수 지, 단면으로 조직을 포함
- 드라이 아이스 (블록을 고정 하려면 약 3-5 분)에 플라스틱 조직학 금형에 7.5 %gelatin/20% 자당 솔루션에 머리 고정. -80 ° C에서 샘플을 저장 하거나 (cryosectioning) 다음 단계로 진행.
- 12 µ m 두께 cryosections 설명된 28 , 42는 cryostat를 사용 하 여에 머리를 섹션. 유리 슬라이드에 직접 cryosections를 전송 및 장기 사용-20 ° C에서 저장.
7. Immunohistochemical 얼룩 및 현미경
참고: 습도 챔버에 모든 인큐베이션 단계를 수행 하십시오. 그리고, 모든 세척 단계 10 분.
- 건조 실 온에서 30 분 동안 섹션. 녹고, 후 PBS에 두 번, 한 번 PBSTx에 섹션을 세척 (0.03 %PBS-x-100).
- 품에서 4 ° C 하룻밤. 주 항 (안티-Aβ42 항 체; PBSTx에서 1: 500 희석)와 함께 다음 날, 세척 한 번 PBS에 PBSTx에 두 번.
- DAPI 함께 보조 항 (형광 결합 감지, 1: 500 희석)와 섹션을 품 어 (1 μ g/mL) 실 온에서 2 h에 대 한 PBSTx에.
- PBSTx에 세 번 세척입니다. 최종 세척 후 coverslip 100 μ 70% 글리세롤을 사용 하 여 슬라이드 마운트.
- 취득 형광 이미지 confocal 현미경을 사용 하 여 (예를 들어와 20 X PL APO 없음 0.7 목표 488 여기 범위와 표준 녹색 필터; 그림 2) 39.
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Representative Results
HPLC는 합성된 펩 티 드를 정화 하는 데 사용 되었다 그리고 질량 분석 순화 된 아 밀 로이드 β 펩 티 드를 특성화 하는 데 사용 되었습니다. HPLC 열 Aβ 펩 티 드의 분리를 개선 하는 50 ° C에가 열 되었다 그리고 모든 분수 수집 했다. 올바르게 합성된 펩 티 드를 식별 하기 위해 모든 분수에 대 한 질량 분광학 분석 수행 되었다. UPLC 크로마 화합물의 순도 보여준다. UPLC (즉, 충전 필요한 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 정확한 질량)에 대 한 피크를 나왔고 HPLC 분수 실험 (그림 2)에 대 한 추가 처리 했다.
다양 한 분 광 방법39,,4849를 사용 하 여 집계를 형성에서 펩 티 드의 기능을 평가할 수 있습니다 그리고 또한 잠복기 1 시간 이상 실 온에서 PBS에 펩 티 드, 여는 것입니다. 집계를 산출 한다. 이 경우에, 침전 및 큰 집계 솔루션에서 볼 수 합니다.
Cerebroventricular microinjection 후에 펩 티 드 두뇌와 양식 녹말 체 증언 (그림 3)에서 집계. 이러한 집계는 주로 혈관 주위 뿐만 아니라 세포내 증언으로 보인다. 이러한 집계는 조직에 아 밀 로이드 펩 티 드의 성공적인 축적의 표시.
그림 1: 펩 티 드 종합, 정화, 주입, 및 분석의 도식 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 기본 아 밀 로이드-β42 펩 티 드의. 질량 분석의 특성화 기본 아 밀 로이드-β42 펩 티 드 (A) 및 CPP 태그 아 밀 로이드-β42 펩 티 드 (TR-Aβ42; B). (C)의 정화, 크로마 토 그래프 기본, 그리고 TR Aβ42 펩 티 드에는 지역 압력 액체 크로마토그래피 (UPLC). X-axes 질량-전 비 (m/z) (A, B)와 분 (C)에 차입 시간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 녹말 체 증 착 성인 zebrafish 뇌 섹션에 주입 후 1 일의 Immunohistochemical 얼룩. Aβ42 녹색, 그리고 파랑에는 핵. 녹색 클러스터의 효율적인 Aβ42 집계를 나타냅니다. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림은 참조39에서 수정 되었습니다.
| 펩 티 드 | 펩 티 드 순서 | MW (g/mol) | |||
| AΒ42 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 4514.1 | |||
| TR AΒ42 | GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 5919.8 | |||
표 1: Aβ42와 TR Aβ42 펩 티 드 시퀀스.
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Discussion
녹말 체 펩 티 드 순서 변화 또는 다양 한 태그를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 스크램블된 녹말 체 펩 티 드 생성 될 수 있습니다, 그리고는 펩 티 드 펩 티 드 끝의 N-말단에 형광 태그와 함께 표시 하거나 캐리어 펩 티 드39태그 수 있습니다. 마찬가지로,이 프로토콜에 캐리어 펩타이드는 세포 관통 펩 티 드 TR 전송 화물 깊은 그 효과 때문에 뇌 조직39에입니다. 또한, 우리의 메서드는 주입 및 독성 집계50,51을 일으킬 수 있는 다양 한 펩 티 드의 분석에 대 한 수 있습니다. 따라서, 우리의 시스템 zebrafish 두뇌와 같은 독성 세포 효과 분석으로 독성 단백질의 수동 삽입에 대 한 다양 한 방법을 제공 합니다.
녹말 체 펩 티 드 집계 신속 하 게, 따라서, 주식 물 DMF 이기 솔루션에 보관 해야 합니다 그리고 PBS 유일한 0.5 주사 하기 전에 h와 혼합 한다. 솔루션에 큰 집계 경우 주입 솔루션만 10 분 주사 전에 준비 되어야 한다. 주입 효율은 일관 된 결과 대 한 중요 한 매개 변수입니다. 우리의 이전 정돈 종이46 좋고 일관 된 주입을 수행를 참조 하십시오. 없는 집계 주입 후 본 주입 방법 최적화 해야 합니다.
우리의 방법은 주입 될 분자의 크기 면에서 제한 됩니다. 그러나 우리는 이전 그 플라스 미드 또는 짧은 올리고 채택 될 수 있다 효율적으로 심 실 세포45,46에 의해, 깊은 뇌 조직으로 효율적인 배달에 대 한 큰 분자 (예, 항 체, 큰 보였다 단백질)를 사용할 수 없습니다. 또한, 질 성 분자 수 있습니다 쉽게 침투 하지 깊은 조직 때문에 이러한 분자 심 실 세포의 처음 몇 층에 의해 분리 된 것입니다.
Neurodegeneration의 마우스 모델의 생성 시간이 많이 걸리는 이며 이러한 모델의 유지 보수는 매우 비싼. 주입 방법은 우리의 독성 아 밀 로이드 증 착 및 neurodegeneration 빠른 모델입니다. 또한,는 zebrafish 포유류 모델에 비해 뛰어난 재생 능력 있으며 어떻게 척 추가 있는 두뇌에 초점을 맞추고 조사 neurodegeneration 확실히 빠른 분석 결과 시스템에서 혜택 후 재생 응답 탑재 수 있습니다. 제 브라입니다.
합성된 펩 티 드 및 그것의 순수성의 품질 실험의 성공을 위해 중요 하다. 이 품질을 보장 하기 위해, 합성된 펩 티 드 해야 합니다 수 완전히 특징 액체 크로마토그래피 및 질량 분광학을 사용 하 여. 또한, 원형이 색 성 및 집계 연구 설명39 건의 된다.
물고기 뇌에 주입은 일관 된 집계 및 병 적인 결과 보장 하기 위해 중요 한 단계 이다. 원하는 경우에 녹말 체 펩 티 드의 집계 및 클리어런스 역학을 분석 하는 종 적 연구를 수행할 수 있습니다. 우리는 동등 하 게 분배 하 고 뇌 조직으로 침투 캐리어 펩 티 드에 결합 하는 녹말 체 펩 티 드를 사용 합니다. Uncoupled 녹말 체 펩 티 드 또한 비슷한 결과 제공 하지만 배포 및 집계의 타임 라인은 다른39. 실험 목적에 따라 녹말 체 펩 티 드의 원하는 버전을 선택할 수 있습니다.
다른 조작 연구와 함께에서 우리의 방법의 사용에 대 한 큰 잠재력이 있다. 녹말 체 펩 티 드의 CVMI는 약물 치료 또는 질병 상태에 다양 한 분자의 시너지 효과 테스트 하는 다른 화합물의 주사와 결합할 수 있습니다. 궁극적으로, 우리의 신속 하 고 새로운 모델 쉽게 실험실에서 소규모 마약 검사 방법에 대 한 또한 사용할 수 있습니다.
성인 zebrafish 뇌의 아 밀 로이드 증 착을 모방 녹말 체 펩 티 드를 주입 하 우리의 수동 microinjection 메서드를 효율적으로 사용할 수 있습니다. 두뇌에 있는 녹말 체 증언 유도 세포 독성 효과 광고 병리학, 따라서 급성 신경 상태 표시 결과. 이 방법에 대 한 미래의 전망 zebrafish 두뇌에 있는 neuropathology 재생 응답 그를 공부 하 고 심각한 퇴행 성 모델에 그것을 활용 하는 것입니다. 이러한 이해는 새로운 치료 전략을 디자인 하는 중요 한 플랫폼을 제공할 것입니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 작품은 DZNE와 헬름홀츠 협회 (VH-NG-1021), CRTD에 의해 지원 되었다 TU 드레스덴 (FZ-111, 043_261518), 그리고 DFG (KI1524/6) (C.K.); 그리고에 의해 Leibniz 협회 (보고-2011-IPF-2) BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). 우리는 또한 감사 하 Ulrike 호프만 펩 티 드 종합을 위한 Nandini Asokan, Prayag Murawala, 그리고 엘리 다나카 절차를 촬영 하는 동안 도움 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
References
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